Терапия с помощью переноса генов означает воздействие на лежащую в основе генетическую причину болезни. основой служит доставка трансгена, так чтобы он компенсировал вызывающую болезнь мутацию у пациентов. Стратегия четкая, но клиническое воплощение идеи сложное. Её реализация обещает что генотерапия станет результатом разработки методов по доставке трансгенов в соотв. ткань и специфической экспрессии их в ней. Дальнейшими осложнениями являются внесение факторов, специфичных для редких болезней, и использование одноразового внесения терапевтического гена. Рассмотрим эксперименты по разработке генотерапии для Duchenne muscular dystrophy (DMD).

Функциональная генная копия может быть доставлена с помощью системы векторов ex vivo или in vivo. Ex vivo перенос генов вносит трансген в интересующие клетки, которые изолируются, поддерживаются и умножаются в культуре, после чего модифицированные клетки повторно вводят пациенту [1]. Напротив, методы in vivo включают перенос генов и редактирование генов за счет непосредственной доставки в тело системно или локально [1].

Спустя почти 50 лет с момента предположения Theodore Friedman о возможности терапевтической стратегии при болезнях человека [2], были начаты первые клинические испытания в 1990s. Вирусные вектора предоставили обндеживающую систему для доставки генов благодаря своей эффективности и специфичности. Однако, прежде было усвоено несколько жестких уроков о важности выбора вектора в ранних испытаниях. Много писали о трагическом случае с Jesse Gelsinger, 18-летнем юноше с дефицитом ornithine transcarbamylase, которого лечили с помощью аденовирусной терапии в 1999 и который впоследствии помер в результате массивной воспалительной реакции [3,4]. Этот случай подчеркнул важность оценки иммунной реакции пациента на используемый вектор. Сходным образом, случаи лейкемии после ретровирусами обеспечиваемой генотерапии, открыли необходимость учитывать проблемы техники безопасности, связанные с инсерционными мутациями, когда идентифицируются новые вирусные векторы [5-9].

Соотв., adeno-associated virus (AAV) векторы появились в качестве предпочтительного выбора для терапии с помощью системного переноса генов. AAV небольшой (25-nm) вирус семейства Parvoviridae, который состоит из непокрытой icosahedral капсидой (белковой оболочкой), содержащей геном из линейной одноцепочечной ДНК приблизительно в 4.7 Kb [10,11]. AAV векторы являются предпочтительной системой доставки для использования in vivo, т.к. они могут доставляться системно посредством кровообращения, являются не патогенными и могут инфицировать широкий круг делящихся и не делящихся клеток, а разные серотипы обладают дифференциальным тканевым тропизмом [10,12]. AAV вектора в основном вытеснили аденовирусы для in vivo доставки генов в огромном количестве клинических испытаний (>100 испытаний в США [13]). AAVs вызывают умеренную реакцию врожденного иммунитета и это является ключевым детерминантом для их благоприятного профиля надежности и низкой токсичности [14]. Более того, в противоположность ретровирусам, которые обладают риском онкогенеза, трансгены, переносимые AAV векторами редко интегрируют в хромосомы, тем самым снижаются шансы инсерционного мутагенеза, который обнаруживается при ретровирусных векторах [15-17]. Более того, рекомбинантные AAVs (rAAVs) существующие во многих серотипах, происходящих от разных видов и филогенетических clades, обладают варьирующим тканевым тропизмом и иммуногенными профилями [18].

Лечение с помощью генотерапии обладает революционным потенциалом для широкого круга болезней, включая гематологические, глазные, нейродегенеративные и тяжелые раковые опухоли [19]. В частности, генотерапия обладает потенциалом длительного воздействия при одноразовом введении для ранее неизлечимых болезней или тех, для которых существовало только симптоматическое и субоптимальное лечение. Несмотря на исторические затруднения и препятствия, недавно описаны примеры успешной разработки генотерапии, разрешенной US Food and Drug Administration (FDA), включая voretigene neparvovec-rzyl (Luxturna®) [20] и onasemnogene abeparvovec-xioi (Zolgensma®) [21]. Клинические исследования генной терапии продемонстрировали положительные исходы, включая улучшение мышечной функции, вехи развития и жизнеспособность при спинальной мышечной атрофии [22]; восстановление зрения у пациентов, которые были слепы; искоренение рака крови у пациентов, не реагирующих на др. типы лечения; коррекцию гемоглобинопатий и дефицита фактора коагуляции; и восстановление иммунной системы у детей, родившихся с первичным иммунодефицитом [19,23,24]. В частности, многие клинические исследования сообщают об успешных результатах генотерапии у пациентов с педиатрическими болезнями [25-28].

Базируясь на оценках осуществления клеточной терапии и генотерапии и клинических успехах таких продуктов, FDA предполагает появление более 200 investigational new drug (IND) в 2020, и одобрение 10 - 20 продуктов для клеточной и генотерапии к 2025 [29]. Ожидается рост разработок безопасных и эффективных клеточных и генных терапий [29-31].

Разработка лекарств это долгий и сложный путь, базирующийся на давно установленных принципах, многие из которых противодействуют природе генотерапии редких болезней. Соотв., разработка клинических образцов для генотерапии обнаруживает, что они отличаются от обычных способов лечения (Figure 1).

Figure 1. Clinical development for conventional small-molecule drugs vs. gene therapy.

На ранней фазе лабораторных исследований и исследований на животных исследовали прежде всего безопасность, эффективность, токсичность, фармакокинетику и фармакодинамику. Широкие наборы доз лекарств оценивали в in vitro и in vivo исследованиях и иногда на компьютерных моделях для установления взаимодействий между лекарством и мишенью. После IND оценки испытания Phase 1 были нацелены на определение безопасности и эффективности и на коррекцию доз для людей. Эквивалентная для человека доза (HED) обычно оказывалась наивысшей (учитывая поверхность области тела) из тестированных на животных токсилогически безопасных доз [32]. Часто HED снижали в 10 раз, создавая предел безопасности инициального дозирования у людей [32]. Обычно такие исследования проводили на небольших группах здоровых волонтеров при контролируемых условиях [33]. Если не возникало серьезных событий, то дозу увеличивали у следующей группы волонтеров, осуществляя оценки множественных доз. Во время этих инициальных исследований исследовали лекарственные параметры, такие как абсорбция, распределение, метаболизм и экскреция у людей. Phase 2 клинических испытаний затем проводили для оценки эффективности, безопасности и переносимости лекарств в более крупной популяции пациентов со специфической болезнью или состоянием [33]. Испытания Phase 3 осуществляли, чтобы установить безопасность и эффективность и превосходство над существующим стандартом лечения на больших популяциях пациентов и в целом использовали регуляторы для определения, действительно ли лекарство может быть разрешено к использованию на пациентах [33]. В целом этот процесс занимает приблизительно 12 лет от пре-клинической стадии до одобрения низкомолекулярных лекарств [34].

Эти примеры обычного клинического исследования низкомолекулярных лекарств сталкиваются с проблемами, когда применяются к редким болезням. Как было установлено Orphan Drug Act of 1983, лекарство приобретает orphan статус, если оно нацелено на лечение редких болезней или состояний, затрагивающих менее 200000 лиц в США [35]. Многие угрожающие жизни редкие болезни прежде всего затрагивают педиатрических пациентов, подчеркивая настоятельные требования и срочность разработки эффективного лекарства [36]. Популяции пациентов с чрезвычайно редкими болезнями, с гетерогенными болезнями и геогрфической разрозненностью создают затруднения в получении репрезентативной, гомогенной кагорты для клинических исследований [30]. Дополнительными усложнениями становятися проблемы, специфически ассоциированные с генотерапией. Напр., разработка антител к вектору после использования его для генотерапии выступает в качестве барьера для использования его для генотерапии и может быть исключен из участия в др. клинических испытаниях. Это имеет значение для обычной практики дозирования при использовании здоровых волонтеров, т.к. эти волонтеры могут мешать использованию генотерапии и будут появляться в будущем. Сходным образом, обычное исследование по увеличению доз следует перепроверять в контексте генотерапии, принимая во внимание, что пациенты, получающие дозы, ниже эффективных, могут всё ещё вызывать иммунитет, который будет блокировать будущие дозы вектора. Это будет затруднять определение оптимальной дозы в отношении эффективности и безопасности.

Данные пре-клинических исследований д. быть использованы для будущих потенциальных клинических исследований на человеке. Пре-клинические исследования д. быть нацелены на идентификацию эффективного диапазона доз на животных моделях, чтобы целенаправлено воздействовать на популяцию больных (напр., младенцев, детей и/или взрослых) путем идентификации минимальной эффективной дозы, оптимальной биологической дозы и максимально переносимой дозы [37]. Кроме того, необходимо установить оптимальные маршруты и время введения. Всесторонняя токсикологическая оценка, включая иммунологическую оценку вирусов и реакции трансгенных Т клеток, д. быть установлены инициальный профиль безопасности терапии. Необходимо предоставить важную информацию о потенциальных побочных эффектах и измерениях эффективности. Пре-клинические исследования д. включать тщательную оценку биораспределения для подтверждения эффективности трансдукции и доставки вектора в желательную ткань. Сходным образом, экспрессия трансгена также д. быть оценена в мишени и в тканях вне мишени, чтобы подтвердить желательную активность промотора так, где необходимо. Эффекты на молекулярные и клеточные функции д. быть проанализированы и там, где возможно, д. быть оценено влияние на общие функциональные состояния на животных моделях, оценены безопасность и тропизм векторов.

После пре-клинических исследований, давших обнадежившие результаты, д. быть разработаны клинические испытания для оценки всех аспектов безопасности и эффективности генотерапии, включая тщательный анализ и описание трансдукции вирусов, экспрессии трансгенов, локализации белка и клеточной стабильности и проведены любые функциональные измерения [38]. Пре-клинические исследования д. включать оценки всех иммунологических реакций. Должны быть оценены ткани мишени и измерены специфические клеточные функции, которые варьируют в зависимости от мишени и специфических подходов, это д. информировать состоянии болезни и желаемого действия терапии по переносу генов в ткань мишень.

DMD является редким, X-сцепленным, фатальным, дегенеративным нейромышечным заболеванием, затрагивающим 1 на 5000 новорожденных мальчиков во всем мире [39-42]. Оно вызывается мутациями в одном гене, DMD гене, приводящим к отсутствию функционального белка дистрофина. Т.к. критический компонент ассоциированного с дистрофином белкового комплекса (DAPC) в мышечных клетках, дистрофин является не только существенным для поддержания жесткости мышечных волокон [43], но и также для защиты от механических стрессов во время мышечных сокращений (Figure 2(a)) [44-47]. Дистрофин создает критическую структурную поддержку для сарколеммы мышечных клеток путем присоединения к специфическим регионам якорных точек, включая внутриклеточный актиновый цитоскелет, внеклеточный матрикс посредством DAPC и саму сарколемму. Отсутствие функционального дистрофинового белка приводит к потере сарколеммной структурной поддержки, неспособности к сборке DAPC и как следствие к снижению целостности саркролеммы. Это приводит в результате к повреждениям мышечной ткани, вызываемыми постоянными сокращениями, это в конечном итоге приводит к истощению компонентов, необходимых для репарации мышечных волокон и регенерации, в результате наступают необратимые потери мышечной функции [48]. Это затрагивает все скелетные мышцы, включая диафрагму, а также сердечную мышцу и функцию сердца.

Figure 2. Dystrophin protein. Adapted from [47] with permission from Oxford university press.

Принимая во внимание существенную роль дистрофина в защите скелетных и сердечных мышечных клеток от механических стрессов, пациенты с DMD переживают потерю критических функций в результате прогрессирующей дегенерации мышечной ткани с нарушениями двигательных функций (Figure 3) [49,50]. Обнаруживаются задержки с самого раннего возраста, такие как сидение, ходьба и речь, что помогает поставить диагноз между 3 и 5 годами. Увеличенные икроножные мышцы также наглядны в эти раннеие годы и обычно игнорируются или интерпретируются неправильно. На ранней амбулаторной фазе, в возрасте 5-7 лет, пациенты с DMD начинают обнаруживать симптомы, включая двигательные задержки и затруднения при стоянии. Моторные задержки сопровождаются функциональным спадом, ведущим к потере способности ходить после 10 лет, прикованностью к инвалидному креслу и неспособности к активности в повседневной жизни (напр.. способности самостоятельно принимать пищу после 10 лет. Кроме того, потеря функции диафрагмы может приводить к усилению респираторных нарушений, к сердечной дисфункции и нарушениям мышц, обеспечивающих дыхательную функцию в 10-12. В конечном счете прогрессирование болезни приводит кардиомиопатии, дыхательной недостаточности и преждевременной гибели [51]. Терапия с помощью переносе генов при DMD нацелена на лежащую в основе генетическую причину болезни путем специфического восстановления функционального дистрофина скелетных мышц, включая и диафрагму и сердце (Figure 3) за счет внесения функционального гена, чтобы компенсировать мутантный или отсутствующий ген дистрофина.

Figure 3. DMD disease progression.

Генотерапия вселяет новые надежды на лечение редких, моногенных болезней, таких как DMD. DMD хорошо подходит к переносу генов, поскольку эта болезнь вызывается мутацией одиночного гена, DMD. Кроме того, поскольку мышечные клетки являются не делящимися и долгоживущими, они обладают потенциалом, что однократное введение будет действовать длительное время и даже в течение всей оставшейся жизни. Фактически, пре-клинические и клинические исследования нейромышечных заболеваний указывают на отсутствие потери продолжительности действия [25,52-55]. Целью генотерапии при DMD является доставка гена, кодирующего функциональную версию дистрофина системно во все ткани мишени, затрагиваемые патологией DMD, и тем самым замедление прогрессирования болезни.

Несмотря на некоторые различия между подтипами AAVs в целом существуют предпочтительные безопасные профили по сравнению с аденовирусами и ретровирусами. Доступны многие подтипы AAV векторов они отличаются своими биореспределением и взаимодействием с врожденным и благоприобретенным иммунитетом. Оптимальное лечение DMD нуждается в выборе AAV вектора с высоким тропизмом к скелетным мышцам, диафрагме и сердечным мышцам. Чтобы достигать всех этих мышц, вектор д. применяться системно, т.е. вводиться в кровообращение. Для этого необходимы высокие дозы, для этого необходимо знание безопасного профиля вектора. Концентрация на скелетных и сердечных мышцах также требует выбора промотора, который экспрессируется на высоких уровнях в этих тканях и минимально в органах. не служащих мишенями. Использование ткань-специфических промоторов ограничивает экспрессию трансгена, однако, серотипы AAV, используемые клинически, обладают, кстати, существенным биораспределением в печени. Присутствие вирусной капсиды д. вызывать иммунную реакцию в некоторых случаях, которые будут проявляться в усилении печеночных энзимов [22,56]. Повышение печеночных энзимов можно устранять с помощью введения или увеличения глюкокортикоидов, таких как преднизолон, но тщательное отслеживание является критическим.

Хотя AAV векторы обладают многочисленными преимуществами, они обладают и существенными ограничениями при использовании их для лечения DMD. AAVs относительно небольшие и обладают ограниченной способностью к переносу материала, могут переносить только около 5kb ДНК [10,37]. Это не является препятствием для многих генов, но создает проблему для DMD. Ген дистрофина является одним из наиболее длинных в геноме человека, занимая 2.3 megabases, а размер кДНК для гена DMD (~14 kb) намного превосходит способность к упаковке AAV векторов. Поэтому необходимо преобразование трансгена дистрофина. Кроме того, в сравнении с AAV, трансген д. кодировать белок, который стабилен, функционален, правильно локализован в сарколемме и успешно восстанавливать DAPC, эффективно сохранять целостность клеток и способен в конечном итоге улучшать клиническую функцию.

Эти потребности неизбежно влекут за собой рациональную, специальную разработку подхода генотерапии для DMD. Это особенно касается тщательного отбора правильного вектора, промотора и трансгена, чтобы минимизировать проблемы техники безопасности и максимизировать терапевтические преимущества (Figure 4). Более того, терапия с помощью переноса генов д. оцениваться способом, который наилучшим образом представлят данные о пациенте, семье и клиницистах. Программа генотерапии DMD д. включать пошаговую оценку безопасности; доставку ДНК трансгена в клетки мишени (трансдукцию); экспрессию трансгенного белка; локализацию белка трансгена в соотв. ткани; функцию трансгена на молекулярном и клеточном уровне; и воздействие на клинические функции (Figure 5). Планомерный анализ этих данных позволил получить информацию о последовательных ступенях в клинической разработке генотерапии DMD. Напр., любое решение о повышении дозы д. базироваться на информации данных по трансдукции, т.к. низкие уровни трансдукции могут быть основной причиной увеличения дозы. Адекватная трансдукция, сопровождаемая низкими уровнями экспрессии, может указывать на проблемы, связанные с промотором и/или трансгеном и поэтому увеличение дозы будет неуместным до тех пор, пока не будет перестроена конструкция. Важно, чтобы все данные анализировались и публиковались, чтобы потенциальные участники клинического испытания могут принять обоснованные решения по оценке терапии прежде чем стать участниками клинического испытания, принимая во внимание, что повторное лечение с помощью др. AAV генотерапии будет невозможно в настоящее врем.

Figure 4. Promoter, transgene and vector.

Figure 5. . Assessments in gene therapy preclinical and clinical studies.

Наша конструкция (SRP-9001 micro-dystrophin) использует AAVrh74 в качестве вектора, мышечно-специфический промотор MHCK7 с регионом для кардиального энхансера и micro-dystrophin трансген, включающий spectrin повторы 1-3 и 24, и шарниры 1, 2 и 4 (Figure 2(c), Figure 4).

Выделенный в Nationwide Children's Hospital из резус обезьян [57], AAVrh74 был избран в качестве вектора доставки для терапии DMD путем переноса гена. Из семейства AAV линий 1-9, AAVrh74 обладает наибольшей гомологией с AAV8, с др. вирусом из того же филогенетического clade (означающим общее происхождение), но отличающимся свой трансдукционной эффективностью и seroprevalence характеристиками [58]. Использование вектора не человеческого происхождения, не используемого ранее для инфицирования людей, было предназначено для минимизации потенциальной предсуществующего иммунитета [59,60]. В самом деле, seroprevalence у AAVrh74 оказалось относительно низким (15-20%) популяции DMD пациентов, выбранных для первоначального клинического испытания (мальчики 4-7 лет) [61]. Исследование распространенности антител против ряда AAV серотипов обнаружило, что AAVrh74 гаходится среди типов с наинизшей величиной предсуществующего иммунитета [62]. Это позволяет использовать его у большинства пациентов.

Промотор MHCK7 был выбран, чтобы управлять экспрессией SRP-9001 микро-дистрофина. Регуляторный элемент состоит из α-myosin heavy chain (α-MHC) энхансера и muscle creatine kinase (MCK) энхансер/промоторного региона [63] (Figure 4). Этот промотор был выбран как наиболее подходящий для генотерапии DMD, принимая во внимание, что промотор MHCK7 индуцирует строгую экспрессию трансгена во всех скелетных мышцах, включая, критическую, диафрагму, а также сердечные мышцы, с минимальной экспрессией в тканях не мишенях. Кроме того, часть регуляторного элемента α-MHC энхансера драматически способствует экспрессии трансгена в сердце, а также управляет повышенной экспрессией в скелетных мышцах [63]. Наконец, MHCK7 промотор является space-efficient, включая необходимые минимальные элементы, которые особенно важны, учитывая размер упаковываемого материала в AAVs [63].

Необычайно крупный размер природного гена DMD требует стратегического, экономического дизайна трансгена, сопоставимого с AAVrh74 вектором. Решение заключается в конструкции укороченной версии гена дистрофина, наз. micro-dystrophin. Трансген SRP-9001 micro-dystrophin был разработан, чтобы кодировать только наиболее критические части белка дистрофина. Разумность использования микро-дистрофина базируется на естественно возникшем укороченном дистрофине у пациента с Becker muscular dystrophy (BMD) [37,64] (Figure 2(b)). BMD, подобно DMD, вызывается мутациями в гене DMD. Отличие заключается в том, что мутации в DMD приводят к неспособности продуцировать существенные количества функционального дистрофина, тогда как мутации при BMD продуцируют укороченные, частично функциональные белки дистрофина. Тяжесть BMD может варьировать драматически , но пациент в этом случае обнаруживает очень умеренную dystrophinopathy, несмотря на тот факт, что его дистрофин содержит лишь половину от нормального [64]. Фактически, мужчина сохраняет способность ходить и в свои 60, а мальчики с той же самой мутацией также страдают умеренно с тренингом с отягощением в анамнезе. Дистрофин у этих пациентов сохраняет критические ядерные регионы на N-конце для актина, на C-дистальном конце для DAPC, и в R1-R3 регионе, который, как известно взаимодействует непосредственно с сарколеммой [47]. Центральная часть дистрофина отсутствует и ирчно не является критической для поддержания большей части функции у этих пациентов.

Трансген SRP-9001 micro-dystrophin , использованный нами был моделирован. Трансген SRP-9001 micro-dystrophin был ещё больше укорочен путем удаления дополнительного центрального домена, но три критические якорные регионы сохранены. Три шарнирных домена также включены для поддержания молекулярной гибкости [65]. Дополнительным принципом дизайна стала минимизация количества неестественных соединений, чтобы снижить потенциал белковой нестабильности и создание иммуногенных пептидов. SRP-9001 micro-dystrophin имеет только одно из таких соединений. Полученный в результате SRP-9001 micro-dystrophin сохраняет высокую функциональность, оставаясь достаточно компактным, чтобы подходить для AAV вектора (Figure 2(c)). Пре-клинические исследования с SRP-9001на mdx мышиной модели DMD продемонстрировали безопасность и эффективность, проявившиеся в заметном улучшении гистологической картины (фиброз и нормализация размера волокон), снижение creatine kinase количества и функции (specific force and resistance to contraction-induced injury in the tibialis anterior and diaphragm) [66].

В наших первоначальных испытаниях (ClinicalTrials.gov NCT03375164 и NCT03769116), мы были сфокусированы на 4- 7-летних мальчиках. Эта популяция соответствует возрасту, когда у большинства пациентов диагностируется DMD. Более того, принимая во внимание, что дегенерация мышц в основном находится на ранних стадиях в этом возрасте [67-71], больше мышц можно сохранить с помощью лечения. Некоторые мальчики а этом возрасте могут прогрессировать по функциональным оценкам, хотя и с замедленной скоростью [49]; снижение функциональных характеристик происходит в возрасте 7 лет и выше и некоторые могут совершать переход в ходе исследования. Потенциальные пределы функционального статуса нуждаются в тщательных измерениях результатов и в определении ряда размеров для определения эффектов от лечения по разным траекториям.

Лечение с помощью стабильной дозы кортикостероидов, по крайней мере, в течение 30 дней перед генотерапией является ещё одним критическим добавлением в нашем исследовании (ClinicalTrials.gov NCT03375164 and NCT03769116). Помимо супрессии иммунной реакции таким воздействием, стероиды могут также обеспечивать определенную степень функциональной пользы [72]. Поэтому важно нормализовать лечение кортикостероидами у всех пациентов, участвующих в исследовании. Тип мутации DMD также представляет собой др. важный добавочный критерий (ClinicalTrials.gov NCT03375164 и NCT03769116). В частности, пациенты со сдвигом рамки считывания (делеция или дупликация) или мутацией преждевременного стоп кодона между экзонами 18 - 58 гена DMD были включены в исследование. Ген микро-дистрофина не кодируется с помощью этих экзонов и этот консервативный промежуток используется для минимизации потенциальных иммунных реакций SRP-9001 белка микро-дистрофина в этом первом испытании [73]. Однако, генотерапия с помощью микро-дистрофина одинаково пригодна для всех мутаций DMD и предполагается широкое использование этих критериев в дальнейших исследованиях.

Ключевым критерием отказа стали титры антител anti-AAVrh74 выше 1:400, порог идентифицированный в пре-клинических исследованиях на не человеко-образных приматах [74,75]. Он был использован, чтобы минимизировать потенциал с помощью очистки или нейтрализации и предупреждения мышечной трансдукции.

План предстоящих исследований предполагает расширение критериев в смысле расширения возрастных пределов и типов мутаций гена DMD. Планируется также включить пациентов, неспособных ходить, принимая во внимание, что терапия с переносом гена микро-дистрофина обладает потенциалом сохранения мышечной, респираторной и кардиальной функций на всех стадиях DMD.

В нашей программе мы также включили контрольную плацебо группу (ClinicalTrials.gov NCT03769116) и это вызывало определенное беспокойство у пациентов и лечащих врачей. Принимая во внимание прогрессирующую природу DMD, и срочную необходимость быстрого лечения, отсутствие контрольной группы делает оценку клинического эффекта менее очевидной и снижает оценку лечения. Важно, что все пациенты из группы с плацебо в нашем испытании получают возможность перехода в испытания с открытой меткой и к получению в конечном итоге лечения. (Figure 5)