Duchenne muscular dystrophy (DMD) представляет собой наиболее частую наследственную миопатию у детей, приводящей к прогрессирующей дегенерации и слабости мышц и к преждевременной гибели из-за респираторной и сердечной недостаточности. Огромное большинство пациентов несет мутацию сдвига рамки считывания в гене DMD, кодирующем дистрофин, которые представляют собой в основном делеции экзонов^3,4. Расположенный на X хромосоме DMD обусловливает болезнь у 1 на 3500-5000 новорожденных мальчиков⁵. Антисмысловыми олигонуклеотидами обусловленный пропуск экзонов, имеющий целью изменить рамку считывания DMD транскриптов⁶, уже был опробован в клинических испытаниях^7,8. Однако, хотя антисмысловые олигонуклеотиды первоначально эффективные зависимым от дозы способом⁶ - но они обнаруживают лишь временную и ограниченную эффективность на экспрессию DMD⁹. Стратегии редактирования генов, базирующиеся на эндонуклеазах, более эффективны и вызывают устойчивую коррекцию генома, как было показано на mdx модельных мышах^10-14. Недавно внутривенные (i.v.) введения adeno-associated virus 9 (AAV9), доставляющего компоненты CRISPR-Cas9, у DMD модельных гончих (с дефицитом экзона 50 ) вызывали успешное восстановление экспрессии укороченного дистрофина в разных мышцах. включая сердце¹⁵. Однако, функциональные данные пока не опубликованы.

Мы получили DMD модельных свиней, у которых отсутствовал экзон 52 (ref. 1), это приводило к полной потере экспрессии дистрофина (Fig. 1a и Методы). Во-первых, мы оценивали, может ли локальное воздействие Cas9 и подобранной guide RNAs (gRNAs) целенаправленно воздействовать на экзон 51 (Extended Data Fig. 1a-c), индуцируя экспрессию укороченного, но стабильного дистрофина in vivo (Fig. 1a). Свинкам в возрасте 10-14 дней внутримышечно вводили с одной стороны в переднюю и заднюю конечность пары из intein-split Streptococcus pyogenes Cas9 (ref. 2) и gRNA - кодируемые вирусными частицами (AAV9-Cas9-gE51; 2 х 10¹³ viral particles per kg (vp kg^-1) каждая) (Extended Data Fig. 1d-f). Спустя 6 недель гистологический анализ выявил восстановление располагающегося на мембранах дистрофина в областях инъекции и благодаря текучести вектора на низких уровнях на противоположных конечностях. Успешная элиминация экзона 51 и экспрессия DMDΔ51-52 были подтверждены на уровне генома, транскриптов и белка (Fig. 1b-d and Extended Data Fig. 2a), хотя полная согласованность не была достигнута из-за изменчивости выборок. Анализ с помощью масс-спектрометрии (Supplementary Fig. 1a-c) леченной мышечной ткани показал частичную нормализацию белков, регуляция которых обычно нарушена при DMD (Fig. 1e), при этом некоторые, связанные с фиброзом белки, значительно уменьшались в количестве (Supplementary Fig. 2a). Анализ принципиальных компонентов протеома подтвердил, что глобальный белковый профиль мышц. в которые был инъецирован AAV9-Cas9-gE51, сильно напоминают таковой у здоровых животных, чем у DMD (Fig. 1f).



Fig. 1: Genome editing of DMD?52 pigs by Cas9-mediated exon 51 excision.

a, Schematic of gene editing in DMDΔ52 pigs. Loss of exon 52 of the DMD gene (?E52) leads to an out-of-frame mutation with a premature stop codon, preventing protein translation. Cas9-mediated excision of exon 51 (ΔE51-52) corrects the reading frame, resulting in translation of an internally truncated but functional protein. Out-of-frame exons are illustrated in gray. b, Immunofluorescence staining for dystrophin expression in the indicated muscles (quadriceps = musculus quadriceps) in wild-type (WT) and DMDΔ52 (DMD) pigs at the injection sites either after i.m. AAV9-Cas9-gE51 treatment (2 х 10¹³ virus particles per kg = vp kg^-1) or after i.v. treatment with 2 x 10¹³ vp kg^-1 (low dose) or 2 x 10¹⁴ vp kg^-1 (high dose), representative of nine images collected in n = 3 independent experiments per group. Scale bars: 200 µm. c, Levels of WT, mutated DMD (ΔE52) and edited DMD (ΔE51-52) in WT limb muscle or in the indicated muscles of DMDΔ52 pigs treated with i.m. or high-dose i.v. G2-AAV9-Cas9-gE51, as assessed by RT-PCR, representative of three technical replicates. Percentages indicate the expression level of the corrected transcript (ΔE51-52) relative to total transcript (Δ52 + ΔE51-52). C.l., contralateral; inj., injected. d, Immunoblotting for dystrophin (Dys) in extracts from WT quadriceps at the indicated concentrations, DMD untreated (unt.) quadriceps, and the indicated muscles of DMD pigs after either i.m. or i.v. AAV9-Cas9-gE51 treatment. The percentages indicate the expression of Dys protein relative that for the WT. Dys levels were normalized to GAPDH, which was used as a loading control. The results are representative of three independent experiments. e, Unsupervised hierarchical clustering of normalized label-free quantification intensity values for skeletal muscle samples of WT, i.m. injected DMD and untreated DMD pigs. The color code indicates z-score-normalized expression values. f, Principal component analysis of proteins isolated from biceps and triceps muscles from the WT, untreated and i.m. treated DMD pigs (n = 2 animals per group) presented in e. Each symbol represents an individual sample (n = 4 per group). The percentage of variance explained by each component is indicated. g,h, Representative data from 24-h behavioral observation of a single WT, DMD untreated and DMD high-dose i.v. treated pig (g) and quantification of the total standing time per pig for the WT (n = 4), DMD (n = 4) and DMD high-dose i.v. treated pigs (n = 5). The P values were determined by one-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test (F = 9.819; d.f. = 10). i, Serum creatine kinase levels of WT pigs (n = 4) and DMD pigs either untreated (n = 3) or after i.m. injection of AAV9-Cas9-gE51 (n = 4) or high-dose i.v. treatment with G2-AAV9-Cas9-gE51 (n = 3). The P values were determined by one-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test (F = 9.986; d.f. = 10). In h and i, means ± s.e.m. are shown. Source data are available for c, d, h and i.

Диафрагма и сердце - две мышцы, вносящие существенный вклад в смертность в смертность пациентов с DMD^16,17 - оказались не затронутыми при инъекциях в конечности (Fig. 1b). Мы собираемся трансдуцировать эти органы с помощью внутривенных инъекций AAV9-Cas9-gE51, покрытых оболочками generation 2 polyamidoamine (G2-PAMAM) наночастиц, чтобы повысить тропизм к мышцам вектора без усиления токсичности (Supplementary Figs. 3a-c and 4 and Supplementary Table 1)^18,19. В противовес низкой дозе (1-2 х 10¹³ vp kg^-1, покрытых G2-AAV9-Cas9-gE51), которые спорадически трансдуцируют скелетные мышцы (Fig. 1b), высокая доза (2 х 10¹⁴ vp kg^-1 each) из G2-AAV9-Cas9-gE51 делает возможной экспрессию дистрофинового белка в скелетных мышцах, диафрагме и сердце (Fig. 1b,d and Extended Data Fig. 2b-d) после самосборки обеих половинок intein-carrying Cas9 (Extended Data Fig. 2e). Соотв., высокая доза при внутривенном введении удлиняла время, затрачиваемое животными для удержания прямого положения (upright position) (Fig. 1g,h) и обнаруживала тенденцию ослаблять сильно повышенные уровни creatine kinase (указывая на меньший распад мышц; Fig. 1i). Не выявлено мутаций в 5 наиболее предсказуемых местах сайтах вне мишени с помощью глубокого секвенирования (Extended Data Fig. 3). В регионах мишенях indels не обнаруживали конкордантных альтераций в выборках после лечения. Средняя частота альтераций составляла 0.01% (s.d.: 0.03), которые лежат на уровне фоновых ошибок ДНК секвенатора с максимумом ошибок секвенирования в 0.1%. Из-за ограниченного количества животных мы не изучали действие AAV9-Cas9 без gRNAs. Мы также не смогли исключить, что присутствие Cas9 в миоцитах^20,21 может потенциально вызывать большинство эффектов вне мишеней и иммунные реакции^22,23 после периода наблюдения в 3-4 мес.

Отсутствие дистрофина в DMDΔ52 мышцах вызывает коллапс dystrophin-associated glycoprotein complex (DGC)²⁴. Локальные внутримышечные или высокие дозы внутривенного введения приводили к повышенным уровням связанных с клеточными мембранами γ-sarcoglycan и β-dystrogylcan и к восстановлению DGC (Extended Data Fig. 4a-c). Дальнейшие структурны оценки скелетных мышц показали, что экспрессия связанного с мембранами DMDΔ51-52 достоверно снижает появление округлых миофибрилл с централизованным расположением ядер (Fig. 2a-c). После применения G2-AAV9-Cas9-gE51 улучшается структура скелетных мышц, указывая на уменьшение потери капилляров, а также снижение инфильтрации одноядерными клетками и интерстициального фиброза (Fig. 2d-g and Supplementary Fig. 2a,b). Соотв., увеличивается амплитуда мышечного сокращения (twitch) и сила тонических судорог, указывая на функциональное улучшение после высокой дозы воздействия G2-AAV9-Cas9-gE51 (Fig. 2h,i).



Fig. 2: Genome editing of DMD?52 restores the structure and function of diseased skeletal muscle.

a, Wheat germ agglutinin (WGA) staining (red) of cell borders and DNA labeling (blue) in quadriceps muscles of WT pigs and DMD pigs untreated or treated with high-dose i.v. G2-AAV9-Cas9-gE51. The results are representative of nine images collected from three pigs per group. Scale bars: 25 µm. b, Minimum diameter of cross-sectional fibers in untreated (unt.) pigs with DMD (n = 406 fibers; n = 3 pigs) and pigs with DMD treated i.m. with G2-AAV9-Cas9-gE51 (n = 641 fibers; n = 2 pigs). The dot plots show all data points, as well as median values (dashed lines) and the quartiles (solid lines). The P value was determined by unpaired two-tailed t-test (t = 3.212; d.f. = 1,045). c, Percentage of fibers with centralized nuclei in skeletal muscle samples from the biceps and quadriceps muscles, diaphragm and longissimus dorsi of WT pigs (biceps: n = 2; quadriceps, diaphragm and longissimus dorsi: n = 5), untreated pigs with DMD (biceps and quadriceps: n = 2; diaphragm and longissimus dorsi: n = 5), and i.m. (biceps and quadriceps: n = 7; diaphragm and longissimus dorsi: n = 5) or high-dose i.v. treated pigs with DMD (biceps and quadriceps: n = 4; diaphragm and longissimus dorsi: n = 2). n = 2 animals per group. The P?values were determined by two-way ANOVA with Tukey's multiple comparison test (F = 219.3; d.f. = 51). d, Density of CD31+ capillaries in quadriceps muscles of WT, untreated DMD and high-dose i.v. treated DMD pigs (n = 5 quadriceps sections from n = 3 animals). The P values were determined by one-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test (F = 8.228; d.f. = 12). e, Quantification of CD14+ cells in skeletal muscle tissue of WT, untreated DMD and high-dose i.v. treated DMD pigs (n = 3 quadriceps sections for WT and untreated DMD; n = 5 sections for high-dose i.v. treated DMD; from n = 3 animals per group). The P values were determined by one-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test (F = 7.610; d.f. = 8). f, Sirius Red staining showing the level of interstitial fibrosis in the peripheral muscle and diaphragm of WT, untreated DMD and low- or high-dose i.v. treated DMD pigs. The results are representative of ten sections collected in three independent experiments. Scale bars: 50?µm. g, Percentage of fibrosis in the diaphragm, quadriceps and biceps of untreated DMD (n = 3) and high-dose i.v. treated DMD pigs (n = 3). The P values were determined by two-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test (F = 238; d.f. = 23). h, Twitch amplitude after common peroneal nerve stimulation (see Methods) in WT (n = 41 traces in n = 3 pigs), untreated DMD (n = 138 traces in n = 3 pigs) and low- (n = 30 traces in n = 2 pigs) or high-dose (n = 29 traces in n = 3 pigs) i.v. treated DMD pigs. The P values were determined by one-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test (F = 11,241; d.f. = 234). i, Tetanic contraction after 1.5 s common peroneal nerve stimulation at 50?Hz in WT, untreated DMD and i.v. treated DMD pigs. The results are representative of three independent experiments. In c-e, g and h, means ± s.e.m. are shown. Source data are available for b-e, g and h.

DMDΔ52 у модельных свиней приводит к высокой смертности: 61.6% (45/73) больных самцов погибает в течение первой недели после рождения и ни один не живет дольше 105 дней . Лечение G2-AAV9-Cas9-gE51 повышает максимум выживаемости до 136 дней (Fig. 3a). Анализ видео показал возникновение внезапной сердечной гибели у не леченных DMDΔ52 свиней (Supplementary Video 1). Поэтому мы исследовали глобальную функцию и arrhythmogenicity сердец DMD. Ангиография левого желудочка показала снижение фракции выброса (ejection) у DMDΔ52 животных по сравнению с диким контролем. Это не достоверно ослабляется при системном введении G2-AAV9-Cas9-gE51 (P = 0.08; Fig. 3b). Скорости контракции и реляксации (dP/dtmax and dP/dtmin, где P давление, а t время) не обнаруживали достоверных отличий между группами (Fig. 3b), что, по-видимому, обусловлено умеренными уровнями экспрессии дистрофина (Fig. 3c and Extended Data Fig. 2d). Не обнаружено явных признаков недостаточности сердца (напр., pleural effusion или pulmonary edema) при изучении патологами DMDΔ52 животных, указывая тем самым на злокачественную аритмию как первичную причину гибели. В самом деле, детальное электрофизиологическое картирование (Extended Data Fig. 5a) показало снижение амплитуды напряжения (Fig. 3d and Extended Data Fig. 5b) в желудочках DMDΔ52 свиней по сравнению с сердцами дикого типа, это соответствовало увеличению области низкого напряжения (<1.3 mV) (Extended Data Fig. 5c). SТ.к. низкое напряжение может указывать на фиброз сердца²⁵, поэтому далее мы исследовали левый желудочек гистологически и выявили обширные фибротические регионы в не леченных сердцах DMDΔ52, тогда как высокие дозы при внутривенном введении G2-AAV9-Cas9-gE51 ограничивали область низкого напряжения (Extended Data Fig. 5b,c) , также как фибротическую дегенерацию (Fig. 3e and Supplementary Fig. 2c).



Fig. 3: Genome editing of DMD?52 improves survival and reduces cardiac arrhythmogenic vulnerability.

a, Kaplan-Meier curve of the survival time of untreated DMD (n = 13) and high-dose i.v. G2-AAV9-Cas9-gE51-treated DMD (n = 7) pigs (Mantel-Cox test, P = 0.032). b, Left: ejection fraction (EF) of WT (n = 3), untreated DMD (n = 3) and i.v. treated DMD (n = 4) pigs. Statistical significance was determined by one-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test (F = 10.53; d.f. = 7). Middle and right: dP/dtmax and dP/dtmin, respectively, of WT (n = 3), untreated DMD (n = 3) and high-dose i.v. treated DMD (n = 4) pigs. c, Immunoblotting for Dys in heart extracts (A, atrium; LV, left ventricle) from a WT pig at the indicated extract concentrations, an untreated DMD pig and four different high-dose i.v. treated DMD pigs. The results are representative of three replicates. Percentages indicate the level of Dys protein relative to that of the WT based on the standard curve obtained by loading the indicated amounts of WT extract. Dys levels were normalized to GAPDH, which was used as a loading control. d, High-resolution electrophysiological mapping indicating the areas of normal excitation amplitude (>1.3 mV; violet), low excitation amplitude (<1.3 mV; yellow to green) or scar (<0.3 mV; red) in WT (n = 3), untreated DMD (n = 2) and i.v. treated DMD pigs (n = 3; see also Extended Data Fig. 5a-c). Insets indicate the angulation of the detection plane (front or rear for DMD untreated and DMD high-dose i.v.; 45° right and left for WT). In the displayed voltage maps, the angulation of the detection plane with respect to the frontal plane is indicated by a pig cartoon (rendered from the model provided by http://www.cadnav.com). e, Top: Sirius Red staining showing the levels of interstitial fibrosis in equivalent apical regions of WT, untreated DMD and i.v. treated DMD hearts. The results are representative of ten sections collected in three pigs per group. Scale bars: 200 µm. Bottom: corresponding quantification of the percentage of fibrosis (all n = 5). The P value was determined by unpaired two-tailed t-test (t = 7.619; d.f. = 8). f, Exemplary single-cell calcium transients in myocardial slices (loaded with Fluo-4-AM) from WT (n = 3), untreated DMD (n = 2) and i.v. treated DMD pig hearts (n = 2). g, Time to peak (top) and amplitude (bottom) of single-cell calcium transients in WT (n = 10 cells from n = 2 animals), untreated DMD (n = 12 cells from n = 2 animals) and high-dose i.v. treated DMD myocardial slices (n = 8 cells from n = 3 animals). The P?values were determined by one-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test (top: F = 63.24 and d.f. = 27; bottom: F = 8.094 and d.f. = 27). h, Left: exemplary images of Fluo-4 fluorescence in single cardiomyocytes within untreated DMD and high-dose i.v. treated DMD myocardial slices with four regions of interest (ROI). Scale bars: 10 µm. Right: traces of the average fluorescence intensity within the four ROIs, showing calcium transient propagation within single cells. The data are representative of n = 5 samples from n = 2 animals in each group. In b, e and g, means ± s.e.m. are shown. Source data are available for b, c, e and g.

Кроме того, прирожденные arrhythmogenic потенциалы DMD кардиомиоцитов могут вносить вклад в злокачественную вентрикулярную аритмию. Поэтому мы осуществили ex vivo внутриклеточный анализ Ca2+ в одиночных кардиомиоцитах в срезах сердца толщиной 300-µm, поддерживаемых в biomimetic камерах (Methods and Extended Data Fig. 5d)26. По сравнению с выборками из нормальных сердец, клетки bp нелеченных DMDΔ52 кардиальных тканей обнаруживали аномальные переходы Ca2+(Fig. 3f,g) и несинхронизированные волны внутриклеточного Ca2+ (Fig. 3h). Эти патологические признаки почти полностью устранялись с помощью системного воздействия G2-AAV9-Cas9-gE51 (Fig. 3f-h), подтверждая мнение, что врожденная arrhythmogenic чувствительность DMDΔ52 может быть ослаблена с помощью геномного пропуска экзона 51.

Наконец, мы исследовали эффективность целенаправленного воздействия на мышцы intein-split Cas9 AAV в клетках людей (Fig. 4a,e and Supplementary Fig. 5a-c). Мы генерировали индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs)²⁷ от пациентов с DMD, скорее всего, несущих делецию DMD экзона 52 (hDMDΔ52), приводящую к возникновению преждевременного стоп-кодона в экзоне 53 (Extended Data Fig. 6a-g). В качестве контроля мы использовали изогенные hDMDΔ51-52 iPSCs, которые были получены с помощью CRISPR-Cas9-обеспеиваемой эксцизии экзона 51 в недифференцированных hDMDΔ52 iPSCs (Extended Data Fig. 6h-i), а также в iPSCs от здоровых, молодых людей (Extended Data Fig. 7a-f). Будучи понуждаемыми к дифференцировке в скелетные мышцы с помощью подхода, базирующегося на дифференцировке с помощью фактора роста²⁸, hDMDΔ52 клетки экспрессировали достоверно более низкие количества генов скелетных мышц (Fig. 4b) по сравнению с контролем и они не были способны к образованию многоядерных и спонтанно сокращающихся мышечных трубок (Fig. 4c,d and Supplementary Videos 2-4). Это согласуется с др. исследованиями, показавшими, полностью нарушенную способность к образованию мышечных трубок²⁹, когда же DMD человеческие iPSCs (hiPSCs) стали предметом направленной дифференцировки в скелетные мышцы в отсутствии избыточной экспрессии главных скелетных регуляторов гена миогенной дифференцировки 1 (MYOD1), хотя одно из исследований продемонстрировало образование мышечных трубок без MYOD1 (ref. 30). Двойная трансдукция hDMDΔ52 из iPSC происходящих миобластов с помощью пары AAV6-Cas9-gE51 векторов (106 vp cel^l-1; Extended Data Fig. 8a-f), то наблюдалась индуцированная экспрессия человеческого DMDΔ51-52 белка и восстановление образования мышечных трубок (Fig. 4b-d and Extended Data Fig. 8g,h), тогда как AAVs, содержащие scrambled guide RNAs были неэффективны (Extended Data Fig. 9a-c).



Fig. 4: Somatic genome editing of human DMDΔ52 rescues disease phenotypes of skeletal and cardiac muscle cells from patient-specific iPSCs.

a, Schematic of the strategy to rescue defective skeletal myotube formation in myoblasts differentiated from hDMD?52 hiPSCs by transduction with two AAV6 vectors containing an intein-split Cas9 and gRNAs designed to induce DMD exon 51 excision. b, Quantitative RT-PCR analysis of skeletal myotube markers 7-14 d after myotube induction in control (n = 8 independent differentiations), hDMDΔ52 (n = 7), hDMDΔ52 + AAV (n = 6) and hDMDΔ51-52 (n = 4) myoblasts. The P values were determined by one-way ANOVA of the logarithmized values with Bonferroni's multiple comparison test (MYH1: F = 26.21; d.f. = 3; TTN: F = 14.32; d.f. = 21; CDH15: F = 10.84; d.f. = 21). c, Immunofluorescence analysis of myosin heavy chainβ (MyHC-?),α-actinin and Dys 14 d after myotube induction in myoblasts of all groups. The images are representative of >30 images collected from three independent differentiations, except for hDMDΔ51-52 (n = 2). Scale bars: 100 µm. Insets show multinucleation (MyHC-β) and sarcomeric striations (α-actinin). Scale bars: 25 µm. d, Percentage of MyHC-β+ cells 7-14 d after myotube induction of myoblasts of each of the indicated groups. The P values were determined by one-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test (F = 53.74; d.f. = 7). n = 3 independent experiments in which hiPSCs were differentiated to skeletal muscles, except for hDMDΔ51-52 (n = 2). e, Schematic of the experimental design in which cardiomyocytes differentiated from DMDΔ52 hiPSCs were transduced with two AAV6 vectors containing an intein-split Cas9 and gRNAs designed to induce DMD exon 51 excision (as well as either enhanced GFP (eGFP) or mCherry), followed by calcium imaging. f, Exemplary single-cell Ca2+ traces of hiPSC-derived cardiomyocytes of each of the indicated groups (1 Hz pacing) measured by Fluo-4 fluorescence. Data are representative of three independent experiments. g, Ca2+ transient durations at 90% peak decay (TD90) in hiPSC-derived cardiomyocytes of each of the indicated groups (1 Hz pacing). The P?values were determined by one-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test (F = 21.64; d.f. = 11). n = 3 independent experiments, except for hDMDΔ52 (n = 6). h, Top: single-cell Ca2+ trace showing an arrhythmic event in a hDMDΔ52 cardiomyocyte. The results are representative of three independent experiments. Bottom: percentage of cells measured without an arrhythmic event occurring in hiPSC-derived cardiomyocytes belonging to each of the indicated groups. The P values were determined by one-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test (F = 33.23; d.f. = 8). n = 3 independent experiments. In b, d, g and h, means ± s.e.m. are shown. Source data are available for b, d and h.

Совместная трансдукция давала около 90%, по оценке использования вирусов, несущих компоненты CRISPR-Cas9 редактирования генов совместно с парой флуоресцентных репортеров (Extended Data Fig. 8c,d). AAV6-Cas9-обусловленная эксцизия экзона 51 и экспрессия re-framed DMDΔ51-52 (Extended Data Fig. 8e-h) устраняла дефекты обслуживания Ca2+ и arrhythmogenic чувствительность у hDMDΔ52, происходящих из hiPSC кардиомиоцитов (Fig. 4e-h), подтверждая результаты in vivo. Конечно, мы обнаружили некоторую экспрессию дистрофина в hDMDΔ52 клетках (Fig. 4c), которая соответствует повсеместно распространенной короткой изоформе Dp71 (Extended Data Fig. 8g), чьи промторо и первый экзон расположены в интроне 62 (refs. 31,32) и на него не влияет делеция DMD экзона 52. Секвенирование всего генома hDMDΔ52 aи hDMDΔ51-52 изогенных iPSCs выявило несколько нуклеотидных альтераций, которые были в дальнейшем исследованы в отношнии их потенциала служить в качестве места присоединения для любой из двух gRNAs. Анализ показал, что ни одна из возникших de novo мутаций не может быть вызвана использованием gRNAs, поскольку мы установили, по крайней мере, 7 несовпадений между gRNAs и любым из мутантных сайтов (Extended Data Fig. 10).

Итак, мы установили, что крупная животная модель DMD обнаруживает болезненные проявления, такие как мышечная слабость, кардиомиопатия и преждевременная гибель, могут быть лечены с помощью соматического геномного редактирования мутантного DMDΔ52 гена посредством AAV9-Cas9-gRNA. Внутримышечная терапия обеспечивает мощную экспрессию внутренне укороченного, но частично функционального DMDΔ51-52 в инъецированных скелетных мышцах, с минимальным редактированием др. мышц (таких как контралатеральные мышцы, диафрагма и сердце). В случае системного применения, 2? х 1014 vp kg^-1 каждого из двух векторов AAV9 вызывается эффективная и широкая мышечная трансдукция, включая диафрагму и сердце. Чтобы достичь такого эффекта, покрытие вируса dendrimer с G2-PAMAMs, д. преодолеть нужду даже в очень высоких титрах вируса, потенциально превышая недавно описанный уровень токсичности у не человеко-образных приматов и свинок³³. Не выявлено внутриклеточных эффектов вне мишени при такой системной дозе в высоко трансдуцируемой периферической мышечной ткани. В печени и почках редактирование гена является редким событием, хотя трансдукция печени выявлена с помощью PCR против вирусной ДНК, а редактирование печеночных генов наблюдалось у mdx мышей, леченных непокрытыми AAV8, кодирующими Cas9 из Staphylococcus aureus²¹. Хотя трансдукция сателлитных клеток была продемонстрирована прежде у mdx мышей, экспрессирующих репортерный ген под контролем Pax7 промотора¹⁴, мы не получили доказательств таких событий у свиней с нашей вирусной системой.

Используя iPSCs, стало возможным смоделировать эффекты человеческой DMDΔ52 мутации и оценить эффективность AAV-Cas9-обусловленной соматической эксцизии экзона 51 в мышечных клетках человека, которая может теоретически преобразовать рамку считывания у примерно 14% от всех DMD мутаций^34,35. Мы продемонстрировали, что восстановление дистрофина с помощью геномного редактирования может быть достигнуто в дифференцированных миобластах, а также в кардиомиоцитах. Конечно, успешные функциональные исходы при этом подходе сравнимы с прямой коррекцией не дифференцированных iPSCs.

Итак, мы продемонстрировали, что использование AAV9-Cas9-gE51 способно вызывать пропуск экзона 51 it и in vivo и восстанавливать рамку считывания DMD. In vivo, внутримышечные введения приводят к высокой локальной доле редактирования гена за счет распределения в жизненно важные мышцы, такие как диафрагма и сердце, которые вместо этого достигаются внутривенными инъекциями G2-armed AAV9-Cas9-gE51, трансдуцирующими широкие ранги мышц. Укороченный DMDΔ51-52 достаточен для улучшения функции мышц и подвижности и для предупреждения злокачественных аритмий, удлиняя жизнь DMD модельных свиней.