Компенсация первичных генетических дефектов сегодня рассматривается как окончательная стратегия лечения врожденных ошибок метаболизма (IEMs). При обычной генотерапии, вектор, содержащий последовательность откорректированной кодирующей ДНК (cDNA) дефектного гена доставляется хозяину.¹ Этот метод действительно представляет компенсаторный подход, т.к. эндогенный генетический дефект не корректируется. Генотерапия была успешно применена на преклинических моделях IEMs, включая glycogen storage disease type 1a (GSD Ia; OMIM #232200), familial hypercholesterolemia (OMIM #143890), hemophilia B (OMIM #306900), ornithine transcarbamylase (OTC; EC 2.1.3.3) deficiency (OMIM #311250), hereditary tyrosinemia type 1 (HT1; OMIM #276700), and alpha-1 antitrypsin deficiency (OMIM #613490).^2-4 Как следствие подобных эффектов сейчас ведутся разные испытания генотерапии. Напр., недавно начата фаза1/2 испытаний у взрослых GSD Ia субъектов (NCT03517085). В конечном итоге целью такой вирусной генотерапии является восстановление продукции функционального белка на длительные периоды. Для таких IEMs, у которых откорректированные белки д. или секретироваться или экспрессироваться в уже трансдуцированных клетках (eg, hepatocytes),⁵ генотерапия в самом деле д. приводить к реальному излечению, если инсерция трансгена может быть целенаправленно осуществлена в безопасные сайты генома. Однако, когда используются обычные вирусы, то отсутствие контроля за интеграцией может вызывать инсерционный мутагенез и тяжелые побочные эффекты, такие как рак.

Затем обычная компенсаторная генотерапия имеет несколько и др. неудобств. Во-первых, ограничение размеров кДНК, которые могут быть клонированы в вирусном векторе, это может помешать вирусной терапии генов с длинной кодирующей последовательностью. Во-вторых, отсутствие контроля над экспрессией вновь введенной кДНК может снизить эффективность терапии. В-третьих, необходимость во множественных векторах, чтобы экспрессировать разные изоформы гена (или выбор одной специфической изоформы кДНК для переноса) также может скомпрометировать генотерапию при определенных болезнях. Напр., когда мутация затрагивает множественные изоформы одного и того же белка с избирательной экспрессией в ткани, как в случае hyperammonemia (OMIM #6126652 / #219150),⁶ необходима комбинация вирусных векторов для коррекции болезни. Т.о., хотя компенсационная генотерапия может предоставлять действительное лечение IEMs, то её недостатки побуждают к поиску альтернативных терапевтических возможностей.

Редактирование генов означает модификацию последовательности ДНК в определенном месте генома. Этот подход использует разные техники по целенаправленном воздействию на ДНК, такие как meganucleases (MNs), zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator like effector nucleases (TALENs) и сегодня широко используемую clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 систему, все они изменяют геном организма хозяина в выбранном локусе^7-9 (Figure 1). MNs являются endodeoxyribonucleases, белками со способностью распознавать в 12-40 пар оснований двунитчатую последовательность ДНК и разрезать ДНК. ZFNs и TALENs оба состоят из базирующихся на транскрипционном факторе ДНК-связывающих доменах, слитых с нуклеазой. В ZFNs, каждый белок цинковые пальчики (ZFP) распознает последовательность в три пары оснований в ДНК. В случае с TALENs, каждый TAL белок состоит из 34 аминокислот, при этом аминокислоты 12 и 13 определяют распознавание одной из специфических пар оснований ДНК. Используя множественные ZFNs или TALENs, более длинные последовательности ДНК могут целенаправленно подвергнуться воздействию, при этом увеличивается специфичность. В противовес MNs, ZFNs или TALENs, CRISPR/Cas9 использует базирующуюся на РНК стратегию связывания ДНК. CRISPR/Cas9 система состоит из одиночной гид-РНК(guide RNA (sgRNA)) и белка Cas9. sgRNA является комбинацией CRISPR RNA(s) (crRNA[s]) и trans-activating crRNA из оригинального класса II CRISPR/Cas9 системы, включает последовательность ~20 нуклеотидов РНК, которые созданы комплементарными к специфическому сайту генома. sgRNA наводит Cas9 нуклеазу на действительно желаемое место в геноме, после этого Cas9 создает разрезы двойной нити ДНК (DSB) в этом сайте мишени.

Figure 1 Schematic overview of the three main gene editing tools. A, Zinc finger nuclease (ZFN), consisting of a DNA-cutting nuclease domain (gray box), and a protein-based DNA-binding domain of three zinc finger proteins (colored circles), each recognizing a three base pairs (bp) DNA sequence. Hence, this ZFN recognizes a 9 bp genomic sequence. B, Transcription-activator like effector nuclease (TALEN), consisting of a DNA-cutting nuclease domain (gray box), and a protein-based DNA-binding domain of 18 TAL effector repeats. Each TAL effector consists of 34 amino acids, typically highly conserved, with positions 12 and 13 being variable and determining the specific recognition of one DNA bp. Hence, this TALEN recognizes a 18-bp genomic sequence. C, Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system, consisting of a DNA-cutting nuclease (gray box), with two sites of nuclease activity, and a RNA-based DNA-binding domain consisting of a single guide RNA (sgRNA), with the variable 20 nucleotide RNA-sequence determining recognition of a 20-bp complementary genomic sequence

Вызванные редактированием генов DSBs затем репарируются с помощью или non-homologous end joining, обычно сопровождаемого инсерциями или делециями (indels), вызывая мутации и часто нефункциональные белки, или homology directed repair (HDR). Когда присутствует матрица для репарации ДНК, то HDR может вставлять (часть) гена или корректировать мутантный ген. В особенности эта последующая опция предоставляет особый интерес для лечения IEM, поскольку она способна к эндогенной коррекции генетического дефекта IEMs в едином подходе. Это преодолевает недостатки генотерапии: он репарирует генные мутации в эндогенном сайте скорее, чем предоставляет клеткам всю последовательность кДНК откорректированного гена в случайном положении; экспрессия гена находится под эндогенным контролем, в противоположность неконтролируемой экспрессии кДНК при обычной генотерапии; и, наконец, коррекция мутации ожидается в результате экспрессии всех потенциальных изоформ гена. Недавно предложенная CRISPR/Cas9 техника сегодня более широко используется, чем ZFNs или TALENs из-за различий между доменом распознавания ДНК (sgRNA) и нуклеазным доменом (Cas9), что делает её более пригодной по времени и затратам. Целенаправленное воздействие на др. гены требует лишь разработки дополнительных sgRNAs без необходимости преобразования разных сливаемых нуклеаз. Кстати, CRISPR/Cas9 уже была успешно использована в разных in vitro исследованиях и in vivo животных моделях. На преклинических моделях IEMs включая дефицит OTC, HT1, mucopolysaccharidosis type II (MPS II; OMIM #309900) и GSD Ia,^{3, 10-13} ZFNs и CRISPR/Cas9 техники были использованы для коррекции мутантных генов или инсерции исправленных кДНК. Эти техники дошли до путем использования своих собственных T клеток после того как они были выделены генетически модифицированы ex vivo.¹⁴ Недавно, первый тест in vivo ZFN редактирования генов показал обнадеживающие результаты путем инсерции здоровой копии гена iduronate-2-sulfatase (IDS, EC 3.1.6.13) в клетки печени для лечения MPS II.¹⁵

Главным преимуществом техники редактирования генов являются доказательства того, как IEMs могут быть исправлены скорее, чем компенсированы: действительный генетический дефект. В случае секреции откорректированного белка, достаточно генетической модификации лишь в ограниченном количестве клеток. Однако, техника редактирования генов также обнаруживает несколько важных недостатков, которые в настоящее время ограничивают их клинический потенциал.. Важно, что редактирование генов может вызывать p53-обеспечиваемые иммунные реакции¹⁶ и потенциальные эффекты вне мишени.¹⁷ Хотя сегодня трудно аккуратно и эффективно предсказать частоту и тяжесть эффектов вне мишени, также потому, что окружение хроматина отличается у разного типа клеток,¹⁸ специфичность редактирования генов остается критическим в отношении того, что альтерации ДНК сохраняются в течение жизни. Особенно, если эффекты вне мишени возникают в зародышевой линии, передаются потомкам с нежелательными вредными последствиями.¹⁹ Как следствие, такие инструменты, как CRISPR/Cas9, часто обсуждаются, особенно после недавнего рождения двух первых детей с отредактированным геномом.²⁰

Т.о., хотя коррекция первичных дефектов при IEMs может оказаться привилигированной, побочные эффекты техники редактирования генома подчеркивают необходимость альтернативных терапевтических подходов. Следует также подчеркнуть, что патофизиология IEM в общем не связана исключительно с первичными генетическими эффектами, но также и последующими приспособлениями клеток и органов пациентов. Напр., при отсутствии генотип-фенотипических корреляций при определенных IEMs,^21-26, иллюстрирующих связь с альтернативными механизмами, такими как эпигенетика, чтобы объяснить клиническую гетерогенность между пациентами.^{27, 28} Т.о., различия между первичным генетическим дефектом и последующими адаптациями важны, поскольку они могут предусматривать различные, но дополняющие друг друга, эффективные терапевтические подходы, которые выходят за рамки первичного дефекта. Чтобы различать между этими двумя подходами, мы имеем в виду измененные уровни внутриклеточного / внеклеточного метаболита, нарушения передачи клеточных сигналов или нарушения регуляции экспрессии генов²⁹ в качестве вторичных алдаптаций. Имеются множественные способы воздействия на вторичные адаптации, напр., путем целенаправленного воздействия на внутриклеточные и внеклеточные уровни метаболитов и кофакторов, путем восстановления путей трансдукции аберрантных клеточных сигналов и/или путем регуляции генной экспрессии. Воздействие на IEMs изменением нижестоящих эффектов генетической мутации можно достичь путем коррекции аберрантных уровней экспрессии генов, ассоциированных с болезнью. В это отношении инструменты редактирования генов могут быть использованы, чтобы модифицировать уровни генной экспрессии путем инактивации нуклеазного домена ДНК. Одним из способов перепрофилирования инструментов целенаправленного воздействия на гены является слияние эпигенетических эффекторных доменов с нуклеазой инактивированными ДНК-связывающими платформами, чтобы модулировать эпигенетические сигнатуры.

Эпигенетика означает изучение наследственных изменений фенотипа, которые не связаны с изменениями последовательностей ДНК, а связаны с альтерациями метилирования ДНК и модификациями гистонов, следовательно, затрагивающих экспрессию генов. Напр., метилирование ДНК промоторов генов обычно приводит к более низкой экспрессии этого гена. Ацетилирование гистонов обычно приводит к разрыхленной структуре хроматина и тем самым к повышению транскрипции гена, в то время как метилирование гистонов может вызывать как репрессию, так и активацию в зависимости от модифицированной аминокислоты гистона. Помимо ацетилирования и метилирования, существует множество др. форм модификаций гистонов, SUMOylation, ubiquitination и вообще более важные для IEMs, citrullination, ADP-ribosylation, O-glycosylation, succinylation и malonylation.³⁰ Кроме того, метаболическая активность на прямую связана с модификациями ДНК и гистонов.³¹ Напр., acetyl-coA является центральным метаболитом, который также служит в качестве co-substrate при ацетилировании гистонов, уровни nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) влияют на sirtuin-зависимое деацетилирование гистонов, а S-adenosyl-methionine и S-adenosyl-homocysteine регулируют метилирование гистонов и ДНК, а митохондриальный окидатиный метаболизм тено связан с деметилированием гистонов.³¹ Принимая во внимание эту ассоциацию между модификациями ДНК/гистонов и метаболизмом, эпигенетика может предоставлять связь между генетическими дефектами и клиническими фенотипами и может предоставить новые возможности для осуществления диагностики и лечения IEMs с большей вероятностью. Важность эпигенетики для IEMs обнаруживается всё чаще, как это продемонстрировано в обзоре роли эпигенетики при болезнях лизосомного накопления.²⁷ Итак, IEMs связаны с эпигенетическими изменениями и эпигенетика предоставляет интересное новое поле для лечения IEMs.

Помимо генетических изменений, влияющих на регуляцию экспрессии генов, они могут целенаправленно корректировать или компенсировать аберрантную экспрессию генов при IEMs, при этом обнаруживаются сходные исходы как и в случае генотерапии и редактирования генов. Несколько эпигенетических лекарств ("epi-drugs") уже были одобрены FDA, а в онкологии проводятся многочисленные клинические испытания с такими соединениями,³² это отражает многообещающий терапевтический потенциал целенаправленного действия эпигенетики. Главным неудобством epi-drugs, однако, является тот факт, что они действуют на весь геном скорее, чем ген-специфическим способом, увеличивая потенциальные нежелательные побочные эффекты и тем самым ограничивая их широкое клиническое использование. Техника, которая, по-видимому, очень подходящая для безопасной и также стабильной терапевтической модуляции экспрессии генов (также как и для компенсации и смягчения генетических мутаций) это эпигенетическое редактирование (EGE,33-35). Путем комбинирования эпигенетических энзимов с преимуществами техники целенаправленного воздействия на ДНК, EGE прямо использует обратимость эпигенетических изменений ген-специфическим способом . EGE базируется на способных к программированию ДНК-связывающих платформах (ZF proteins [ZFPs], TALEs или CRISPR/Cas9), на которых активность нуклеаз устранена или деактивирована, тем самым предупреждаются манипуляции с последовательностью ДНК. Скорее ДНК-связывающий белок (ZF/TALE) или деактивированная нуклеаза ("dead" Cas9 или dCas9, в случае CRISPR/[d]Cas9), служат в качестве белка челнока ("shuttle"), с помощью которого др. белки могут быть слиты, включая искусственные активаторы транскрипции, репрессоры или др. ко(факторы), участвующие в регуляции экспрессии, это делает возможной временную модуляцию экспрессии гена (Figure 2). В случае EGE, эпигенетические энзимы сливаются с деактивированной нуклеазой, чтобы репрограммировать эпигенетические сигнатуры. Эти энзимы могут быть эпигенетическими записывающими устройствами (writers), такие как DNA methyltransferases или гистоновые lysine- или methyltransferases, или эпигенетические стиратели, такие как энзимы, участвующие в удалении метилирования ДНК или гистоновые deacetylases/demethylases. EGE т.о., представляет собой новаторский подход не только для изучения биологии хроматина и способа регуляции генной экспрессии, но и также в конечном итоге может быть использовано в качестве терапевтического инструмента.

Figure 2 Comparison of different strategies to treat IEMs. A, Conventional gene therapy, based on the introduction of a cDNA or mRNA sequence encoding a correct version of the mutated gene. As a result, the defect is compensated without altering the genomic sequence of the host. B, Gene editing using (in this case) CRISPR/Cas9, which aims to correct the mutated gene by altering the genomic sequence of the host at a precise location, or which can be used to modify the expression of proteins that compensate for the genetic defect via alterations in the genome. C, Epigenetic editing using an epigenetic writer or erasers fused to (in this case) the CRISPR?dCas9 system to compensate for the genetic defect, for example, by increasing the residual expression of a mutated protein to enhance its activity, or by modifying the expression of proteins capable of compensating for the genetic defect, via gene-specific alterations in the epigenetic landscape

EGE преодолевает некоторые из побочных эффектов др. подходов, рассмотренных выше. Модуляция экспрессии генов посредством EGE, напр., с помощью одиночной sgRNA и эпигенетического энзима, слитого с dCas9, обеспечивает естественный, эндогенный контроль экспрессии, очень сильно напоминающий естественный, чем просто избыточная экспрессия кДНК, индуцирующей и целенаправленно воздействующей на все изоформы, и без проблем, связанных с размером. В некоторых случаях эпигенетические изменения являются митотически стабильными,^{36, 37}, подразумевающие устойчивый терапевтический эффект и представляющие технику EGE как one-and-done подход, сходный с редактированием генов. Хотя EGE, сходные с инструментами по редактированию генов, могут страдать от эффектов вне мишени, обратимая природа эпигенетических изменений делает возможной относительно легкую коррекцию этих нежелательных эффектов. В то время как, с одной стороны, эпигенетические изменения могут активно перезаписываться (overwritten) с помощью EGE, эти изменения могут быть впоследствии скопированы во время клеточных делений, делая эффекты стабильными. В самом деле, во время дифференцировки клеток эпигенетические сигнатуры переписываются (rewritten), чтобы стабилизировать программу специфичной для типа клеток профиля генной экспрессии. Эти эпигенетические характеристики впоследствии копируются дочерними клетками во время митозов, обеспечивая сохранение клеточной идентичности. Несмотря на эту эпигенетическую память клетки могут приспосабливать свои эпигенетические сигнатуры в ответ на продолжительные внешнесредовые изменения. Такие адаптации клеток указывают на динамичность эпигенетики и являются отражением общих определений эпигенетики: наследуемые, хотя и обратимые изменения в экспрессии генов, не закодированные в последовательности ДНК. При EGE усиливается присутствие эпигенетических записывающих или стирающих факторов на геномном локусе, изменяющих эпигенетическую сигнатуру. Такие изменения могут быть скопированы и сохранены с помощью энзимов поддержания эпигенетики, что делает стабильными вновь индуцированные метки. Принимая во внимание эти характерные эпигенетические изменения, EGE в целом рассматривается как более безопасное, чем редактирование генов, т.к. никакие генетические изменения не вносятся, но оно может быть столь же эффективным, т.к. может быть достигнута стабильная модуляция экспрессии.^36-38

Имеется несколько примеров успешного использования EGE с ZFs и CRISPR/dCas9 на преклинических моделях. Исследования показали, что EGE может быть применено ген-специфическим способом в виде ДНК (de)methylation и гистоновых модификаций и что эти изменения могут быть транслированы в физиологические изменения.^{37, 39-46} EGE также является потенциально интересным для лечения IEMs. Напр., редукция экспрессии PCSK9 при семейной hypercholesterolemia может снижать уровни холестерина в плазме.³ Кроме того, EGE может также быть пригодно при IEMs, чтобы повышать экспрессию мутантного белка с остаточной активностью. В случае мутаций с полной потерей функции, EGE может стать инструментом для повышения экспрессии белков, которые компенсируют дефект. Примерами IEMs, где эти стратегии могут оказаться правомочными, включают наследственную непереносимость фруктозы (OMIM #229600), при которой изоэнзим aldolase A (EC 4.1.2.13) может быть усилен в своей активности, чтобы скорректировать недостаточность энзима aldolase B,⁴⁷ и GSD Ia, где лизосомная α-glucosidase (EC 3.2.1.20 и EC 3.2.1.33) смогут усилить активность glucose-6-phosphatase (EC 3.1.3.9) (G6Pase)-независимой продукции глюкозы.⁴⁸ Т.о., тот факт, что эпигенетические изменения играют роль в IEMs²⁷, что они обратимы и могут возникать позднее в жизни как следствие IEM и могут в принципе вносить вклад в долго-временные осложнения болезни, делает EGE также интересным инструментом для предотвращения или компенсации этих осложнений, таких как возникновение рака у IEM пациентов.²⁹

Каждый обсуждаемый здесь подход имеет свои специфические преимущества и недостатки (Table 1). Одной из главных проблем всех методов является эффективная доставка терапевтических компонентов. Доставка может быть осуществлена разными способами, напр., с помощью использования плазмид, аденовирусов, ретровирусов, лентивирусов, адено-ассоциированных вирусов или ribonuclear методов. Важно подчеркнуть, то доставка терапии будет улучшена в ближайшем будущем.¹ Связанным с вопросом эффективной доставки является риск иммунного ответа на генотерапию и генетическое и эпигенетическое редактирование, которые затрудняют эффективность доставки и устойчивую терапевтическую эффективность.

Table 1.

Overview of the advantages and disadvantages of different gene-based therapies

В то время как обычная компенсационная генотерапия с использованием кДНК сегодня является предпочтительным лечением IEMs, имеются тяжелые проблемы, которые препятствуют её клиническому применению. Корректирующее исправление генов д. обходить множество проблем, т.к. репарирование генетического дефекта д. происходить постоянно, преодолевая необходимость внесения полной длины экзогенной последовательности ДНК. Однако, главной проблемой редактирования генов является риск эффектов вне мишени с необратимыми альтерациями геномной последовательности, которая может стать особенно вредной, если возникнет в зародышевой линии. EGE представляет собой менее инвазивный, потенциально стабильный терапевтический подход. Он делает возможными обратимые альтерации метилирования ДНК и модификации гистонов ген-специфическим способом, поэтому репрограммирование профиля экспрессии гена при IEMs с четким преимуществом по сравнению с обычной генотерапией и редактированием генов. По сравнению с редактированием генов, EGE считается безопасным, поскольку оно не приводит к альтерациям генома, а только к модификациям, в принципе обратимыми, способными к коррекции потенциальных эффектов вне мишени. В целом, эпигенетика является относительно неизведанной областью в патофизиологии IEMs, поскольку метаболическая активность непосредственно связана с активностью эпигенетических энзимов и эпигенетических меток на ДНК и гистонах. EGE обладает четкими преимуществами перед генотерапией или редактированием генов и представляет собой новый подход к лечению IEMs.

Генотерапия сегодня рассматривается как оптимальное лечение врожденных ошибок метаболизма (IEMs), в качестве средства постоянной компенсации первичного генетического дефекта. Однако, существующие подходы редактирования генов, такие как CRISPR/Cas9, при которых ДНК организма хозяина редактируется в точной локализации, может иметь превосходный терапевтический потенциал. Стратегии редактирования генов имеют целью коррекцию действительной генетической мутации, такая стратегия может быть также перепрофилирована, чтобы нормализовать изменения в экспрессии генов, возникающие в качестве вторичного генетического дефекта. Более того, помимо генетических причин IEMs, всё чаще оказывается, что их клинические фенотипы ассоциированы с эпигенетическими изменениями. Поскольку эпигенетические альтерации принципиально обратимы, то это может предоставлять новые возможности для лечения IEM пациентов.