Недавний прогресс в разработке нуклеаз существенно улучшил эффективность редактирования генов, особенно с появлением Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) технологии [1,2]. Рабочий процесс редактирования генов CRISPR подробно описан Ran et al. [3]. Рабочий процесс редактирования генов CRISPR подробно описан Ran et al. [3]. Вкратце, конструируют gRNAs против представляющих интерес генов и клонируют в целенаправлено действующих векторах для экспрессии в клетках-мишенях; затем конструкции вводят вместе с плазмидой, экспрессирующей Cas9, в клетки-мишени. Успешное редактирование мишени можно проверить с помощью тестов Surveyor или T7 эндонуклеазы I (T7EI) с геномной ДНК, выделенной из отредактированных клеток, это использует преимущества нуклеаз, специализирующихся на разрезании несовпадений в dsDNA (гетеродуплекс), в результате indel мутаций, индуцированных с помощью негомологичного восстановления соединения концов (NHEJ) после редактирования гена. Затем отредактированные клетки разделяют на отдельные колонии единичных клеток, причем их индивидуальные мутации определяют с помощью клонирования PCR локусов-мишеней и секвенирования по Сэнгеру. Весь процесс обычно длится около 4 недель, при этом большую часть времени человек тратит на процесс изоляции одноклеточных колоний и их генотипировании на предмет желаемых мутаций. Число колоний, подлежащих скринингу, может быть значительным, особенно если кто-то желает осуществить двойной нокаут генов мишеней в диплоидных эукариотических клетках, поскольку большинство образующихся колоний имеют только мутации в одном аллеле. Было сделано несколько попыток повысить успешность создания DKO. Одна стратегия основана на последовательном нацеливании на каждый аллель интересующего гена и вставке кассет экспрессии для различных флуоресцентных белков в сайты мутаций посредством homology directed repair (HDR). Это позволяет положительно отобрать клетки с обоими мутированными аллелями с помощью FACS [4]. Точно так же были разработаны другие методы целенаправленного воздействия на основе HDR для вставки маркеров после положительной селекции, включая ген лекарственной устойчивости и флуоресцентные маркеры, в локусы мишени, и достигли различной степени успеха [5, 6]. Однако все вышеперечисленные методы включают сложный рабочий процесс. Для каждого гена мишени необходимо не только создать конструкцию для sgRNA, но и репарационные матрицы с ген-специфическими плечами для гомологичной рекомбинации и различными маркерами отбора. Для клеток, которые трудно трансфицировать, такая стратегия вряд ли будет успешной.

Альтернативно, вторая стратегия использовала отрицательный отбор путем одновременного нацеливания на отдельный локус, который обеспечивает отрицательный отбор вместе с представляющим интерес геном. Например, гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (HPRT) является ферментом, защищающим пути синтеза пурина. Это не важно для выживания клеток; однако его дефицит в клетках-хозяевах защищает от цитотоксического препарата 6-thioguannine (6TG). Эта функция была использована для обогащения DKO в клетках, модифицированных нуклеазой, когда и представляющий интерес ген, и HPRT подвергаются целенаправленному воздействию. Результаты варьируют, с процентной долей DKO менее 5% в успешных запусках [7]. Неудовлетворительные результаты, вероятно, отражают тот факт, что HPRT X-сцеплен, поэтому для любого пола действует только одна функциональная копия. Следовательно, устойчивые к 6TG колонии возникают в результате модификации только одного аллеля, что не обеспечивает адекватного давления отбора для двойного нокаута. Альтернативно, совместное целенаправленное воздействие на Na + / K + ATPase (кодируемую геном ATP1A1) делает возможным отрицательный отбор с помощью уабаина (ouabain ) и значительно увеличивает частоту мутаций как для indels, так и для нацеленной на гомологи репарации [8]. Однако, поскольку Na + / K + АТФаза играет важную роль в физиологии клеток, функциональные последствия для клеток, являющихся мишенями, еще предстоит изучить. Кроме того, выделение колоний, устойчивых как к 6TG, так и к уабаину, требует ручного труда и требует много времени по сравнению с автоматическим выделением отдельных клеток с помощью FACS.

В этом исследовании мы описываем изобретение, в дальнейшем называемое обогащением мутаций с помощью потока (FAME), которое сочетает в себе удобство автоматической изоляции отдельных клеток, обеспечиваемое FACS, и мощь отрицательного отбора с использованием поверхностного маркера, который обеспечивает адекватное давление отбора. С помощью этой технологии мы смогли значительно обогатить количество DKO в желаемых локусах, которые подвергаются целенаправленному воздействию вместе с маркером отрицательной селекции. Процедура FACS в рабочем процессе также обеспечивает желаемую автоматизацию выделения одиночных колоний. Мы представили доказательства того, что процедура FAME значительно увеличила распространенность indel-мутаций в отрицательно отобранных клетках, при этом почти 100% изолированных колоний являются DKO, такой показатель успеха ранее достигался только с помощью схемы положительного отбора, но при этом отмечается гораздо более эффективный рабочий процесс и более широкий спектр использования.

(A) HEK293T cells were transfected with expression plasmids for spCas9, and sgRNAs for B2M and PTEN. 5 days later, transfected cells were stained with FITC-conjugated antibody against human HLA-A,B&C. Single isolated cells with positive and negative surface MHC-I were sorted into 96-well plates. B-F. After expansion of the isolated clones, the region targeted by sgRNA was PCR amplified from genomic DNA, and submitted for Sanger sequencing. Representative chromograms were shown in the context of the target site, including PAM (GGG), for the picked clones. B, a typical wild type colony from MHC-I positive population identified with PCR sequencing; C, a typical DKO colony from MHC-I negative population with homozygous insertions identified with PCR sequencing; D, a colony (#4) from MHC-I negative population with illegible chromatogram with mixed signals; E and F, Sanger sequencing of plasmids with cloned PCR products from the same MHC-I negative colony as in D (#4) identified the exact mutations in each allele.