Пюёхщхэшщ:
МУТАЦИИ В G PROTEIN-COUPLED RECEPTORS



Патофизиология и терапия

Mutations in G Protein-Coupled Receptors: Mechanisms, Pathophysiology and Potential Therapeutic Approaches
Torsten Schöneberg and Ines Liebscher
Pharmacological Reviews January 2021, 73 (1) 89-119; DOI: https://doi.org/10.1124/pharmrev.120.000011

Недавние подсчеты определили наличие 19000-20000 белок-кодирующих генов в геноме человека (Ezkurdia et al., 2014). Хотя все эти гены необходимы для поддержания приспособленности организма, по крайней мере, во время периода эволюции человека, и лишь часть генов вызывает болезни, будучи повреждена. Исследования последних 25 лет привели к идентификации генов, ответственных за ~50% известных 7000 редких моногенных болезней, остальные будут определены вскоре (Boycott et al., 2013). Существует более 800 описанных генов G protein-coupled receptor (GPCR) (4.1%-4.3% от всех генов) (Lv et al., 2016; Alexander et al., 2019), это делает эти мембранные рецепторы наиболее многочисленным семейством в геноме человека. Члены сверхсемейства GPCR участвуют почти во всех физиологических функциях, включая участие в передаче сигналов нейротрансмиттеров, гормонов, метаболитов, запахов и ионов. Они также участвуют в передаче механических сил (Petersen et al., 2015; Scholz et al., 2017; Erdogmus et al., 2019) и в межклеточных и клетка-матрикс взаимодействиях (Hamann et al., 2015). Благодаря свой способности модулировать такой огромный набор физиологических сигналов, GPCRs целенаправленно воздействуют на 34% из используемых сегодня лекарственных средств (Hauser et al., 2017). Однако, мутации в GPCR генах могут сильно изменять их нормальную функцию, а мутантные GPCR гены вызывают около 66 моногенных болезней человека (Table 1). Так, некоторые индивидуальные GPCR гены могут вызывать разные моногенные болезни из-за потери или избыточности функции у мутантов. Принимая во внимание 66 моногенных болезней, вызываемых мутациями в генах GPCR, и 363 описанных не связанных с обонянием GPCR генов (~17.9%), альтерации GPCR генов вносят вклад соразмерно 3500 известным на сегодня моногенным болезням в сравнении со всеми генами человека (17% - 18%).

TABLE 1 Monogenic diseases caused by mutations in GPCRs

На сегодня известные моногенно наследуемые болезни, вызываемые мутациями в GPCRs [источники: MALAcards (https://www.malacards.org/)(Rappaport et al., 2017), Online Mendelian Inheritance in Man (https://omim.org/, Pubmed literature s creen) и TSHR база данных мутаций (https://www.tsh-receptor-mutation-database.org)] представлены вместе с известным на сегодня количеством причинных missense, nonsense, splice-site мутаций и крупных делеций и перестроек (источник: http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php). Болезни, обозначенные жирным шрифтом, вызываются с помощью активирующих мутаций. Некоторые GPCR гены были также идентифицированы в исследованиях по скринингу генома человека на LoF варианты: *genes intolerant for LoF (Lek et al., 2016), #homozygous LoF genes in Pakistani adults (Saleheen et al., 2017), °orphan GPCR.

С появлением секвенирования экзома и всего генома, более 180 генотип-фенотип связей было установлено для редких моногенных болезней между 2009 и 2013 (Boycott et al., 2013), но только две включали мутации генов GPCR -GPR179 для слепоты и glutamate receptor (GRM) 1 для врожденной мозжечковой атаксии (Table 1). Возможно мы достигли насыщения по идентификации вовлечения GPCRs в моногенные болезни, но genome-wide association studies (GWASs) по фенотипированию ген-дефицитных животных моделей и анализ некоторых мутаций генов GPCR, скорее всего, откроет новые связи между болезнями и мутациями GPCR. II. History Понимание вклада GPCRs в патологические механизмы наследственных болезней человека неотделимо связаны с попытками выяснить функцию rhodopsin (RHO), прототипа GPCR. После секвенирования гена, кодирующего человеческий RHO в фоторецепторах палочках сетчатки (Nathans and Hogness, 1984), RHO сразу же стал геном кандидатом на роль ряда наследственных форм пигментного ретинита, болезни, характеризующейся дегенерацией фоторецепторов. Некоторые группы идентифицировали мутации в кодирующем регионе RHO и оказались строго ассоциированы с этой болезнью (Dryja et al., 1990; Inglehearn et al., 1991). Кстати, идентифицировано более 180 RHO мутаций, которые вызывают аутосомно доминантные формы пигментного ретинита (Table 1). После открытия мутаций, вызывающих пигментный ретинит, в RHO и клонирования др. GPCR кДНК, количество мутантных GPCRs, непосредственно связанных с болезнями людей, постоянно увеличивается. Прежде всего, резистентность конечных органов к гормонам оказалась сцепленной с мутациями в GPCRs. Были исследованы крупные родословные, чтобы идентифицировать хромосомные регионы, ассоциированные в наследственными болезнями и сцепленные с мутациями в GPCRs (Lester et al., 1990; Bichet et al., 1992) (Fig. 1). Напр., V2 vasopressin receptor (AVPR2) кДНК была идентифицирована в 1992, а мутации в гене AVPR2 были обнаружены параллельно при X-linked nephrogenic diabetes insipidus (NDI) (Rosenthal et al., 1992). Сходным образом, клонирование рецепторов для thyroid-stimulating hormone (TSH) (Parmentier et al., 1989) и luteinizing hormone (LH) (McFarland et al., 1989) было тесно связано с идентификацией болезнь-вызывающих мутаций в этих рецепторах гликопротеиновых гормонах (Parma et al., 1993; Shenker et al., 1993). Fig. 1. Approaches to identify mutant GPCR as cause for inherited diseases in the course of time.

После клонирования и секвенирования первых генов GPCR в 80s/90s, информация о геномных локусах из крупных болезнь-вызывающих семейств была сравнена с мутациями в генах GPCR. В 1990s, целенаправленное разрушение GPCR генов у животных моделей и последующее фенотипирование привели к идентификации фенотипических отклонений у людей и болезней, вызываемых мутациями в ортологических GPCR генах людей. Сегодня крупномасштабное секвенирование экзома и генома у больных и контрольных групп сделало возможным сравнительный анализ, выявивший редкие GPCR варианты, которые могут быть связаны с фенотипическими отклонениями у людей. В будущем глубокое секвенирование транскриптомов тканей и даже определенных клеточных популяций добавит информацию о важных для болезней действующих мутациях в кодирующих и не кодирующих регионах в отношении активности промотора и сплайсинга. Figure was created with BioRender.

Следующая "волна" открытия моногенных болезней человека, вызываемых GPCR мутациями возникла в результате фенотипирования дефектных по GPCR гену мышей в поиске фенотипических соответствий у людей (Fig. 1). Напр., инактивирующие мутации в melanocortin type 4 receptor (MC4R), которая вызывает формы наследственного ожирения у людей (Vaisse et al., 1998; Yeo et al., 1998), которая была открыта после описания ожирения у MC4R-дефицитных мышей (Huszar et al., 1997). Сходным образом, hyperglucagonemia, hyperaminoacidemia и glucagon cell hyperplasia были описаны у мышей с дефицитом рецептора глюкагона (Gelling et al., 2003; Dean et al., 2017), а затем тот же самый фенотип был найден у людей с дефектом рецептора глюкагона (Zhou et al., 2009).
Современная "волна" всё ещё управляется мышиными фенотипами, а также секвенированием всего генома и экзома у пациентов с подозрительными фенотипами (Fig. 1). Напр., секвенирование всего генома пациентов с врожденной постоянной ночной слепотой выявило рецессивные мутации в orphan рецепторе GPR179 (Audo et al., 2012), и эффект возникновения болезни при потере функции GPR179 был продемонстрирован на модельных мышах и рыбках данио (Peachey et al., 2012). Сходным образом, секвенирование экзома идентифицировало мутации в γ-aminobutyric acid type B receptor subtype 2 (GABBR2), ответственные за сходный с синдромом Rett фенотип и эпилептическую энцефалопатию (Yoo et al., 2017). Соотв., мыши, лишенные GABBR2 имели сложный нейрологический фенотип, включая и судороги (Gassmann et al., 2004). Можно ожидать, что секвенирование всего генома и транскриптома позволит выявить дополнительные GPCR гены и новые патологические механизмы с альтерациями генетических компонентов, таких как промоторы и интронные регионы (Fig. 1).

III. General Mechanisms of GPCR Pathologies


Молекула рецептора характеризуется своей способностью менять свою структуру после специфического соединения со своим агонистом. Эти зависимые от сигнала конформационные изменения трансдуцируются в эффекты, такие как рекрутирование или потеря ассоциации с др. белками или биомолекулами, модификация ферментативной активности или изменения в проницаемости ионов. GPCRs являются также так наз. GTP exchange factors (GEFs), запускающими обмен GDP на GTP в α-субъединице гетротримерных G белков. Мутации в GPCRs могут приводить к инактивации активности их GEF [потере функции (LoF)] (Fig. 2) или к независимой от лиганда активации этой GEF активности [gain of function (GoF)] (Fig. 3). Эти два функциональных следствия являются наиболее частыми альтерациями, вызываемыми мутациями в GPCRs.

Fig. 2. General mechanisms of disease-relevant LoF mutations in GPCRs. The LoF of GPCRs can be caused by alterations at different levels of the receptor protein biosynthesis (genomic, transcriptomic, and/or translational level), protein folding, processes of peri- and post-transcriptional modifications, and trafficking (lower panel). In most of these cases, there is no or insufficient receptor protein at the cell surface to mediate signal transduction. The LoF of mutant GPCRs that are transferred to the plasma membrane can be the results of receptor oligomerization effects, mutations that interfere with proper binding of the agonist or tethered agonist (upper left panel), or mutations that interfere with interaction of G proteins or other adapter proteins (upper right panel). Figure was created with BioRender. ER, endoplasmic reticulum; PTM, post-transcriptional modification.

Fig. 3. General mechanisms of disease-relevant GoF mutations in GPCRs. There are two general forms of GPCR alterations that cause a gain of receptor function-agonist-independent and agonist-dependent causes. Mutations in transmembrane helices or, more rarely, in the exctracellular loops promote an active conformation of this domain. Some GPCRs (see text) contain an internal agonist, and mutations within or surrounding the tethered sequence can shift this internal agonist into its active conformation, triggering the on-stage of the transmembrane domain. In rare cases, mutations can increase the potency of the physiologic agonist, which shifts the concentration-response significantly leftward and generates a quasi-constitutively active GPCR. Mutations can also change the agonist specificity, leading to a GPCR that now recognizes a related and more potent endogenous ligand. Decrease of receptor inactivation (e.g., due to lack of arrestin recruitment) or degradation and increased transport or recycling can also appear as an increased receptor activity. Figure was created with BioRender. uORF, upstream ORF.

Однако, исследования последних 25 лет расширили это мнение о GPCR как только о "on-off". Соединение с более чем одним классом G-белков (Gudermann et al., 1996), существование разных активных и неактивных конформаций (Weis and Kobilka, 2018), склонность к передаче сигналов (Wootten et al., 2018), аллостерическое соединение с сайтами (May et al., 2004), олигомеризация рецепторов (Milligan et al., 2019) и модуляция активности рецепторов с помощью эндогенных антагонистов и обратных агонистов (Adan and Kas, 2003) и др. взаимодействующих белков (van der Westhuizen et al., 2015) обусловливают высокую функциональную сложность в сверхсемействе GPCR. Все эти свойства и функции могут по отдельности или в комбинации нарушаться мутациями (Stoy and Gurevich, 2015). Дальнейший уровень сложности добавляется, когда мутации в генах GPCR изменяют активность промотора, затрагивают сплайсинг или приводят к удвоениям или перестройкам генов (Fig. 4). Более того, GPCRs также способны к независимой от G белка передаче сигналов [напр., путем рекрутирования arrestins (Chen et al., 2018b)], путем укладки др. внутриклеточных белков (Appert-Collin et al., 2006; Dunn and Ferguson, 2015; Knapp and Wolfrum, 2016; Garcia et al., 2018) или путем взаимодействия с др. рецепторами и выступая как сигнал для самого себя (Schöneberg et al., 2016). Компоненты, организующие собственно доставку и передачу сигналов GPCRs также могут быть затронуты мутациями и могут приводить (частично) к конвергентным фенотипам, как это наблюдается при наследственных болезнях, вызываемых мутациями в GPCRs. Компоненты передачи сигналов GPCR при наследственных болезнях рассмотрены в работах Weinstein et al., 2006; Gurevich and Gurevich, 2019.

Fig. 4. Other mechanisms of disease-relevant GPCR pathologies. As in the case of many other inherited diseases, more complex genomic alterations can cause a loss but also a gain of GPCR function. Chromosomal mutations can have an impact of gene dosage (deletions, large insertions, rearrangements, duplications, gene fusions), which results in reduced, increased, or ectopic GPCR expression. Mutations may also have an impact on proper mRNA transcription and processing when promoter, UTR, or intronic regions are affected. For most of the known genomic alterations, there are also examples for GPCR genes (see text). Figure was created with BioRender.

Кстати, более 2350 мутаций в 55 GPCR генах связаны с 66 болезнями человека. Приблизительно 14 нарушений вызываются активирующими мутациями в GPCRs (Table 1). Разные болезни могут быть результатом нарушений одного гена GPCR, принимая во внимание инактивирующие и активирующие мутации [напр., hypothyroidism и hyperthyroidism, вызываемые мутациями TSH receptor (TSHR)]. Доминантные признаки не всегда являются результатом активирующих мутаций, но даже в гетерозиготном состоянии инактивирующие мутации, эффекты дозы гена или доминантные негативные эффекты от неправильно упакованных белков на оставшийся дикого типа рецептор (напр., RHO, FZD2) могут вызывать болезнь. Среди этих 55 GPCRs, имеются 7 (14.5%) orphan GPCRs (Hauser et al., 2020), которые вызывают только 9.4% от всех болезней, вызываемых мутациями в GPCRs. Это, скорее всего, обусловлено тем фактом, что функциональное значение мутаций, обнаруживаемых в orphan GPCRs, трудно тестировать из-за отсутствия агонистов и неизвестных или неопределенных путей передачи сигналов. Следовательно, причинная связь между болезнью и идентифицированными мутациями обычно устанавливается по данным сцепления в фенотипически хорошо охарактеризованных когортах или крупных единокровных семьях и по появлению обычно инактивирующих мутаций, таких как мутации сдвига рамки считывания и мутации преждевременных стоп-кодонов (Piao et al., 2004; Kamenickэ et al., 2015; Ravenscroft et al., 2015; Alkufri et al., 2016). Дефицитные по GPCR мышиные модели воспроизводят фенотипы у людей (Supplemental Table 1; Table 2) и поэтому пригодны для определения связи болезней человека с причинными мутациями даже в orphan GPCRs. Одним из примеров является нарушение плодовитости мужчин, обусловленное дефицитом adhesion GPCR (aGPCR) ADGRG2, которое впервые было обнаружено у нокаутных мышей (Davies et al., 2004) , а позднее было установлено у пациентов с X-сцепленным бесплодием (Patat et al., 2016).

TABLE 2 Monogenic diseases caused by mutations in GPCRs

The top 10 autosomal diseases caused by mutations in GPCRs are listed together with the detailed human phenotype and the phenotype found in the respective gene-deficient mouse model (given reference). X-chromosomal diseases and their mouse phenotypes are listed in Supplemental Table 1. Mouse phenotypes are taken from the listed reference and the mouse phenotype data base (http://www.informatics.jax.org).

Большинство геномных альтераций являются missense мутациями (68%) и это сопровождается небольшим количеством inserts/deletions (16%), nonsense (stop) мутациями (7%), крупными делециями и перестройками (6%) и мутациями сплайсинга (3%) (Table 1). Если сравнивать с мутациями, затрагивающими 11320 генов человека [Human Gene Mutation Database Professional release 2019.4; (Stenson et al., 2012)], то имеются определенные различия в распределении геномных альтераций (48% missense мутаций, 22% малых inserts/deletions, 11% nonsense мутаций, 10% крупных делеций и перестроек, 9% мутаций сплайс-сайтов). Однако, следует отметить, что не все варианты Human Gene Mutation Database являются патогенными и что механистически не все гены могут быть активированы с помощью missense мутаций (напр., структурные белки, такие как коллагены).

IV. Inactivating Mutations of GPCRs


Для GPCRs, "inactivation" означает полную или частичную потерю реакции на физиологические сигналы, это приводит к полной или частичной потере передачи сигналов, специфически обеспечиваемых с помощью затронутых GPCR. Инактивирующие мутации включают весь репертуар мутаций: мутации одиночных нуклеотидов,inserts/deletions, мутации сдвига рамки считывания и частичные или полные делеции гена. Большинство инактивирующих мутаций являются de novo или рецессивными мутациями, передаваемыми лишь в течение немногих генераций. В некоторых случаях гетерозиготность может дрейфовать или даже наделять потенциальными селективными преимуществами носителей мутации на длительный период, как в случае prokineticin receptor type 2 (PROKR2), когда инактивирующая мутация L173R персистирует более 9000 лет (Avbelj Stefanija et al., 2012). Высокая частота инактивирующих мутаций в популяции может и в самом деле указывать на преимущества, что подтверждается вариантами мутаций в гене melanocortin type 1 receptor (MC1R), ключевом регуляторе меланогенеза (Martэnez-Cadenas et al., 2013; Dib et al., 2017; Marano et al., 2017).
Большинство missense, insert/deletion и nonsense мутаций изменяют укладку рецепторных белков (примерно 80% от всех инактивирующих мутаций в GPCRs), которые сохранялись внутри клеток с помощью системы, контролирующей качество эндоплазматического ретикулума (Araki and Nagata, 2011) и тем самым вызывали неподходящую экспрессию на клеточной поверхности (Schöneberg et al., 2004; Conn et al., 2007) (Fig. 2). Неправильно упакованные GPCRs могут даже агрегировать и накапливаться, вызывая гибель клеток (Park, 2019) и конвергентные фенотипы, давая болезни агрегации белков (Aguzzi and O'Connor, 2010). Одним из примеров является пигментный ретинит, при котором палочковидные фоторецепторы дегенерируют из-за отложения неправильно упакованного мутантного RHO (Miller et al., 2015).
Оказавшись мутантным GPCR проходит через систему контроля качества эндоплазматического ретикулума и достигает клеточной поверхности, при этом мутация всё ещё может мешать связыванию агониста и/или соединению с G-белком (Fig. 2). Функциональные методы, которые различают между разными молекулярными причинами инактивации рецептора, известны, включая вторичные мессенджеры, связывание лиганда и оценки экспрессии рецептора. Такие экспериментальные подходы выявляют многочисленные клинически важные примеры мутаций GPCR, показывающие, что LoF рецепторов, экспрессирующихся на плазматической мембране являются главной причиной снижения сродства к физиологическим агонистам (Biebermann et al., 1997; Schöneberg et al., 1998; de Roux et al., 1999; Morello et al., 2001; Tarnow et al., 2003). В принципе, альтерации кармана связывания агонистов могут возникать посредством прямых или косвенных механизмов. В первом случае затрагиваются позиции аминокислот, которые непосредственно участвуют во взаимодействиях с агонистом. Напр., Arg256Gln мутация в ADP рецепторе P2RY12 вызывает наследственную кровоточивость (Table 1) (Cattaneo et al., 2003). Эта мутация не мешает собственно экспрессии на клеточной поверхности P2RY12, а мешает связыванию агониста. Кристаллическая структура человеческого P2RY12 со связанным агонистом показывает, что позитивно заряженные остатки аргинина (Arg256) непосредственно взаимодействию с фосфатной половинкой агониста 2-methylthio-adenosine-5'-diphosphate-ADP (Zhang et al., 2014). Т.к. Arg256 является существенной частью кармана связывания агониста, то мутация в этой позиции в Gln затем приводит к потере сродства. Косвенные нарушения сайта связывания агониста могут возникать, если мутация в позиции удаленно вовлечена в структуирование и стабилизацию связывающего кармана.
Изолированные дефекты соединения рецептора и G-белка без нарушения доставки рецептора и/или связывания агониста редки (Fig. 2), но появляются при болезни Hirschsprung, которая вызывается мутациями в гене endothelin type B receptor (EDNRB) (Table 1). Некоторые мутантные EDNRBs обладают сродством связывания дикого типа, но имеют нарушения связывания с Gq/11 белками (Imamura et al., 2000).
Большинство болезнь-вызывающих missense мутаций воздействуют на положение рецептора, которое очень сильно законсервировано в ходе эволюции. Напр., 62% от всех missense мутаций в AVPR2, которые вызывают NDI (see Table 1) имеют 100% консервацию положения аминокислот , но в 26% позиции варьируют между только двумя аминокислотами в ортологах AVPR2 позвоночных (Schöneberg et al., 2004). Следовательно, эволюционная консервация индивидуальных позиций внутри белка может служить в качестве предикативного инструмента для оценки функциональной значимости миссенс мутаций. В самом деле, имеется ряд биоинформационных инструментов, которые используют эволюционную информацию от автоматически генерируемого положения множественных последовательностей, многообразные особенности для описания функции и структуры белка (Ng and Henikoff, 2003; Adzhubei et al., 2010). О разумности такого подхода говорит тот факт, что разнообразие и консервация последовательностей данного белка является результатом длительного эволюционного процесса, характеризующегося постоянным накоплением мутаций, которые существенно отсортировываются с помощью естественного отбора. Вредные мутации, которые инактивируют жизненно важный белок, будут удаляться из популяции (очищающий отбор), тогда как сохраняющие функцию или благоприятные мутации будут увеличиваться в частоте с помощью дрейа и положительной селекции, соотв. Ранее мы тестировали такие методы систематической генерации данных по P2RY12 (Cцster et al., 2012) и естественно возникающим мутациям при моногенных болезнях (Schöneberg et al., 2018) и установили, что эволюционные данные делают возможными 92% правильных предсказаний относительно функциональной значимости missense мутаций (Schöneberg et al., 2018).
Инактивация с помощью мутаций или даже потеря генов GPCR не всегда приводит к тяжелой патологии. Используя крупные базы секвенирования экзома и генома показали, что более 90 генов GPCR человека были идентифицированы как обладающие гомозиготными или гемизиготными инактивирующими мутациями (Supplemental Tables 1 and 2). Такие GPCRs оказываются несцепленными с какими-либо известными болезнями человека, а люди, обладающие такими мутациями все были взрослыми без угрожающих жизни патологий. Напр., GPR33 является в основном псевдогеном в Европейской популяции, но интактный аллель имеет достоверно более высокую частоту в Юго-Восточной Азии (Rцmpler et al., 2005; Bohnekamp et al., 2010). Сходный паттерн интакный аллель и псевдоген в GPR33 был найден у крыс и песчанок, это позволяет предположить, что zoonotic патоген запускает распределение этого synergistic аллеля (Rцmpler et al., 2005; Bohnekamp et al., 2010). Можно даже предположить, что преимущества в приспособленности в данных условиях среды обусловливаются потерей определенных GPCR-обеспечиваемых функций. Напр., инактивация C-C motif chemokine receptor 5 (CCR5) вызывает некоторую резистентность к HIV и может даже приводить к позитивной селекции по этому локусу (Liu et al., 1996; Samson et al., 1996).

A. Partially Inactivating Mutations - Loss of Basal Activity


В классической двухуровневой модели, GPCRs рассматриваются как существующие в равновесии между активной и пассивной конформацией. Соотв., даже при agonist-unoccupied состоянии, субпопуляция рецепторов всегда находится в активном состоянии, в основе которого лежит базовая активность многих GPCRs. Чрезвычайно высокая базовая активность наблюдалась для нескольких десятков рецепторов дикого типа из всех классов GPCRs (Seifert and Wenzel-Seifert, 2002; Martin et al., 2015). Усиление базовой активности bombesin-like receptor type 3 (BRS3) было даже обнаружено как позитивно селектируемое у плацентных млекопитающих во время эволюции позвоночных (Tang et al., 2019). Следовательно, прирожденное свойство GPCR повышенной базовой активности может вносить существенный вклад в ей физиологическую роль и, соотв., потеря базовой активности может иметь патофизиологическое значение.
TSHR является лучше всего изученным примером присутствия высокой базовой активности в Gs protein/adenylyl cyclase/cAMP пути (Neumann et al., 2010b). Однако, физиологическое значение этой постоянной активности изучено плохо. , Скорее всего, существует биологическое значение для развития и функционирования щитовидной железы, поскольку врожденная и полная инактивация TSHR часто приводит к гипоплазии щитовиднй железы (Biebermann et al., 1997; Grasberger and Refetoff, 2017), тогда как центральный врожденный гипотиреоидизм из-за отсутствия TSH β-субъединицы, присутствуют при нормально развитой щитовидной железе (Medeiros-Neto et al., 1997). Можно предположить, что базовая активность TSHR достаточна, чтобы способствовать развитию и росту эмбриональной щитовидной железы, а низкие уровни тироидного гормона всё ещё обнаруживаются у пациентов с центральным гипотиреоидизмом. Имеется еще несколько др. примеров патофизиологического значения потери базовой активности рецептора. Мутанты MC4R и GHSR с редуцированной базовой активностью считаются причиной наследственного ожирения (Srinivasan et al., 2004) и familial short stature syndrome (Pantel et al., 2006), соотв.

B. Partially Inactivating Mutations - Alteration of Distinct Receptor Functions


Исследования последних 30 лет опровергли концепцию "one agonist-one receptor-one signal transduction pathway" на всех трех уровнях. Многие GPCRs обладают более чем одним естественным (даже эндогенным) агонистом. Напр., ранние исследования показали, что структурно родственные эндогенные лиганды (adrenaline, noradrenaline, dopamine) могут активировать β1 адренергические рецепторы (Weitl and Seifert, 2008). Идентифицированы разнообразные взаимно пересекающиеся активности между хемокинами и хемокиновыми рецепторами (de Munnik et al., 2015). Даже химически не родственные метаболиты могут быть эндогенными агонистами одного GPCR (напр., оба UDP и prostaglandin E2 glyceryl ester активируют P2RY6) и идентифицированы специфичные для лиганда позиции в кармане связывания P2RY6 (Brьser et al., 2017). Поэтому разумно предположить, что мутации могут избирательно затрагивать связывание только одного агониста, приводя к частичной LoF. Пока нет этому примеров с болезнью.
Гомо- и гетеро-олигомеризация GPCRs, сплайс-варианты и дополнительные белки, которые модифицируют специфичность, вносят дополнительный вклад в функциональную сложность GPCRs. Соединение данного GPCR со многими G белками после активации агонистом, скорее всего, довольно распространено (Gudermann et al., 1997). Хотя C конец и др. детерминанты α-субъединицы G белка, как известно, вносят вклад в специфичность взаимодействия G белка и рецептора (Okashah et al., 2019), детерминанты специфичности в последовательности рецептора остаются не установленными. Чтобы предсказать функциональное значение вариантов, обнаруживаемых в GPCRs, важно определить общие остатки и/или структуры внутри GPCRs, которые характеризуют места контакта G-белка и обеспечивают специфичность G-белков. В самом деле, имеется определенная конвергенция в путях внутримолекулярной активации, обеспечиваемая консервативными структурными перестройками остаточных контактов, которые высвобождают с G белком контактирующие остатки (Venkatakrishnan et al., 2016; Kayikci et al., 2018).
Более того, передача сигналов GPCR может также использовать arrestin-зависимые пути (Reiter et al., 2012) и ELMO/DOCK/Rac ось (Park et al., 2007; Weng et al., 2019) (Fig. 2). Подобная сложность функционирования GPCR может быть описана разными конформационными состояниями рецепторного белка. Базирующаяся на агонистах избирательность стабилизирует только субнабор конформаций рецептора, тем самым предпочтительно активируются определенные сигнальные пути. Теоретически все существующие свойства, вносящие вклад в полный набор функций данного GPCR, по-видимому, могут избирательно затрагиваться мутациями.
Исследования мутаций GPCR демонстрируют, что изменяются определенные функции рецептора и ассоциируют такие альтерации с человеческими фенотипическими подтипами, уже имеются некоторые примеры, показывающие патофизиологическое значение таких GPCR подфункций (Fig. 2). Напр., TSHR is способен стимулировать членов всех 4-х семейств G-белков (Laugwitz et al., 1996). Исследования мутагенеза идентифицировали позицию Y601 как молекулярного переключателя избирательности G-белка (Biebermann et al., 1998). Соотв., TSHR мутации Y601N обнаруживаются в токсических аденомах (Table 1), вызывающих постоянную активацию пути Gs protein/cAMP, но неспособных соединяться с Gq/11 белками (Arseven et al., 2000). В трансфицированных клетках Ca2+-sensing receptor (CASR) преимущественно усиливает inositol 1,4,5-trisphosphate и ингибирует продукцию cAMP. Некоторые вызывающие болезнь CASR мутации, как было установлено, переключают подобную предпочтительную передачу сигналов путем стабилизации конформаций рецептора, которые по-разному купированы с внутриклеточными сигнальными путями [напр., arrestin-biased передача сигналов (Gorvin et al., 2018)]. Более того, инактивирующие, вызывающие NDI мутации (R137H) в AVPR2 затрагивают законсервированный DRY мотив на C конце трансмембранной спирали 3, но они не нарушают соединения с G-белком (Schöneberg et al., 1998), но десенсибилизируют AVPR2 в отсутствие агониста из-за постоянной потребности в arrestin, который вызывает "constitutive desensitization" (Barak et al., 2001).
Мутационные альтерации димеризации и олигомеризации рецепторов являются довольно редкой причиной наследственных GPCR болезней (Fig. 2). Показано, что существуют три вызывающих пигментный ретинит missense мутации в RHO, ведущем себя как мономер, тогда как дикого типа функция RHO восстанавливается в липосомах в качестве димеров или мультимеров (Ploier et al., 2016). С др. стороны олигомеризация GPCRs может также вызывать доминантно-негативные эффекты, обусловленные сохранением рецептора дикого типа благодаря взаимодействию с мутационно укороченными рецепторами (Wise, 2012). Первое доказательство доминантно-негативного эффекта получено от сплайс-вариантов, укорачивающих gonadotropin-releasing hormone receptor (GNRHR) в seven-transmembrane helices domain (7TMD) (Grosse et al., 1997). Следовательно, разумно предположить, что укороченные или даже missense мутации могут сохранять или даже влиять на дикого типа GPCR, приводя к доминантным болезням, даже если мутации инактивирующие. Такие условия наблюдали также в metabotropic GRM1, которые обычно функционируют как димеры, и в которых мутации могут иметь доминантно-негативные эффекты, приводящие к мозжечковой атаксии с ранним началом (Watson et al., 2017). Сходный случай доминантных вариантов обычно аутосомно рецессивных болезней был описан для кровоточивости, вызываемой инактивирующей мутацией P2RY12 (Mundell et al., 2018).
Имеется несколько GPCRs, таких как aGPCRs, которые обладают крупными N концами со многими доменами. Такие крупные N концы необходимы для интеграции множественных внеклеточных сигналов, таких как связывание белок-лиганд, межклеточные контакты и даже механические силы, и трансформации их в униформные внутриклеточные сигналы посредством закрепленного агониста (Monk et al., 2015; Schöneberg et al., 2015, 2016). Мутации, следовательно, могут изменять определенные свойства, такие как предупреждение взаимодействия N-терминального домена GPR56 с коллагеном III, вызывая bilateral frontoparietal polymicrogyria (Luo et al., 2012). Адгезия GPCRs не только способна к передаче цис-сигналов (напр., активация G-белка), но и также к действию в качестве сигнала для др. рецепторов (trans-signaling) (Liebscher et al., 2013). На Caenorhabditis elegans и мышах было показано, что фенотипы, вызываемые полным нокаутом генов aGPCR могут быть частично восстановлены лишь на прикрепленном к мембране N конце (Prцmel et al., 2012; Patra et al., 2013; Duman et al., 2019), демонстрируя 7TMD-независимые функции N конца. В самом деле, анализ транскриптов определил, что архитектура домена N конца aGPCRs часто отличается, а N концы без или с неполным 7TMD якорем, а также с отдельным 7TMD часто происходят из одиночного aGPCR гена (Knierim et al., 2019). Следовательно, разумно предположить, что патофизиологические последствия мутаций в aGPCR генах, а значит и проявления болезни будут существенно отличаться в зависимости от того, какая функция aGPCR нарушена.

C. The Special Case - Pseudogenization of GPCRs


Псевдогены являются геномными элементами с ген-подобной структурой, екоторая не обладает функцией гена, из которого они происходят. Существует два основных класса псевдогенов: преобразованные псевдогены, которые происходят из РНК промежуточных образований, и не подвергшиеся процессингу псевдогены, которые возникают в результате дупликаций во время репликации. Единичные псевдогены относятся к специальному классу непреобразованных псевдогенов, которые формируются без удвоения, один оригинальный ген инактивируется в результате мутации , так что не остается функциональной копии гена (Cheetham et al., 2020). Инактивирующие мутации (missense, frameshifting, deletion, insertion, splice site, premature nonsense mutation) генов могут рассматриваться как первая ступень процесса, ведущего к образованию псевдогена одной из копий. Со временем этот неактивный вариант будет накапливать дальнейшие альтерации (loss of constraint) помимо распознавания. В зависимости от использованных методов, используемых для идентификации псевдогенов, 8000 - 14700 потенциальных псевдогенов всё ещё обнаруживается в геноме человека (Pei et al., 2012; Cheetham et al., 2020). Среди них более чем 3500 являются непреобразованными псевдогенами, которые также содержат многие происходящие из GPCR последовательности (напр., 5-HT-7, Y6R, GNRHR2). Около 25% от всех непреобразованных псевдогенов всё ещё транскрибируются. Как и аллели активных генов псевдогены также могут увеличиваться в количестве в популяции до тех пор пока не наступит фиксация благодаря дрейфу, генетическому узкому горлышку, hitchhiking с помощью соседних позитивно отбираемых генов или положительного отбора самих инактивированных генов.
Псевдогены обычно не находтся в фокусе наследуемых фенотипов или болезней. Однако, репертуар псевдогенов отличается между индивидами из-за неполной фиксации инактивированного гена у некоторых индивидов и популяций. Классическими примерами таких случаев являются хемокиновые рецепторы Duffy антигена и CCR5. Отсутствие экспрессии Duffy антигена или инактивирующие мутации в Duffy создают определенной степени резистентность против форм малярии (Plasmodium vivax) (Tournamille et al., 1995; Tamasauskas et al., 2001). Наиболее частый Duffy вариант FY*0 приблизительно существует 58000 лет (McManus et al., 2017). Сходным образом, обнаружена защитная роль против инфекции HIV и прогрессирования AIDS благодаря псевдогенизации CCR5 за счет делеции в 32 аминокислоты (CCR5-Δ32) (Dean et al., 1996; Liu et al., 1996; Samson et al., 1996). Аллель CCR5-Δ32 возник приблизительно 5000 лет тому назад и всё ещё ведутся споры, действительно ли его появление согласуется с историческим селективным событием (Stephens et al., 1998; Novembre et al., 2005; Hedrick and Verrelli, 2006; Bouwman et al., 2017). Однако, идентификация лиц с HIV-1 инфекцией и гомозиготных по CCR5-Δ32 подтверждает доказательства, что отсутствие функционального CCR5 на клеточной поверхности не обеспечивает абсолютную защиту от HIV-1 инфекции (Smoleё-Dzirba et al., 2017).
GPR33 является orphan chemoattractant GPCR, которые ранее идентифицировался как псевдоген у людей (Marchese et al., 1998). Анализ человеческих индивидов показал, что интактный аллель GPR33 всё ещё присутствует в популяции людей (Rцmpler et al., 2005). Подсчеты возраста hominin аллелей подтверждают инактивацию в течение последнего 1 миллиона лет. Исследование крупного секвенирования экзома [собранного в Genome Aggregation Database (gnomAD), (Karczewski et al., 2020)] подтвердило высокую частоту интактного аллеля в Азиатских популяциях (3.5%-6%), даже существование гомозиготных индивидов и значительно более низкую частоту в Африке (1.5%) и Европе (0.2%). Существует 14 дополнительных инактивированных вариантов в GPR33, при этом вариант со сдвигом рамки считывания (rs58865778) с более высокой частотой присутсвует в Африканских популяциях (2%) и почти отсутствует в Азиатских и Европейских популяциях. Следовательно, GPR33 принадлежит к классу редких псевдогенов, которые имеют выводящие из строя мутации в упоминаемом геноме, но являются интактными у некоторых индивидов (Cheetham et al., 2020). GPR33, по-видимому, участвует во врожденном иммунитете, что подтверждается его экспрессией в тканях, имеющих отношение к иммунитету, и функциональными исследованиями (Rцmpler et al., 2005; Bohnekamp et al., 2010; Morri et al., 2018). Случайная инактивация и её фиксация у некоторых видов, удаленно связанных с млекопитающими (Rцmpler et al., 2005), подтверждает селективное давление, связанное с иммуной реакцией на ген рецептора хемоаттрактанта.
Free fatty acid receptor 3 (FFAR3 или GPR41) и GPR42, ранее рассматривались как псевдогены, это два тесно связанные GPCRs, при этом FFAR3 является рецептором коротких жирных кислот (Brown et al., 2003). Мутагенные исследования ранее показали, что позиция аминокислоты 174 важна для передачи функциональных сигналов, поскольку конверсия R174 (найденная в FFAR3) в W174 (найденная в GPR42) замалчивает реакцию на коротко-цепочечные жирные кислоты, возникает возможность, что GPR42 может быть неактивным псевдогеном. Однако, в GPR42 Trp обнаруживается в позиции 174 только в 26% и 39% исследованных популяций (Liaw and Connolly, 2009; Puhl et al., 2015). Повторно исследовав частоту аллеля в gnomAD (Karczewski et al., 2020), мы обнаруживали, что вариант R174 является доминирующим в Европкйских популяциях (89%), но менее частый в Африканских (68%) и Восточно-Азиатских популяциях (33%). Следовательно, вариант R174 в GPR42 следует пересмотреть как функциональный GPCR , а вариант W174 как унитарный псевдоген.
Эти примеры требуют тщательного пересмотра генов, ранее рассматриваемых как псевдогены. Во всяком случае образование псевдогенов из первоначально интактных GPCR генов является компромисом между неблагоприятным и и даже благоприятным фенотипами и функциями, связанными с этими генами GPCR в данном внешне-средовом окружении.

V. Activating Mutations in GPCRs-GoF


A. Agonist-Independent GoF


Концепция, что мутации могут активировать GPCRs и вызывать болезни была предложена на базе сайт-направленного мутагенеза в α1 adrenergic рецепторе в начале 90s (Allen et al., 1991). Вскоре после этого наследственные болезни, такие как hyperthyroidism (Parma et al., 1993), male precocious puberty (Shenker et al., 1993), и retinitis pigmentosa (Rao et al., 1994), были описаны как результат постоянной активации GPCRs. Приблизительно 21% от всех моногенных болезней, связанных с мутациями в GPCR генах, вызывается активирующими мутациями (Table 1). Однако, только 1% индивидуальных мутаций в GPCRs приведен в Table 1 как ответственные за наследственные и приобретенные генетические болезни. Большинство являются missense мутациями (~95%), и лишь немногие являются делециями или перестройками. Сегодня, GoF объясняются высвобождением рецептора из неактивного состояния, связанного с конформационными ограничениями или генерацией новых взаимодействий, которые стабилизируют активное состояние (Parnot et al., 2002) (Fig. 3). Как следствие, рецептора фосфорилирование, интернализация и десенсибилизация также могут активироваться при изменении конформации рецептора. Однако, существует только частичное перекрывание последних последствий и активации G-белка. Большинство активирующих мутаций найдено в трансмембранной спирали GPCRs непосредственно запускающих конформационные изменения 7TMD (Tao, 2008) (Fig. 3). В целом не существует достоверных сайтов, обогащенных мутациями внутри 7TMD GPCRs, вызывающих конституитивную активацию рецептора. Однако, в рецепторах glycoprotein гормона, активирующие мутации довольно гомогенно распределены в трансмембранных спиралях за двумя исключениями: 1) отсутствуют активирующие мутации, обнаруживаемые в трансмембранной спирали 4, и 2) большинство активирующих мутаций накапливается во всей трансмембранной спирали 6 (Kreuchwig et al., 2013). Большинство активирующих мутаций являются missense мутациями, но небольшие in-frame делеции в третьей внутриклеточной петле TSHR также могут вызывать независимую от лиганда активацию рецептора (Wonerow et al., 1998). Интересно, что некоторые вызывающие болезнь мутации были идентифицированы во внеклеточных петлях и на N конце TSHR (Grьters et al., 1998; Kleinau et al., 2007). Это предполагает, что такие мутации воспроизводя соединение с агонистом, происходящим во внеклеточных петлях, и экспозицию или изомеризацию интегральных агонистов как в случае рецепторов glycoprotein гормона (Brьser et al., 2016) (Fig. 3).
Согласно концепции равновесия между активными и неактивными конформациями, общее количество данного рецептора определить затруднительно в отношении базовой активности, независимой от агониста (see above). Следовательно, мутации, которые увеличивают экспрессию рецептора на клеточной поверхности, способствуют транспорту рецептора или его рециклингу или снижают деградацию рецептора, будут увеличивать базовую передачу сигналов G-белка. Имеются сообщения, показывающие увеличение экспрессии на клеточной поверхности, и , значит, базовую передачу сигналов рецептора из естественно возникающих вариантов GPCR [гапр., GPR133 (Fischer et al., 2016)]. Однако, значение таких механизмов для возникновения болезней или фенотипических отклонений изучено плохо и требует к себе большего внимания.

B. Agonist-Dependent GoF


Существуют редкие случаи, при которых GoF вызывается разными молекулярными механизмами, отличными от независимой от агонистов активации рецепторов (Fig. 3). Специфические случаи GoF были обнаружены у пациентов с hyperthyroidism, у которых мутации в гормон-связывающем домене позволяли TSHR соединяться со структурно сходным гликопротеиновым гормоном human choriogonadotropin (hCG). Было показано, что мутантный TSHR после этого оказывался чувствительным к концентрациям hCG во время беременности (Rodien et al., 1998; Coulon et al., 2016). Мутация на N конце CASR с существенным сдвигом влево чувствительной к концентрации кривой агониста, была обнаружена при аутосомно доминантной hypocalcemia (Vargas-Poussou et al., 2002). Пародаксальная GoF была обусловлена совместной экспрессией дикого типа PROKR2 и инактивирующей мутации в PROKR2 у пациента с преждевременны половым созреванием (Fukami et al., 2017) и была подтверждена in vitro (Sposini et al., 2015).
Фосфорилирование GPCRs после активации сопровождается рекрутированием arrestin, это является одним из механизмов для выключения передачи сигналов рецептора. Имеется несколько случаев, при которых доминантный пигментный ретинит вызывается мутациями на RHO C конце (Apfelstedt-Sylla et al., 1993; Restagno et al., 1993). Было показано. что эти мутации приводят к дефектам фосфорилирования рецептора и рекрутированию arrestin и в результате к избыточной передаче сигналов (Song et al., 2009) (Fig. 3). Сходным образом, некоторые мутации в MC4R приводят к агонистом индуцированной склонности к Gs-белку и передаче сигналов β-arrestin. Повышенное агонистом-индуцированное рекрутирование β-arrestin коррелирует с более низким показателем массы тела и показателем ассоциированной болезни (Lotta et al., 2019).
Однако, повышенная базовая активность не всегда может быть результатом мутаций, но может возникать из-за присутствия эндогенных агонистов. GPCR , активируемые метаболитами (Tan et al., 2017) и orphan GPCRs, для которых эндогенные агонисты пока неизвестны, могут возникать с конституитивной активностью. Роль таких эндогенных агонистов нельзя исключить особенно в нативных клеточных системах. Напр., ATP/ADP P2Y рецепторы и их мутанты могут возникать как постоянно действующие из-за высвобождаемых нуклеотидов. Поэтому функциональные методы нуждаются в соотв. контроле, таком как при изучении apyrase, которая деградирует ATP в AMP (Schmidt et al., 2013).

VI. Other Causes of GPCR Dysfunctions


A. Gene Dosage as Cause of GPCR-Related Pathologies


У диплоидных организмов, два аллеля определяют дозу гена, необходимую для поддержания физиологической функции продуктов гена. Отклонения в дозе гена могут возникать в обоих направлениях, снижения и увеличения (Fig. 4). Вариации количества копий генов могут возникать с помощью механизмов, базирующихся на рекомбинации и репликации. В большинстве случаев LoF один аллель не вызывает патологического фенотипа, поскольку аллель дикого типа может его компенсировать. Однако, имеются случаи, при которых LoF одног из аллелей приводит к частичному или полному болезненному фенотипу, наз. гаплонедостаточностью. Гаплонедостаточность объясняет доминирование вредного аллеля у диплоидных организмов. Напр., мутации в EDNRB, вызывающие Waardenburg syndrome type II (Table 1), были найдены в гетерозиготном состоянии (Issa et al., 2017). Гаплонедостаточность можно также объяснить мутациями в TSHR, вызывающими hypothyroidism (Moia et al., 2013), микроделециями PROKR2 у пациента с врожденным hypopituitarism и дефицитом гормона роста (Parsons et al., 2017), делецией FZD4 у пациентов с exudative vitreoretinopathy (Li et al., 2006), и микроделециями MC4R у пациентов с ожирением (Cody et al., 1999). Недавно было показано, что гаплонедостаточность по MC4R локусу может быть устранена, по крайней мере, у мышей путем увеличение дозы гена (Matharu et al., 2019).
Одна из специфических форм редукции дозы гена аллеля связана с X-хромосомными болезнфми. Обычно, только у самцов затрагиваются инактивирующими мутациями X-хромосмные гены из-за гемизиготности. У самое инактивация X хромосомы возникает обычно случайно, генерируя инактивацию 50:50 одной из X хромосом. Однако, skewed инактивация Х хромосомы возникает. когда одна Х хромосома главенствует над другой, приводя к неравному количеству клеток с разными инактивированными хромосомами. Когда X хромосома несет измененный аллель, то у каждой может развиваться болезнь. В самом деле, имеются случаи, когда индивидуальные самки обнаруживают полную симптоматику NDI, вызываемую мутациями в AVPR2 (Nomura et al., 1997; Sangkuhl et al., 2004; Bцselt et al., 2012). Имеются также сообщения о skewed X-хромосомной инактивации, вызывающей голубых колбочек монохроматию (Table 1) с помощью гетерозиготной long wavelength- (red) sensitive opsin (OPN1LW) LoF мутации (Frederiksen et al., 2013).
Геномный импринтинг - это моноаллельная и зависимая от родительского происхождения экспрессия субнабора генов. Мутации в таких импринтируемых генах могут вызывать болезни человека даже в гетерозиготном состоянии, в зависимости от родительского происхождения. Напр., синдром Angelman является болезнью, вызываемой функциональной потерей матерью экспрессируемой ubiquitin protein ligase E3A. Приблизительно 100 генов было идентифицировано в качестве чувствительных к импринтингу у людей (http://www.geneimprint.com/), но среди них имеются только два GPCRs: GPR1 (отцовский) и calcitonin receptor (материнский). Для HTR2A (материнский), имеются спорные данные относительно значимости импринтинга этого локуса. Ни один из этих генов не связан с наследственными болезнями у человека.
Половой диморфизм, описывает разные характеристики у двух полов одного вида, благодаря различиям их половых органов. Импринтинг и sex-обусловленная транскриптомная экспрессия объясняют половой диморфизм. У взрослых людей, 24 GPCRs достоверно обнаруживают зависимую от пола экспрессию ( p-value менее 0.05) (Shi et al., 2019), сюда входят GPCR с болезнью связанный kisspeptin рецептор (KISS1R), GHSR, tachykinin receptor 3 (TACR3), и ADGRG1. Поэтому вполне возможно, что фенотипы, вызываемые мутациями с пол-зависимой экспрессией GPCRs могут отличаться. Рецептор гликопротеинового гормона [LH/hCG receptor (LHCGR)] сам по себе является пол-обусловленным из-за его экспрессии в яичниках. Theca клетки и клетки Leydig семенников регулируют специфические функции гонад. Интересно, что активирующие мутации в LHCGR доминируют только у самцов, вызывая ограниченное самцами преждевременное половое созревание, и не проявляются у переносчиков самок. Температурная чувствительность некоторых LHCGR мутантов (Jaquette and Segaloff, 1997), низкая экспрессия LHCGR у prepubertal девочек и потребность в LH и follicle-stimulating гормоне для индукции половозрелости могут служить объяснением (Themmen and Huhtaniemi, 2000). Интересно, что в отличие от женщин с активирующей LHCGR мутацией D578G, которые вполне нормальны, самки мышей, несущие соотв. активирующую мутацию D582G бесплодны из-за нерегулярности цикличности течек (estrous) , отсутствия овуляции и преждевременного полового созревания (Hai et al., 2015).
Почти все GPCRs были найдены содержащие микроскопические хромосомные делеции или дупликации, при этом многие из них вызывают синдромальные болезни (see https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/; https://decipher.sanger.ac.uk/) (Firth et al., 2009) (Fig. 4). GPCRs, включающие крупные хромосомные аберрации могут вносить вклад в клинические фенотипические отклонения; однако, индивидуальное действие четко установлено по сравнению с др. делециями и дупликациями. Субмикроскопические структурные вариации (1 kb - 5 Mb), включая дупликации, инверсии и более сложные перестройки, широко распространены в нормальном геноме человека и могут увеличивать дозу гена без видимого проявления. Напр., повторы небольшого числа копий, дупликации и инверсии в гене vasoactive intestinal peptide receptor 2 широко распространены в здоровой популяции (Beri et al., 2013). Однако, такие вариации числа копий могут влиять на чувствительность к некоторым состояниям. подобных шизофрении (Jin et al., 2016) и аутизму (McLysaght et al., 2014; Firouzabadi et al., 2017), подобно тому, как это происходит в случае vasoactive intestinal peptide receptor 2 или при различиях в числе копий glutamate рецепторов, вносящих вклад в attention-deficit/hyperactivity нарушение (Elia et al., 2011). Сегодня имеется только один пример, демонстрирующий, что локус, содержащий дупликацию GPCR, приводит к наследственной болезни: увеличение количества копии GPR101 (locus duplication) вызывает X-сцепленный acrogigantism и acromegaly (Trivellin et al., 2014, 2018; Beckers et al., 2015; Rodd et al., 2016; Hou and Tao, 2019).

B. Messenger RNA Processing Events as Cause of GPCR-Related Diseases


Данные высоко-производительного секвенирования транскриптомов и геномов революционизировали наше понимание альтернативного сплайсинга и использования промоторов. Путем сравнения вариантов транскриптов и геномов, были установлены многие события преобразования мРНК, такие как старт транскрипции, сплайсинг и полиаденилирование. Альтернативный сплайсинг включает пропуск экзонов, сохранение интронов и удаление скрытых интронов. Высокая сложность ещё сильнее усложнилась за счет альтернативного использования промоторов и ткане-специфичности сплайсинга. GPCR гены также подвергаются ряду событий преобразования РНК. Более половины от всех генов GPCR, не связанных с обонянием, содержат более одного белок-кодирующего экзона (Markovic and Challiss, 2009), включая некоторые с более, чем 50 экзонами (Knierim et al., 2019), всё это дает множественные варианты GPCR , происходящие из одного гена. o
Хотя не существует достоверных отличий в скорости nonsynonymous мутаций (60.2 ± 18.1 против 66.6 ± 23.5 nonsynonymous SNP/100 кодонов) между GPCRs без и с интронами в их кодирующем регионе, патогенные альтерации сплайсинга, вызываемые точковыми мутациями в местах сплайсинга продолжают обнаруживаться, выступая в качестве важного механизма, с помощью которого генные мутации вызывают болезни человека (Fig. 4). Тщательное профилирование транскриптома может выявлять такие болезнь-вызывающие варианты в дополнение к простым вариантам генов в кодирующем регионе (exome profiling). Кроме того, мутации сплайс-акцепторов или донорских сайтов, мутации во вспомогательных цис-регуляторных элементах, также как и варианты интронов и экзонов могут затрагивать собственно сплайсинг и генерировать неправильно сплайсированные мРНК в значительной степени (Xiong et al., 2015). Следовательно, патогенные сплайс-мутации могут избегать идентификации или правильной интерпретации с помощью секвенирования, поскольку они не отличимы от нейтральных полиморфизмов. Мутации могут также затрагивать деликатный баланс вариантов танскриптов, продуцируемых с помощью альтернативного сплайсинга экзонов и тем самым вызывать болезни. В самом деле, в исследованиях neurofibromatosis type 1 и ataxia telangiectasia, при которых производили анализ и ДНК и РНК, приблизительно 50% пациентов обнаруживали болезнь из-за мутаций в результате аномального сплайсинга. Из этих мутаций 11%-13% были неправильно классифицированы как мутации сдвига рамки считывания, missense или nonsense мутации, когда анализ ограничивался только геномными последовательностями и их влияние на сплайсинг было пропущено (Baralle and Baralle, 2005).
В 18 GPCRs, измененный сплайсинг был обнаружен как причина связанных с GPCR болезней (Table 1). Большинство мутационных изменений последовательностей нуклеотидов донорских и акцепторных сплайс-сайтов, с расположенными по флангам кодирующими экзонами [напр., в GPR143 (Mayeur et al., 2006)] (Table 1). Как следствие такой потери сплайс-сайта, интроны не удалялись или пропуск экзонов приводил к сдвигу рамки считывания , инсерциям или потере кодирующей последовательности (Baralle and Baralle, 2005). Известны редкие случаи, при которых добавляется сплайс-сайт в экзон или интрон, возникает связанная с GPCR болезнь. Напр., при RHO, мутация c.620T>G генерирует сильный сплайс акцепторный сайт приводя в результате к делеции в 90-bp in-frame и неправильной локализации белка in vitro и in vivo (Riedmayr et al., 2020). При X-сцепленной NDI, новая мутация c.276A>G создает новый сплайс ацепторный сайт, приводя к 5' укорочению AVPR2 экзона 2 (Schernthaner-Reiter et al., 2016).

C. Altered and Ectopic Expression of GPCRs


1. Promoter Mutations


Помимо мутаций в кодирующем регионе GPCR, альтерации в регионах, регулирующих экспрессию, могут вызывать GPCR-родственные патологии (Fig. 4). Один из первых примеров был идентифицирован у пациентов с blue cone monochromacy, при которой делеция вышестоящего локуса контролирующего регион X-chromosomal red opsin (OPN1LW) и green opsin (OPN1MW) привела к потере экспрессии обоих опсинов (Wang et al., 1992; Smallwood et al., 2002). Варианты в промоторной области GPCRs человека влияют на уровень их экспрессии и, следовательно, имеют патофизиологические последствия [напр., для промотора человеческого N-formyl peptide receptor 2 гена (Simiele et al., 2012)]. Также резистентность к малярии, вызываемой паразитом Plasmodium vivax может быть обусловлена инактивирующими мутациями в хемокиновом рецепторе (Duffy antigen) (Parasol et al., 1998), а также мутациями в промоторе Duffy, приводя к снижению уровней экспрессии рецептора (Tournamille et al., 1995). Некоторые мутации в промоторах dopamine рецепторов DRD4 и DRD5 оказались ассоциированы с attention-deficit/hyperactivity нарушением (Kustanovich et al., 2004). Экспериментально подтвержденые мутации в промоторном регионе GPCRs, демонстрирующие причинную связь с наследственными болезнями, возникаю довольно редко. Было показано, что снижение экспрессии рецептора гормона роста-релизинг гормона обусловлено мутацией сайта связывания транскрипционного фактора Pit-1, что вызывает дефицит гормона роста (Salvatori et al., 2002) (Table 1). Интересен случай с 15-bp делецией в регуляторном регионе GPR56 (ADGRG1), приводящий к локальному нарушению экспрессии GPR56, в результате возникает restricted polymicrogyria, ограниченная корой, окружающей Sylvian fissure (Bae et al., 2014). Зависимые от менструального цикла лихорадочные эпизоды, по-видимому, вызываются мутациями промотора serotonin receptor HTR1A, нарушающей уровни экспрессии рецептора (Jiang et al., 2012).

2. Untranslated Region and Intronic Mutations


Регуляторные элементы, которые определяют уровни экспрессии и стабильность мРНК, могут обнаруживаться в промоторном регионе, а также внутри т. наз. 5'- и 3'-нетранслируемых регионов (UTRs) в мРНК и в интронных регионах. Такие цис-действующие регуляторные РНК элементы являются связывающими сайтами для длинных некодирующих РНК, G-quadruplex структур, короткой открытой рамки считывания (ORFs) и для internal ribosome entry sites (IRESs) (Leppek et al., 2018). Мутации таких регуляторных частей не являются немедленно очевидными, но могут влиять на функцию гена. В противовес аппарату трансляции у прокариот рибосомы млекопитающих обычно не транслируют нижестоящий цистрон бицистронных мРНКA. Имеется два исключения из общего правила. Первым является то, что когда первая ORF коротка (менее ~30 кодонов, "minicistron" или upstream ORF), то аппарат трансляции оценивая сканирование в направлении 5' - 3' повторно возобновляет трансляцию нижестоящего AUG кодона. Вторым исключением являются IRES, позволяющие cap-независимую инициацию трансляции. В GPCR генах были идентифицированы вышестоящие ORF, такие как в β2 adrenergic рецепторе и в corticotropin-releasing hormone receptor 1, кодирующем небольшие пептиды, которые действуют как ингибиторы трансляции рецептора (Parola and Kobilka, 1994; Xu et al., 2001). Cap-независимая трансляция посредством IRES элемента обнаружена экспериментально для angiotensin II receptor type 1 (Martin et al., 2003). Недавно представлена база данных (http://reprod.njmu.edu.cn/cgi-bin/iresbase/index.php) представившая потенциальные IRES в 27 GPCR мРНК человека (Zhao et al., 2020). Значит мутации в 5'-UTR необходимо учитывать; однако, согласно нашим данным не существует экспериментально подтвержденных примеров GPCR-связанных болезней. Хотя некоторые GPCRs (CXCR5, GPR34 и некоторые обонятельные рецепторы) содержат SNPs в своих IRES последовательностях и еще предстоит определить, действительно ли они влияют на трансляцию ORF рецепторов.
Регион, расположенный ниже ORF, играет важную роль в регуляции формирования мРНК 3' конца, экспорта в ядро, в субклеточной локализации, трансляции и деградации (Mayr, 2017). Средняя длина 3'-UTR зрелой человеческой мРНК составляет примерно 1200 нуклеотидов, в 6 раз больше, чем в среднем 5'-UTR (Mayr, 2016). Поэтому 3'-UTRs богаты регуляторными элементами, которые могут быть идентифицированы с помощью web-based инструментов (Grillo et al., 2010; Dassi et al., 2014) (http://aura.science.unitn.it; http://utrdb.ba.itb.cnr.it). Имеются подсчеты, что приблизительно 0.2% из всех известных ассоциированных с болезнями мутаций расположены в 3' регуляторном регионе (Chen et al., 2006). Хотя имеется ряд SNPs в 3'-UTRs, ассоциированных с GPCRs болезнями [напр., шизофрения и 3'-UTR SNP в GPR85 (Matsumoto et al., 2008)], экспериментальные подтверждения всё ещё отсутствуют.

3. Gene Fusion Events and Ectopic Expression


Слияние генов в результате хромосомных перестроек, инициируемых разрывами двойной нити ДНК, могут вызывать эктопическую экспрессию и/или изменять экспрессию генов. altered gene expression. С появлением методов высоко-производительного секвенирования, слияние генов может быть легко обнаружено с помощью секвенирования геномной ДНК и мРНК. Многочисленные слияния генов с участием генов GPCR выявлены с помощью таких методов, в большинстве случаев без прямой клинической корреляции (https://ccsm.uth.edu/FusionGDB/) (Kim and Zhou, 2019), но некоторые ассоциировали с раком (https://fusionhub.persistent.co.in/) (Panigrahi et al., 2018) (Fig. 4). Напр., ген рецепторной тирозин киназы был найден слитым на геномном и мРНК уровне с ADGRG7 (GPR128) у здоровых людей (Chase et al., 2010). Транслокация локуса тяжелой цепи иммуноглобина на ген GPR34 в Xp11.4 [t(X;14)(p11.4;q32.33)] часто ассоциирует с раком. Как следствие это слияние усиливает активность GPR34 мРНК, а аберрантная экспрессия GPR34 была обнаружена в ассоциированной со слизистой лимфоидной ткани лимфомы (Ansell et al., 2012; Baens et al., 2012; Akasaka et al., 2017). При этом Gi белок, сцепленный с GPR34, скорее всего, управляет пролиферацией клеток путем активации пути mitogen-activated protein kinase, поскольку локус immunoglobulin heavy chain управляет высокой экспрессией и высокой базовой активностью рецепторов Т (Schöneberg et al., 2018). Также регуляторные элементы генов GPCR могут способствовать онкогенезу. Высокая частота слияний, наблюдаемая в регионе 5' orphan GPCR P2RY8 и в кодирующем регионе type I cytokine receptor cytokine receptor-like factor 2 (CRLF2), обнаруживается при B-progenitor acute lymphoblastic leukemia (Mullighan et al., 2009; Hertzberg et al., 2010; Nikolaev et al., 2014).
Эктопическая экспрессия GPCRs часто обнаруживается при онкогенезе и метастазировании (Marэn and Chen, 2004; Qu et al., 2004; Boire et al., 2005; Tang et al., 2013; Zhao et al., 2019). Первая связь между клеточной трансформацией и GPCRs была описана в 1986 при идентификации MAS онкогена (Young et al., 1986). Пионерская работа группы Gutkind предложила концепцию хронической активации GPCRs, которая может приводить к трансформации клеток (Gutkind et al., 1991). Позднее эта концепция была подтверждена путем идентификации соматических активирующих мутаций в некоторых GPCRs, вызывающих аденомы и карциномы (Table 1). Избыточная экспрессия GPCRs и достоверные связи между экспрессией GPCR и величиной жизнеспособности найдены в многочисленных опухолях (Sriram et al., 2019), это делает GPCRs потенциальными мишенями при терапии рака (Insel et al., 2018; Wu et al., 2019).
Помимо геномных перестроек слияние кодирующих экзонов GPCRs с др. промоторами (see above) или мутации, связанные с регуляцией, в промоторных регионах (Chevalier et al., 2014), нарушения регуляции экспрессии GPCR, по-видимому, вызываются их эктопической экспрессией. Напр., aGPCR ADGRD1 (GPR133) обычно не (очень) экспрессируется в глиальных клетках. В регионах гипоксии глиобластомы экспрессия ADGRD1 существенно увеличивается из-за локальной гипоксии, драйвера опухолевого роста и является прогностическим маркером злокачественности (Bayin et al., 2016). В этом случае показано участие hypoxia-inducible factor 1с.
Специальная форма эктопической экспрессии GPCRs обусловлена интродукцией активных рецепторов, кодируемых вирусным геномом (Arvanitakis et al., 1997; Montaner et al., 2013). Некоторые вирусы герпеса человека несут GPCR гены в своем геноме, демонстрируя высочайшую гомологию с хемокиновыми рецепторами человека. Было показано, что вирусные GPCRs hijack рецепторами обусловленные пути сигнальной трансдукции способствуют жизнеспособности хозяина, репликации и патогенезу. Постоянная активность многих вирусных GPCRs вносит существенный вклад в эти процессы (Montaner et al., 2013; Vischer et al., 2014). Напр., конституитивная, зависимая от агониста активность вирусного GPCR ORF74, кодируемая Kaposi sarcoma-associated вирусом герпеса, вносит существенный вклад в вирусом управляемую злокачественность (Arvanitakis et al., 1997). Постоянно активный GPCR , кодируемый вирусом Epstein-Barr, подавляет на клеточной поверхности экспрессию major histocompatibility complex class I , это является частью стратегии уклонения от иммунитета этого вируса (Zuo et al., 2009; Fares et al., 2019).

D. GPCR-Related Diseases Caused by Mutations in More than One Gene


В количественной генетике эпистаз означает любое неаддитивное взаимодействие между генами. В наследственных болезнях эпистазом описывается взаимодействие двух или более генетических локусов, которое может существенно модифицировать тяжесть болезни ("genetic modifier") или приводить к совершенно новому фенотипу. Секвенирование всего экзома или генома предоставило огромные количества информации о генетической изменчивости у людей, позволяющей идентифицировать дигенные и олигогенные наследственные болезни. Обусловленное двумя генами наследование (DI) рассматривается как патология с простейшей формой мультигенной этиологии, с вовлечением боле одного гена. Как было предположено Deltas (2018), различаются несколько форм. Во-первых, важным элементом настоящего DI является то, что пациент обнаруживает болезнь только когда две мутации в отдельных генах наследуются совместно. Обе мутации необходимы и достаточны, чтобы вызывать определенные клиническим симптомы. Во-вторых, DI также имеет место, когда патогенные мутации ответственны за две самостоятельные болезни, которые наследуются совместно, приводя к смешанному фенотипу. Тогда у пациента присутствует комбинация симптомов, характерных для двух индивидуальных моногенных болезней. В-третьих, сценарий псевдо-DI имеет место, когда клинические симптомы, вызываемые одиночной мутацией, причиной наследственной болезни, модифицируются вторичными вариантами разных генов ("genetic modifier").
Во многих генетических мышиных моделях потеря функции GPCR в комбинации с др. дефектными генами c вносит вклад в очевидные патологии. Даже комбинация двух разных дефицитов GPCR может приводить к фенотипическим отклонениям. Напр., хотя потеря GPR116 или ADGRL4 по отдельности у мышей не оказывает существенного эффекта на функцию серечно-сосудистой системы и почек, мыши, лишенные обеих обнаруживают аномалии в артериях дуги аорты и в кардиальном тракте оттока (Lu et al., 2017). Сходным образом, triacylglycerol индуцируемое увеличение в плазме GLP-1 лишь едва снижает уровень рецептора свободных жирных кислот FFAR1 или FFAR4, но двойные FFAR1- and FFAR4-дефицитные мыши резко отличаются (Ekberg et al., 2016).
В противовес примерам настоящие DI с участием, по крайней мере, одного GPCR гена редки у людей (Table 3). Гетрозиготные мутации FZD4 ответственные за семейную exudative vitreoretinopathy (Table 1) были найдены совместно с гетерозиготными мутациями в др. генах, также известных как причина наследственных exudative vitreoretinopathy (Li et al., 2018). Сходным образом, гетерозиготные LoF мутации в PROKR2 (Table 1) вместе с мутацией в WD repeat domain 11 белке, который нарушает его способность соединяться с его функциональным партнером, гомеобоксным белком empty spiracles homeobox 1, были найдены у пациентов с синдромом pituitary stalk interruption (Kallmann-подобный фенотип) (McCormack et al., 2017). Также пациенты, гетерозиготные по мутации PROKR2 оказались гетерозиготными по мутациям в гене KAL1, подтверждая возможность DI (Dodщ et al., 2006; Sarfati et al., 2013). Скрининг базы данных DI (Gazzo et al., 2016), позволил найти гетерозиготные LoF мутации ADGRV1 (GPR98) в комбинации с инактивирующими мутациями в MYO7A, MYO6 или PDZD7, генов, как известно, вызывающих подтипы синдрома Usher.

TABLE 3 Digenic inheritance of GPCR-caused diseases. Data were taken from the digenic diseases data base DIDA (http://dida.ibsquare.be) and the indicated literature.

Имеются многочисленные сообщения о вариантах GPCR становящихся генетическими модификаторами болезней человека. Хотя такие варианты не могут непосредственно вызвать болезни, они, по-видимому, являются факторами риска и модификаторами болезней и реагируют на внешне-средовые факторы, стрессы и лекарства. Для изучения таких GPCR вариантов и модифицированных фенотипов м рекомендуем обратиться к PhenoModifier базе данных (https://www.biosino.org/PhenoModifier/index) (Sun et al., 2020), которая содержит несколько десятков упоминаний, связанных с GPCR вариантами. Помимо GPCR вариантов, которые могут синергически способствовать связанным с болезнями путям, мутации в GPCRs также могут противодействовать дисфункции др. генов и позитивно модифицировать тяжесть болезни. В самом деле, P2RY2 полиморфизмы могут оказывать влияние на приток Ca2+ в эпителии воздушных путей пациентов с кистозным фиброзом (Bьscher et al., 2006). Сходным образом, естественно возникший вариант β2-adrenergic рецептора (Gly16Glu27) является более частым у пациентов с кистозным фиброзом. В этом случае усиленная функция рецептора, а занчит и активированного cystic fibrosis transmembrane conductance регулятора активности может быть ответственна за нормализацию фенотипа кистозного фиброза (Steagall et al., 2007).
На сегодня имеется только 4 примера DI болезней у людей, при которых разные GPCR гены несут LoF мутации (Table 3). Напр., комбинация двух гетерозиготных LoF мутаций в KISS1R и PROKR2, соотв., по-видимому, ответственных за случай hypogonadotropic hypogonadism (Gazzo et al., 2016). Однако, вполне вероятно, что со временем будут идентифицированы дополнительные настоящие DI болезни, вызываемые двумя разными LoF мутациями в GPCR генах, поскольку многие LoF варианты, уже обнаружены при секвенировании экзома и генома (see Supplemental Tables 1 and 2).
Необходимо также отметить, что вовлечение DI в инактивацию GPCR генов может иметь преимущества. Как упоминалось выше, нарушенная экспрессия хемокинового рецептора Duffy (pseudogenization) дает некоторые преимущества против малярийного паразита Plasmodium vivax. Комбинация к P. falciparum-резистентного варианта гемоглобина HbS, и Duffy негативности, скорее всего, оказывается в областях, где P. falciparum и P. vivax инфекции оказываются эндемичными и часто возникает смешанная инфекция (Gelpi and King, 1976).

E. GPCR-Directed Autoantibodies as Cause of Diseases


Аутоантитела являются иммуноглобулинами, которые соединяются с эндогенными эпитопами хозяина с его paratopes. Некоторые аутоиммунные болезни оказываются ассоциированными с присутствием аутоантител, но имеются также здоровые индивиды с аутоантиталами, которые никогда не приводят к аутоиммунным болезням (Plotz, 2003; Cabral-Marques and Riemekasten, 2017; Cabral-Marques et al., 2018). Неудивительно, что в процессе развития аутоантител против структур хозяина, GPCRs могут также участвовать в эндогенной epitope-нацеленной иммунной реакции. Однако, в редких случаях такие аутоантитела вносят вклад в специфические патологии, связанные с функциональными последствиями связывания антител с GPCR. В принципе, антитела могут блокировать или активировать функцию GPCR в основном за счет аллостерического способа действия (van der Westhuizen et al., 2015). Аутоантитела, нацеленные против TSHR, хорошо изучены. В этом случае антитела нацелены на N конец и могут активировать (Graves disease, hyperthyroidism) или блокировать (Hashimoto Тs thyroiditis, hypothyroidism) TSHR или оставаться функционально нейтральными (Rees Smith et al., 1988). Данные недавних экспериментов показали механизм активации, который возникает в ответ на связывание внеклеточных аутоантител, при этом внутримолекулярный агонист индуцирует структурные изменения в 7TMD, запуская активацию G-белка (Brьser et al., 2016). Эти результаты помещают рецепторы glycoprotein гормона в группу GPCRs, содержащих rhodopsin, protease-активированные рецепторы и aGPCRs, которые имеют своих агонистов уже ковалентно связанных или которые являются интегральной частью рецепторного белка (Schöneberg et al., 2016). В рецепторах glycoprotein гормона, protease-активируемых рецепторах и adhesion GPCRs такой прикрепленный агонист формируется за счет короткой пептидной последовательности непосредственно на N-терминальной трансмембранной спирали 1 и взаимодействие с внеклеточными петлями и соседними частями трансмембранного спирального домена.
Блокировка аутоантител против CASR, как было установлено, вызывает благопреиобретенную hypocalciuric hypercalcemia (Kifor et al., 2003). Связанные с болезнью аутоантитела, которые действуют как аллостерические модуляторы и удерживают CASR в активной конформации с его агонистом, были найдены у пациента с благоприобретенной hypocalciuric hypercalcemia (Makita et al., 2007). Более того, melanin-concentrating hormone receptor 1 был идентифицирован как мишень блокировки аутоантител, вызывающая vitiligo (Kemp et al., 2002; Gottumukkala et al., 2003; Gavalas et al., 2009). Патогенетические аутоантитела против β1 адренергических рецепторов были впервые идентифицированы у пациентов с ChagasТ болезнью сердца и были ассоциированы с сердечной недостаточностью [rev. Boivin-Jahns and Jahns (2018)].

VII. Therapeutic Options and Approaches


Имеется , по крайней мере, два подхода для лечения многих патологий, вызываемых нарушениями функций GPCRs. Во-первых, лечение с целью облегчения симптомов сцепленных с GPCR болезней с помощью фармакологических и/или хирургических вмешательств. Во-вторых, подходы, нацеленные на мутантные GPCR и на восстановление функции (Fig. 5).

Fig. 5. Potential therapeutic strategies to influence altered GPCR functions. There are direct and indirect approaches to influence altered GPCR functions. Direct approaches target the affected receptor (ligands, pharmacoperones) or receptor gene or transcript (gene replacement, gene editing, premature stop-codon suppression) (for details see text). Indirect methods usually target the function of signaling pathway components downstream of the receptor (e.g., G proteins, adenylyl cyclases, PDE). It is also feasible to activate a different GPCR expressed in cells in which the disease-causing GPCR occurs, which should have a similar (in case of LoF) or an opposite (in case of GoF) signal transduction (for details, see text). AC, adenylyl cyclase; Cas9, CRISPR-associated protein 9; PKA, protein kinase A; TMAO, trimethylamine N-oxide; 4-PBA, 4-phenylbutyric acid.



Многие нарушения функции GPCR вызывают эндокринные болезни с резистентностью конечных органов или автономностью среди них, напр., hypothyroidism или hyperthyroidism (TSHR) и дефицит глюкокортикоидов или ACTH-независимый синдром Cushing (MC2R) (Table 1). В случае резистентности эндокринных конечных органов, такой как hypothyroidism и дефицит глюкокортикоидов, простое гормональное замещение thyroxin и cortisol, соотв., может оказаться лечебным. Автономность конечных органов, такая как hyperthyroidism и ACTH-независимый синдром Cushing могут потребовать хирургического удаления желез с гиперфункцией, сопровождаемого заменой соотв. гормона.
Многие врожденные нарушения GPCR приводят к дефектам развития и синдромам (Table 1), которые могут лишь частично подвергнуться хирургическому вмешательству или воздействию лекарств, снижающих патологические проявления. Напр., X-сцепленные NDI (inactive AVPR2, Table 1) характеризуются продукцией больших количеств гипотонической мочи, что обычно лечится заменой водой, ограничением солей, indomethacin и парадоксально thiazide диуретиками (Bockenhauer and Bichet, 2015). Однако, многие связанные с GPCR болезни столь редки, что малое число пациентов (Table 1) недостаточно, чтобы получить доказательства успешности стандартной терапии. Хотя большинство связанных с GPCR болезней редки, существуют генеральные стратегии восстановления клеточной функции GPCR. Большинство попыток направлено, чтобы активировать путь передачи сигналов, мутационно нарушенного рецептора. Напр., AVPR2 связан с путем передачи сигналов Gs protein/adenylyl cyclase, а увеличение уровней внутриклеточного cAMP способствует инсерции aquaporin 2 в апикальную мембрану клеток собирающих канальцев. Это делает возможной абсорбцию воды из мочи и тем самым концентрацию мочи. Уровни циклических AMP и cGMP также могут увеличиваться путем ингибирования phosphodiesterases (PDEs), которая деградирует cAMP и cGMP в AMP и GMP, соотв. (Fig. 5). PDE ингибиторы, такие как rolipram и sildenafil, оказались эффективными в снижении симптоматики NDI у мышиных моделей NDI (Coffey et al., 1991; Sohara et al., 2006) и у пациентов с врожденными NDI (Bouley et al., 2005; Assadi and Sharbaf, 2015).
Секвенирование РНК одиночных клеток выявило, что почти каждый тип исследованных клеток экспрессирует десятки разных GPCRs, при этом некоторые обладают общими сходными сигнальными свойствами (Kaur et al., 2017; Tischner et al., 2017). Поэтому разумно стимулировать эндогенно ко-экспрессирующиеся GPCRs, чтобы восстановить передачу сигналов мутантных рецепторов (Fig. 5). Напр., рецепторы для prostaglandin E2 экспрессируются в клетках почечных канальцев, а специфическая активация рецепторов prostaglandin E2 д. увеличивать способность к концентрации мочи у крыс, моделирующих NDI (Olesen et al., 2011). В случает активирующих мутаций в Gs protein-coupled рецепторах (e.g., TSHR, LHCGR), следует также учитывать коэкспрессию GPCR, которые связаны с функционально противоположным Gi/o protein путем передачи сигналов.
Др. пример косвенного восстановления нарушенной передачи сигналов является MC1R (Table 1), в этом случае LoF мутации вызывают проявление pheomelanotic пигмента у людей и поэтому возрастают индуцированные УФЛ повреждения кожи и повышается риск меланом. MC1R связан с путем передачи сигналов Gs protein/adenylyl cyclase и повышением уровней внутриклеточного cAMP, способствующего продукции eumelanin. Местное применение forskolin, проникающего через кожу фармакологического активатора adenylyl cyclases, может воспроизводить передачу сигналов MC1R путем увеличения cAMP и уровней в эпидермисе eumelanin, повышающих устойчивость к УФЛ при дефекте передачи сигналов Mc1r у модельных мышей (Bautista et al., 2020) (Fig. 5).

B. Direct Targeting of Malfunctional GPCRs


Определение причины дисфункции GPCR является предварительным условием специфического восстановления нарушения функции рецептора с целью терапии связанных с GPCR болезней. Все упомянутые выше подходы могут помочь в определении приоритетов и функциональной характеризации GPCR мутаций с помощью разных методов. Такая глубокая функциональная характеризация мутаций GPCR в самом деле важна для клиники и как показано в многочисленных успешных попытках по восстановлению функции нарушенных GPCRs с помощью фармакологических шаперонов (Conn et al., 2007; Beerepoot et al., 2017; Hou et al., 2018; Newton and Anderson, 2018), функциональной комплементации (Schöneberg et al., 1997; Rivero-Mьller et al., 2010), супрессии стоп-кодонов (Sangkuhl et al., 2004), агонистов и обратных агонистов и лигандов, связывающих nonorthosteric сайты (Gershengorn and Neumann, 2012) (Fig. 5). Эти разнообразные попытки не приложимы ко всем типам мутантных GPCRs, но могут быть пригодны для др. структурных или функциональных дефектах рецепторов. Фармакологические шапероны в основном используются для missense-мутантных рецепторов, которые обнаруживают альтерации трафика из-за неправильной упаковки белка, гликозилирования или пост-трансляционных модификаций. Укорочения рецепторов из-за стоп-кодонов или мутаций сдвига рамки считывания могут устраняться за счет замещения фрагментов (complementation). Однако, по крайней мере, первые 2-3 трансмембранные спирали д. оставаться в мутантных рецепторах для эффективного восстановления отсутствующего фрагмента (Ridge et al., 1995; Schöneberg et al., 1996). Некоторые преждевременные стоп-кодоны могут считываться благодаря супрессии точности рибосом, приводящей к считыванию рецептора полной длины. Базирующиеся на лигандах подходы нуждаются в рецепторах полной длины, которые всё ещё способны связывать лекарства за счет своих orthosteric или nonorthosteric связывающих сторон. Однако, прямое замещение гена или даже восстановление нормальной последовательности оснований с помощью подходов геномного редактирования (напр., CRISPR/CRISPR-associated protein 9 method) являются наиболее подходящими для лечения наследственных GPCR патологий. Однако, ткане-специфическое целенаправленное воздействие на мутантные GPCR гены пока невозможно на пациентах.

1. Gene Replacement


Стратегии замещения генов у GPCR-дефицитных животных моделей легки в исполнении и обнаруживают обнадеживающие результаты. Напр., внесение 15-16-kb фрагмента геномной ДНК родопсина, включая эндогенные промоторные, все интроны и фланкирующие регуляторные последовательности нокаутным по родопсину мышам, используя ДНК нанчастицы приводит к высоким уровням физиологической экспрессии трансгена в течение более 5 мес. (Zheng et al., 2020). Интересный подход к некоторым тяжелым дегенерациям сетчатки, обусловленными доминантными мутациями RHO, включает как супрессию гена, так и заместительную генотерапию. При этом мРНК кодирующая мутантный RHO, которая будет накапливаться и дегенерировать в сетчатке, супрессируется с помощью мутантной нацеленной на RHO короткой hairpin или micro РНК. Замещение RHO достигается с помощью "codon-modified" трансгена родопсина, который устойчив к дегенерации с помощью вмешательства РНК конструкции (OТReilly et al., 2007; Greenwald et al., 2013; Cideciyan et al., 2018).

2. Chemical Chaperones and Pharmacoperones


Укладка GPCR полипептидов является сложным процессом, часто нужающимся в шаперонах. Отсутствие такой ассистируемой укладки из-за мутаций в рецепторе приводит к агрегации белка или деградации вместо образования функционального белка (Tao and Conn, 2014). Уровень экспрессии на клеточной поверхности большинства GPCRs является критическим для их физиологической функции, а химические шапероны и pharmacoperones могут способствовать поверхностной экспрессии мутантного рецептора. Существует две формы базирующихся на соединениях шаперонов in vivo: 1) химические шапероны и 2) базирующиеся на лигандах шапероны (pharmacoperones). Химические шапероны являются низкомолекулярными соединениями, которые могут поддерживать укладку белка. Напр., glycerol, DMSO, trimethylamine-N-oxide (TMAO) и 4-phenylbutyric acid (Tao and Conn, 2018). Pharmacoperones являются соединениями, которые обычно проникают в клетку, присоединяются в качестве лигандов к данному GPCR и служат в качестве молекулярного каркаса, поддерживающего соотв. укладку иным способом неправильно упакованного мутантного рецепторного белка и провожают его корректно на плазматическую мембрану. Такие лиганды могут функционировать в качестве агонистов и идентифицируются при крупномасштабных скринингах экспрессирующихся неправильно упакованных GPCRs (Smith et al., 2016). Некоторые неправильно упакованные GPCRs могут быть восстановлены с помощью химической и базирующейся на лигандах поддержке укладки белков, таких как GNRHR (Janovick et al., 2009), FZL4 (Generoso et al., 2015) и AVPR2 (Makita et al., 2016; Mouillac and Mendre, 2018). Существует много примеров GPCRs, несущих миссенс мутации. Однако, имеются также некоторые C-терминально укороченные GPCRs, которые могут быть восстановлены с помощью pharmacoperones (Jean-Alphonse et al., 2009). Более детально это представлено у Tao and Conn (2014, 2018).

3. Receptor Fragment Replacement


Более 20% от всех инактивирующих мутаций в GPCRs приводят к укорочению рецепторного белка из-за преждевременных стоп-кодонов или мутаций сдвига рамки считывания (see above). Поскольку GPCRs состоят из многих упаковывающихся единиц (Ridge et al., 1995; Schöneberg et al., 1995), то было продемонстрировано, что мутантный AVPR2, содержащий клинически значимые мутации на carboxy-конце третьего рецепторного белка, может быть функционально восстановлен с помощью одновременной экспрессии не мутантного carboxy-концевого фрагмента AVPR2 in vitro (Schöneberg et al., 1996). Генерация мышей, обладающих nonsense мутацией (E242stop) в гене AVPR2 приводит к них к NDI фенотипу (Yun et al., 2000). Однако, скрещивание этих NDI мышей с трансгенными мышами, экспрессирущими отсутствующий C-терминальный фрагмент AVPR2 не приводит к восстановлению нормального фенотипа (unpublished data). In vivo комплементация укороченных GPCRs , неспособных к укладке своих единиц, по-видимому, совершенно неэффективный терапевтический подход.

4. Suppression of Stop Codons


Трансляционное считывание преждевременного стоп-кодона, индуцированное с помощью фармакоцевтических соединений является обещающим способом восстановления экспрессии функционального белка и смягчения симптомов болезни. Терапия считыванием базируется на открытии, что небольшие соединения, такие как aminoglycosides, ataluren (PTC124), RTC13 и RTC14, модифицируют аппарат трансляции, чтобы супрессировать nonsense кодон, удлинять синтезируемый полипетид и в конечном счете приводить к синтезу белка полной длины (Nagel-Wolfrum et al., 2016) (Fig. 5). Эффективность считывания зависит от последовательности нонсенсс кодона и окружающей стоп-кодон последовательности (context preference) (Dabrowski et al., 2015). Это может объяснить обычно низкий эффект на завершение физиологической трансляции . Более того, имеется обычно более одного стоп-кодона на 3'-UTR и в тесной близи к естественному кодону терминации, это увеличивает шансы трансляции кодона терминации даже в присутствии aminoglycosides. Ряд клинически опробованных лекарств, включая aminoglycosides gentamycin и tobramycin, был идентифицирован для увеличения считывания преждевременных стоп-кодонов (Mutyam et al., 2016). Напр., эффективность gentamycin была продемонстрирована не только на культурах клеток и животных моделях, но также в многочисленных клинических испытаниях, адресованных стоп-кодонам, вызывающим болезни, у пациентов с мышечной дистрофией Дюшена и с кистозным фиброзом [ rev. Dabrowski et al. (2018)]. Однако, aminoglycosides может оказывать сильные ototoxic и nephrotoxic эффекты, которые могут быть частично устранены, если пациенты с A1555G мутацией в гене 12S рибосомальной РНК митохондриальной ДНК, которая, как известно, предрасполагает к индуцированной gentamicin ototoxicity, исключены (Malik et al., 2010). PTC124 (ataluren) был отобран как наиболее подходящий для считывания среди более 800000 исследованных соединений (Welch et al., 2007). Ataluren принимается через рот, он был успешно тестирован на мышиной модели кистозного фиброза (Du et al., 2008), но оказался неэффективным у пациентов с кистозным фиброзом в результате nonsense мутации (Kerem et al., 2014). Подход по трансляционному считыванию был также использован для восстановления функции стоп-кодоном обусловленной GPCR болезни. Лечение с помощью aminoglycosides оказалось более эффективным, чем комплементационный подход по восстановлению нонсенс мутаций в AVPR2 it и in vivo (Schulz et al., 2002; Sangkuhl et al., 2004). Функциональное восстановление nonsense-укороченного родопсина и MC4R было также продемонстрировано у модельных грызунов retinitis pigmentosa (Guerin et al., 2008) и ожирения (Bolze et al., 2013), соотв.

5. Ligand-Based Functional Rescue


В случае missense мутации всё ещё возможен (частичный) перенос мутантного GPCR на плазматическую мембрану, это может быть облегчено подходами, базирующимися на лигандах. В частности, активирующие мутации могут подвергаться целенаправленному воздействию обратных агонистов, чтобы снизить постоянную активность. Напр., малые молекулы обратного агониста были открыты для TSHR, которые могут обладать терапевтическим потенциалом как орально принимаемые лекарства, чтобы подавлять конституитивную передачу сигналов мутантного TSHR у пациентов с раком щитовидной железы и у некоторых пациентов с hyperthyroidism (Neumann et al., 2010a) (Fig. 5). В случае активирующих аутоантител против TSHR, пептиды, происходящие от внутреннего агониста, или малые соединения, подходят для супрессии активности автономных рецепторов (Brьser et al., 2016; Marcinkowski et al., 2019). Помимо малых соединений, моноклональные антитела, которые, по-видимому, модулируют изомеризацию внутреннего агониста этого рецептора, также могут подходить для супрессии конституитивной активности TSHR (Chen et al., 2018a). Подход с обратным агонистом также был использован для восстановления фенотипа у мышей, экспрессирующих постоянно активный рецептор паратироидного гормона (Noda et al., 2020). Вирусным геномом кодируемые GPCR могут постоянно активировать каскады передачи сигналов (see above). Обратные агонисты GSK682753A и VUF2274 подавляют постоянную активность Epstein-Barr virus-induced receptor 2 и человеческого cytomegalovirus GPCR US28, соотв., и могут использоваться для терапии (Casarosa et al., 2003; Benned-Jensen et al., 2011). Более того, VUF2274 подавляет US28-обеспечиваемое проникновение HIV в клетки (Casarosa et al., 2003).
В GPCRs, там, где инактивирующие мутации вмешиваются в связывание собственного агониста, то специально отобранные агонисты всё ещё соединяются с мутантными рецепторами и могут быть использованы для активации мутантного рецептора. Напр., небольшой пептид и высоко избирательный агонист MC4R setmelanotide (первоначально известный как RM-493, BIM-22493) снижает потребление пищи и снижает вес тела у тучных людей с дефицитом гена proopiomelanocortin (Kьhnen et al., 2016) или гена leptin рецептора (Clщment et al., 2018). Позднее было проверено, действительно ли setmelanotide всё ещё может активировать мутантный MC4R, вызывающий ожирение. Было показано, что этот очень мощный пептид может частично восстанавливать функцию некоторых из этих мутантных рецепторов у тучных людей (Collet et al., 2017) (Fig. 5). Это исследование также показало, что успешное лечение нуждается в аллель-специфичном in vitro тестировании, поскольку эффективность сильно зависит у разных мутантных MC4R.
Мутациями индуцированная LoF GPR126 (ADGRG6) вызывает дефекты миелинизации у рыбок данио и мышей (Monk et al., 2009; Mogha et al., 2013). Скрининг библиотеки небольших соединений был использован у мутантных рыбок данио (hypomorph) было обнаружено лекарство, способное непосредственно активировать функцию GPR126 (Bradley et al., 2019; Diamantopoulou et al., 2019). Эти примеры показывают, что идентификация небольших соединений, нацеленных на мутантные рецепторы, может быть подходящим подходом в направлении индивидуалзированной терапии при GPCR патологиях.

VIII. Identification of Disease-Relevant GPCR Using Population Genetic Data


В последние 15 лет количество GPCRs, вызывающих наследственные заболевания у людей почти удвоилось [(Schöneberg et al., 2004) vs. Table 1]. Это увеличение было ожидаемым исходя из фенотипических данных дефицитных по GPCR гену модельных мышей. Приблизительно 52% GPCR-дефектных линий мышей обнаруживали определенные фенотипы или эмбриональную или перинатальную гибель и около 41% имели очевидные фенотипы после воздействия (напр., лекарств или патогенов) (Schöneberg et al., 2004). Идентификация генетических детерминант вносит вклад в восприимчивость к болезням и сегодня осуществляется с помощью связывающих генетических маркеров (напр., SNPs) или данных по экспрессии фенотипических проявлений в крупных GWAS или по экспрессии локусов количественных признаков (eQTL), соотв. Здесь мы не рассматриваем тщательно такие ассоциации вариант-феноип , поскольку существуют бесчисленное количество исследований GWAS иd eQTL, касающихся также сигналов от GPCR локусов [ rev. (Tang and Insel, 2005; Insel et al., 2007; Thompson et al., 2014; Kovacs and Schöneberg, 2016; Luo et al., 2019)]. Только некоторые избранные ассоциации GPCR вариант/болезнь представлены в Table 4 и следует поощрять дальнейшие клинические и экспериментальные работы по выявлению причинной связи этих вариантов с фенотипическими отклонениями у людей. Однако, исследования GWAS и eQTL обнаруживают только статистическую связь, детерминирующую генотип-фенотип соответствие и обычно отсутствие причинной связи. Одной из критических целей будущего может стать эффективная фильтрация кандидатов на роль вариантов, вызывающих болезни, белок-кодирующих генов путем получения дополнительной информации и методического вклада. Уже получены обширные коллекции данных по экзомам, касающиеся идентифицированных 3230 генов с почти полной исчерпаемостью предсказуемых белок-укороченных вариантов (Lek et al., 2016). 30 GPCRs из этого списка, при этом 22 из этих генов не связаны сегодня с установленными болезнями у людей, а 8 генов вызывают фенотипические отклонения у людей (Table 1, marked with *). Интересно, что 11 генов из этого списка кодируют aGPCRs (ADGRA3, ADGRB1-3, ADGRC1-3, ADGRG2, ADGRL1-3) и 6 генов glutamate рецепторов (GRM1-5, GRM7) с очевидной меньшей представленностью rhodopsin-подобных GPCRs. Эти GPCR гены являются кандидатами на роль патологических фенотипов у людей, а также у дефицитных по гену мышиных моделей [напр., тяжелые уродства в ADGRC-дефицитных линиях мышей (Tissir et al., 2010; Shi et al., 2014)]. Исследование всего генома у 10503 взрослых пакистанцев выявило 1317 генов, несущих гомозиготные LoF мутации (Saleheen et al., 2017). Помимо многочисленных обонятельных и вкусовых рецепторов, 21 nonodorant GPCRs было найдено инактивированных в гомозиготном состоянии (Supplemental Table 2 marked with #; Table 1). В новом анализе gnomAD в данных по 3270 генам идентифицированы LoF варианты, а после дальнейшей фильтрации данных, был определен набор в 1815 генов, которые, скорее всего, толерантны к биаллельной инактивации (Karczewski et al., 2020), среди них 32 GPCRs , несущих гомозиготные инактивирующие стоп-кодоны или мутации сдвига рамки считывания (Supplemental Table 2 marked with +).

TABLE 3 Human phenotypes and diseases associated with GPCR dysfunction A selection of GPCR genes in which variants show a significant association with human phenotypes is given. Some GPCR genes were also identified in studies screening human genomes for LoF variants: *genes intolerant for LoF (Lek et al., 2016).

Дополнительные биоинформационные подходы помогут улучшить реальные предказания по вариантам генов, которые могут быть сцеплены с фенотипическими отклонениями у людей. Менее 3% белок-кодирующих генетических вариантов предположительно являются результатом обычной LoF благодаря внесению стоп-кодона или вариантов сдвига рамки считывания (Emdin et al., 2018). Такие очевидные LoF варианты в гемизиготном или гомозиготном состоянии наиболее подходят для изучения генотип-фенотипических ассоциаций (Supplemental Tables 1 and 2). Напр., вариант Arg95Ter (rs114285050) укороченного GPR151 защидает от ожирения и типа 2 диабета (Emdin et al., 2018) (Supplemental Table 2). Инактивирующие мутации стоп-кодонов и сдвига рамки считывания в GPR142 (Supplemental Table 2) встречается с высокой частотой в популяциях людей (21% в Африканской популяции), приводя к появлению гомозиготных по GPR142-дефициту людей. GPR142 является рецептором для ароматических аминокислот, экспрессирующихся в поджелудочной железе и контролирующих триптофаном индуцируемый инсулин и секрецию incretin у мышей (Lin et al., 2016). Синтетический GPR142 агонист C-22 сильно улучшает оральную толерантность к глюкозе у тощих и тучных мышей (Rudenko et al., 2019).
Базируясь на недавнем UniProt release (31-Jul-2019), имеется 847 белок-кодирующих генов в Х хромосоме, среди них 23 кодируют nonodorant GPCRs (Supplemental Table 1). На сегодня только 6 X-сцепленных болезней вызывается мутациями в GPCRs, а мыши, дефицитные по этим генам обнаруживают очень простые фенотипы. Однако, количество X-сцепленных GPCR болезней, скорее всего, вырастет в будущем поскольку мыши, несущие дефекты в 14 дополнительных X-хромосомных GPCR генах, присутствуют, имея определенные фенотипические проявления (Supplemental Table 1). В самом деле, база данных поиска X-хромосомных GPCR генов, выявляется у мужчин, несущих четкие инактивирующие мутации (преждевременные стоп-кодоны и мутации сдвига рамки считывания) (Supplemental Table 1). Теперь необходимо детальное клиническое описание , чтоб связать эти GPCR "knock-outs" у человека с определенными фенотипами и сравнить их с данными исследований фармакологического действия и GPCR-дефицитных мышей.
Недавно популяционные генетические подходы выявили примерно 100 предсказанных LoF мутаций в белок-кодирующих генах на геном и было подсчитано 0.13-0.29 рецессивных летальный мутаций на гаплоидный набор аутосом (MacArthur et al., 2012; Gao et al., 2015). Однако, шанс возникновения гомозиготности или компаундной гетерозиготности для таких LoF вариантов зависит от частоты варианта и он всё ещё низкий (see Supplemental Tables 1 and 2). Обычно высокая степень кровного родства браков является узким горлышком или специфицеской внешне-средовой нишей, способствующей увеличению частоты даннго варианта LoF. В очень редких случаях однородительская дисомия может вызывать гомозиготность. При этом две гомологичные хромосомы наследуются от одного и того же родителя. Напр., у 3-летнего пациента с ожирением, гомозиготность преждевременного стоп-кодона в с G protein-сцепленным bile acid receptor 1 была обнаружена, хотя мать была гетерозиготна по этой мутации, но не отец (Yu et al., 2016). Было показано у людей и мышей, что с G protein-нацеленный рецептор желчных кислот 1 индуцирует высокие энергетические затраты (Watanabe et al., 2006).
Поскольку GPCRs являются основными мишенями для лекарственной терапии, то варианты рецепторов могут вносить вклад в их терапевтическую изменчивость. В недавнем исследовании было определено в среднем 4 общераспространенных и 128 редких вариантов для каждого GPCR консорциумом по агрегации экзомов (Hauser et al., 2018). Данные exome aggregation consortium были совсем недавно включены в данные gnomAD, и теперь они содержат данные для 125748 экзомов и 15708 целых геномов (https://gnomad.broadinstitute.org) (Karczewski et al., 2020). Наш собственный анализ 144 nonodorant рецепторов из всех классов GPCR (все GPCR гены представлены в Supplemental Tables 1 and 2; Table 1) выявил 52115 вариантов (отфильтрованных по качеству missense, nonsense, frameshifting и splice вариантов), давших в среднем 362 редких и частых вариантов на GPCR. При углубленном анализе было установлено, что имеется в среднем 64 несинонимных мутаций на 100 кодонов в GPCR генах в настоящее время секвенированных популяций (Supplemental Table 3). Безусловно, это количество будет увеличиваться бри секвенировании большего количества индивидов.
Поскольку естественный отбор элиминирует вредные варианты из популяций, то методы детекции отбора будут моделировать снижение изменчивости (constraint) по сравнению с ожидаемой (Samocha et al., 2014). База данных генетической изменчивости gnomAD уже содержит используемый ограничивающий инструмент (Lek et al., 2016), и можно предполагать, что она может служить предсказателем для клинически важных альтераций GPCR. Напр., если наблюдаемые и ожидаемые показатели missense и LoF для данного GPCR достоверно ниже 1, то можно ожидать фенотипические отклонения, снижающие приспособленность. Чтобы протестировать это предположение, мы использовали два набора GPCRs: 1) GPCR с инактивирующими мутациями, взывающими наследственные болезни (Table 1, reduced fitness) и 2) GPCR с гемизиготными или гомозиготными инактивирующими мутациями, возникающими у во всем остальном здоровых индивидов (Supplemental Tables 1 and 2). В среднем, GPCR гены обнаруживали ожидаемые скорости synonymous мутаций и отсутствовали достоверные отличия между GPCR генами, связанными с известными моногенными болезнями и теми генами, которые пока не ассоциированы с моногенными фенотипами (Supplemental Table 3, P = 0.19). Однако, nonsynonymous мутации обнаруживают достоверно более низкие уровни между наблюдаемыми и ожидаемыми количествами мутаций (missense P = 0.008; frameshifting/stop/splice P = 0.001) (Supplemental Table 3) в GPCR генах с известными связами с болезнями, указывая, что базируясь на ограничениях, можно будет предсказывать гены кандидаты GPCR, приводящие к тяжелым функциональным дефектам после инактивации. Генами кандидатами с очень низкими количествами наблюдаемых к ожидаемым LoF мутациями оказались BRS3, GPR173 и ADGRC3 (CELSR3) (Supplemental Tables 1 and 2). В самом деле, мыши, дефицитные по BRS3 или GPR173 приводили к подобным метаболическому синдрому или фенотипу нарушения развития кости, соотв. (Supplemental Table 1). Конституитивные и кондиционные Adgrc3-дефицитные мыши показали, что такие aGPCR являются критическими для возникновения некоторых крупных пучков аксонов в ЦНС (Tissir et al., 2005; Zhou et al., 2008a) и необходимы для проведения двигательных аксонов в нижние конечности (Chai et al., 2014). Такой анализ четко демонстрирует, что список GPCRs , которые становятся клинически важными, когда мутируют, оказывается длиннее, чем ожидалось (Tables 1 and 5). В частности, GPCRs, которые не попадают в список генов, толерантных к LoF (Supplemental Table 2) , но обнаруживают низкое соотношение наблюдаемых и ожидаемых LoF, должны рассматриваться в будущем с учетом фенотип/генотип соотношений. Среди них, напр., muscarinic acetylcholine receptors type 1 и type 4 (CHRM1, CHRM4), ADGRA1, ADGRC2, ADGRF5 и GPR61.


TABLE 5 Main Points

Независимо от их значения для наследуемых фенотипов, анализ и квалификация SNP данных по целенаправленному воздействию лекарств на GPCRs имеют огромное значение в отношении возможных изменений в функции мишеней и нежелательных побочных эффектов (Hauser et al., 2018). Следовательно, частота функционально важных SNPs в популяциях важна для тестирования и соотв. фармакотерапии, если это необходимо. µ-opioid receptor 1 (OPRM1) является классическим примером SNPs влияния на фармакродинамические свойства аналгетиков. Вариант OPRM1 N40D (rs1799971) приводит к потере гликозилирования сайтов N конца (Huang et al., 2012). Установлено, что пациенты, несущие D40 вариант обладают более низким болевым порогом (Fillingim et al., 2005) и нуждаются в более вчсоких дозах морфина для аналгетической реакции (Klepstad et al., 2004). Частота аллеля D40 выше в Азиатских популяциях (36%), чем в Европейских (19%)и Африканских (2.4%) популяциях (rs1799971 in gnomAD data base). Однако, значение N40D для лечения опиоидами и наркомании всё ещё является спорным (Walter and Lцtsch, 2009; Taqi et al., 2019; Ho et al., 2020). Существуют также GoF варианты OPRM1. Очень редкий вариант K235N обнаруживает повышенную эффективность и потенциал buprenorphine по сравнению с диким типом (Hauser et al., 2018).

IX. Future Perspectives


Methodical advances in mouse genetics and in the acquisition of population genetic data significantly increased the number of inherited diseases and phenotypes specifically assigned to functionally relevant mutations in GPCRs. Population genetic and evolutionary sources are mined with the help of bioinformatics to identify GPCR genes with high constraints (LoF-intolerant genes) that are likely to cause phenotypes when mutated. At present, such bioinformatic tools consider the entire coding sequence of a given gene and evaluate its constraint. However, these investigations could be restricted to distinct parts of a receptor molecule to identify local constraints and, therefore, increase the predictive value of such analyses. Currently, odorant and taste receptors are not well-characterized with respect to their disease relevance, although many of them are also highly expressed in nonsensoric tissues, so-called ecnomotopic odorant, and taste receptors (Di Pizio et al., 2019). This will surely change when their physiologic roles are determined in more detail. In the future, their participation in digenic and oligogenic diseases will also contribute to the significance of altered GPCR function in inherited disorders. Furthermore, the wealth of structural information—specifically how ligands bind, how signals are transduced through the receptor molecule, and how GPCRs interact with their intracellular partners (Venkatakrishnan et al., 2016; Hilger et al., 2018; Weis and Kobilka, 2018)—greatly improved our molecular understanding of pathologic mutations. Hopefully, this information can be used to more precisely predict the functional relevance of GPCR variants found in populations in order to explain phenotypes and to adjust pharmacotherapy. Again, cell and animal models carrying variants rather than constitutive or conditional whole-gene knockouts will be more easily accessible because of modern genome editing methods (Anzalone et al., 2019). This will also allow for studying the disease relevance of mutation in the 5'- and 3'-UTRs of GPCR transcripts and in the nontranscribed regulatory regions of GPCR genes. Finally, precise genome editing will rescue most of the disease-causing mutations found in GPCR genes. Until this is feasible with high efficiency in vivo, individualized and allele-specific pharmacological approaches are required to reverse GPCR malfunctions.