Первичный рак печени, главным образом гепатоцеллюлярная карцинома hepatocellular carcinoma (HCC), является второй ведущей причиной, вызывающей гибель от рака во всем мире [1]. Показатель HCC увеличится с 14 миллионов случаев в мире в 2012 до ожидаемых 22 миллионов в 2030 [2], в основном благодаря увеличению показателя хронических алкоголиков и nonalcoholic steatohepatitis (NASH) в Западных странах [3] и эпидемичности вирусного гепатита в странах Африки и Азии, ведущего к циррозу печени [4]. Трансплантации печени сегодня являются безусловно оптимальным лечением при HCC [5,6] , но они в запасе на ранней стадии рака. Если производится резекция опухоли, то чаще всего используются транс-артериальная химиотерапия и подкожная терапия для лечения локальных HCC, продвинутые HCC всё ещё имеют фатальный прогноз [7]. Системная терапия является ключевым лечением у пациентов с использованием воротной вены, распространение за пределы печени, возвращение болезни после хирургического вмешательства и прогрессированием после нацеленной на печень терапии. Разные системные терапии, включая цитотоксическую химиотерапию (doxorubicin), interferon-alpha и гормональную терапию (tamoxifen, megestrol anti-androgens) были тестированы с очень незначительным клиническим успехом и существенной токсичностью [8]. В самом деле, HCC обычно рассматривается как резистентная к химии болезнь со средним сроком выживания overall survival (OS) продвинутой HCC, леченой doxorubicin в 10.6 недель [9]. В 2008, SHARP испытание показало обнадеживающие результаты sorafenib, орального tyrosine kinase inhibitor (TKI), со средним OS в 10.7 мес. В противовес 7.9 мес. При использовании плацебо; соотв. sorafenib vmfl стандартом лечения первой линии продвинутых HCC [10]. Затем наступила декада грустной саги, когда не было открыто системных терапевтических агентов, вызывающих успех OS. Однако, др. TKIs, такие как regorafenib [11], cabozantinib [12], lenvatinib [13], и vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) - такие как моноклональные антитела ramucirumab [14] - продемонстрировали улучшение исходов по сравнению с плацебо в качестве лекарств первой и второй защиты.

Посредством иммунотерапии с цитокинами (interferon alpha-2b, interleukin-12) не удается получить обнадеживающие результаты, рандомизированные контролируемые испытания сообщают о преимуществах immune checkpoint inhibitors (ICI) при продвинутой HCC. На второй линии защиты, nivolumab (CheckMate 040) и pembrolizumab (Keynote 240) обнаруживают признака активности (показатель ответной реакции 14% и 17%, соотв.), но без крупного клинического результата [15,16]. Опубликованные в 2020, результаты в phase III использования комбинации atezolizumab с bevacizumab в качестве первой линии защиты продемонстрировали превосходство OS по сравнению sorafenib (HR = 0.58, 95 CI 0.42-0.79, p менее 0.001), это позволило FDA одобрить эту ассоциацию [17]. Не смотря на этот прогресс, клинический успешный результат при HCC оставался очень небольшим с OS спустя 12 мес., 67.2% с atezolimumab-bevacizumab. Возникла дополнительная необходимость в иммуно-онкологических средствах [18,19].

Печень является органом с очень специфичной иммунной системой [20]. Во-первых, HCC считается иммуногенной опухолью из-за её анатомического положения, позволяющего детекцию патогенов, проникающих в кишечник, и подвергающийся процессингу за счет многих фагоцитирующих клеток (напр., Kupffer клеток) и клеток врожденного иммунитета (напр., NKT и iNKT клеток). Помимо печени также множественные подтипы CD4+ T клеток с иммуномодулирующими функциями и цитотоксические CD8+ T клетки. Однако, даже если эти memory клетки могут помочь уничтожению опухоли [21], они редко способны сами по себе контролировать продвинутые HCC. Во-вторых, цирроз вокруг клеток HCC также является уникальным фоном. Печень непрерывно удаляет большой спектр патогенов из кровообращения, обеспечивая тем самым защиту органов путем поддержания иммунотолерантности [22]. Однако, при хронических болезнях печени (necroinflammation), сигналы, способствующие воспалению, (IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 и IFN-γ) нарушают эту толерантность, приводя к постоянной гибели клеток, компенсаторной регенерации и фиброзу печени, которые совместно и индуцируют туморогенез. Иммунная система также разрегулирована из-за противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-13 и TGF-β), приводя к супрессии эффективной противоопухолевой иммунной реакции [22].

Затем исследователи преобразовывали цитотоксические клетки (в основном CD8+ и редко NK клетки) , воздействуя целенаправлено на HCC, чтобы повысить их цитотоксические свойства [23]. На сегодня, успешность adoptive cells transfer (ACT) при солидных опухолях была исключительной [24,25]. Благодаря присутствию tumor associated antigens (TAA) с приемлемой специфичностью, HCC является и из наиболее многообещающих органов для ACT в солидных опухолях [26].

После декады довольно незначительных успехов, когда пытались превратить иммунологическую концепцию в эффективный иммнотерапевтический инструмент - с возможным исключением трансплантации аллогенных гематопоэтических клеток, которые эмпирически были разработаны в качестве клеточной иммунотерапии для лечения большинства гематологических злокачественных опухолей - в последние годы были засвидетельствованы некоторые практические изменения медицинских продуктов. В частности, удивительный результативный успех и улучшение исходов наблюдали после введения immune-checkpoint ингибиторов для лечения злокачественной меланомы и рака легких, объявивших о прорыве в biotech и pharma компаниях, разрабатывающих новые инструменты, чтобы активировать или расширить способности иммунной системы пациента и контролировать рост опухоли.

Дальнейший прогресс в преобразовании моноклональных антител привел к разработке BITE® или bispecific T cell engager; первым BITE®, достигшим рынка в 2015, стал blinatunomab, нацеленный на CD19 и был предназначен для лечения relapsed/refractory (r/r) acute lymphoblastic leukemia (ALL) у взрослых. BITE© антитела имел два плеча, один связывал мембранный антиген, экспрессирующийся на поверхности мишеней (опухолевых) клеток, таких как CD19, а др. связывал T клетки, приводя к их активации и цитотоксическому эффекту в тесной близи от опухолевых клеток [27].

Др. важным недавно предложенным способом стала разработка гематопоэтической клеточной терапии (Figure 1) базирующейся на immune effector cells (IECs), наиболее известными из которых были CAR-T Cells [28,29]. CAR означает 'Chimeric Antigen Receptor', синтетический белок, кодируемый последовательностью ДНК, которая располагается бок-о-бок с внеклеточным доменом одиночной цепочки иммуноглобулина, внутриклеточный домен Zeta цепи T-Cell Receptor (TCR) с шарнирным регионом и одним или несколькими доменами из одновременно стимулируемых молекул, таких как CD28 или 4.1 BB, в промежутке [30]. Внеклеточный домен целенаправленно действует на мембранный антиген, экспрессирующийся на поверхности клеток мишеней, таких как CD19 при лимфоидном озлокачествлении (ALL, non-Hodgkin's lymphoma, etc.) или на B Cell Maturation Antigen (BCMA), экспрессирующийся на злокачественных плазмацитах у пациентов с множественными лимфомами. Распознавание антигена мишени не ограничивается молекулами Major Histocompatibility Complex (MHC), что делает возможным широкое клиническое использование. Связывание соотв. лигандных триггеров активации T-клеток и цитотоксичности происходит посредством TCR домена. Природа ко-стимулирующих доменов имеет важное значение для амплификации in vivo и персистенции CAR-T клеток после из введения.

Figure 1. Schematic representation of T cell receptor (TCR) engineered T cells and chimeric antigen receptors (CAR) engineered T cells in hepatocellular carcinoma. Main tumor associated antigens (TAA) are represented in green. Abbreviations: AFP = alpha-fetoprotein, Co-stim = co-stimulation molecules (mainly CD28, ICOS, 41 BB, OX40), MHC Class 1 = major histocompatibility complex class I, TAA = tumor associated antigens.

Сегодня три аутологичных CAR-T типа клеток-все нацелены на CD19- были одобрены в США и Европе, а также во многих др. странах: сюда входят tisagenlecleucel для лечения relapsed/refractory ALL до 25 лет [31], а также для лечения relapsed/refractory diffuse large B-cell Lymphomas (DLBCL) [32,33], axicabtagene ciloleucel для лечения r/r DLBCL и первичной медиастинальной NHL [34] и brexucabtagene autoleucel для лечения r/r mantle cell NHL [35]. Два типа аутологичных CAR-T Cells нацелены на BCMA, idecabtagene vicleucel [36] и ciltacabtagene autoleucel [37], скорее всего, вскоре будут разрешены FDA, EMA, и Chinese health authorities для лечения пациентов с продвинутыми множественными миеломами.

Многочисленные разработки находятся на ст. оценки новых опухолевых мишеней для лечения новых категорий болезней, таких как болезнь Hodgkin's [38], myeloid malignancies [39] или солидные опухоли, стратегии преодоления резистентности, главным образом из-за потери целевых опухолевых антигенов [40], стратегии ослабления побочных эффектов, связанных с использованием CAR-T клеток, таких как cytokine release syndrome (CRS) или immune effector cells associated neurological syndromes (ICANS) [41-43], на ст. получения улучшенных и более сложных CAR структур, предназначенных для противодействия супрессирующему окружению, которое характеризует многие типы опухолей, подтверждая персистенцию in vivo CAR-T клеток и рекрутирование эндогенных иммунных эффекторов [44]. Кроме того, CAR-технологии теперь комбинируются с редактированием генов с помощью трансдукции ретровирусным или лентивирусным вектором [45] с использованием аллогенных клеток, которые несут надежду на готовые к продукции лекарства [46] и генетические преобразования др. субнаборов иммунных клеток, таких как клетки natural killer (NK) [47], γ/δ T cells или макрофаги. Эта область обнадеживает.

Кроме того, азарт, возникший после первого разрешения CAR-T Cells, область IECs также испытала применение TCR трансгенных T-Cells (также наз. engineered T-cells). В этом контексте распознавание опухолевых клеток мишеней, не ограничивается мембранными антигенами, но позволяет распознавать MHC-ограниченные пептиды и может тем самым быть более пригодным для лечения солидных опухолей (Figure 1). Тем не менее, MHC ограничения лимитируют использование у ряда пациентов с наиболее частыми типами HLA в популяции общего родоначальника. Редактирование эндогенных TCR д. быть замещено трансгенными TCR , это, скорее всего, улучшит биологическую активность в будущем, но подобно CAR-T клеткам, остается вопрос об истощении T-клеток в иммуно-супрессивном микро-окружении опухолей , а доставку генетически модифицированных T-клеток к месту опухоли необходимо приспособить прежде чем будет достигнута клиническая эффективность и будут одобрены первые медицинские продукты в этой категории и поступят на рынок. TCR-T клетки и CAR-T клетки, выбор и оценка антигена мишени имеют большое значение для оптимальной клинической эффективности и минимизации соотношения между эффектами в мишенях и вне мишеней.

Все сегодня доступные и исследуемые IECs представляют новую категорию медицинских продуктов, нуждающихся в очень специфической организации для производственных процессов в контексте новой определенной регуляторной структуры, также как и для очень специфической организации госпиталей, которые обеспечивают доступ к такому лечению [48]. Сложная, утонченная и в основном ручная логистика - которая обеспечивает доставку живых клеток на длинные расстояния - частично объясняют высокую цену этой инновационной генотерапии или клеточной терапии лекарственных препаратов. Это также объясняет значительное время оборота перед (аутологичной) терапией, которая будет применена к пациенту кандидату, поэтому возникают важные вопросы в терминах контроля болезни во время этого периода, что связано с необходимостью применения терапии у ряда пациентов и пациентов с быстро прогрессирующей опухолью, что остается нежелательным для таких подходов. Несмотря на эти неопределенности область быстро развивается вперед и потенциальные комбинации с др. формами иммунотерапии, такой как immune checkpoint ингибиторы или с целенаправленной терапией и химиотерапией обнадеживает высокие ожидания пациентов и их семей. В ходе эволюции профиль безопасности и профиль эффективности этих лекарственных средств, которые были одобрены на базе предварительных исследований phase I/II, всё ещё нуждаются в сборе данных о продолжительном периоде времени в условиях реальной жизни после получения разрешения [49]. Это также должно помочь в определении роли этих IECs в лечении различных категорий неопластических болезней, в частности в сравнении с др. иммунотерапевтическими агентами с такими как BITE© [50].

Подобно др. иммуногенным опухолям, субъекты, подвергшиеся резекции печени при HCC с сильной инфильтрацией лимфоцитов, оказались ассоциированы со снижением повторного возращения и лучшим прогнозом по сравнению с теми, у которых не наблюдалось выраженной инфильтрации лимфоцитов [51,52]. Более того, возобновление после трансплантации печени при HCC было связано с подавлением иммунитета [53] , а также с присутствием T regulatory cells (Tregs) в инфильтрате [52].

Ниже представлены основные мишени, использующие ACT при HCC. Ни один из этих антигенов не является опухоль специфическим (экспрессируемым опухолью с минимальной или отсутствием экспрессии в нормальной ткани) [54]. Они в основном принадлежат трем категориям опухолевых антигенов: (i) ассоциированные с опухолями антигены: антигены, чья экспрессия усилена, но не специфична для раковых клеток (напр., AFP, GPC-3); (ii) cancer-testis антигены: антигены, чья экспрессия ограничена раковыми клетками и репродуктивными тканями, но не соматическими тканями взрослых (напр., NY-ESO-1, MAGE); (iii) происходящих из вирусов раковые антигены: антигены, экспрессирующиеся в раковых клетках, происходящих из онкогенных вирусов (VHB, VHC).

(1) Alpha-fetoprotein (AFP) является 70-KDa гликопротеином, обнаруживаемым в сыворотке ранних эмбрионов млекопитающих, синтезируемым в месте эмбрионального гематопоэза: желточном мешке [55]. После рождения уровни быстро снижаются и на второй год обнаруживаются лишь следовые количества. Нормальные уровни у взрослых обычно колеблются в пределах между 1 и 40 ng/mL. Повторное появление высоких уровней в сыворотке обнаруживается при некоторых состояниях: беременности, печеночных нарушениях и злокачественных опухолях, таких как гепатоцеллюлярная карцинома, опухоли зародышевых клеток (особенно с компонентами опухоли желточного мешка), рак груди, пищевода, шейки матки, поджелудочной железы, эндометрия, желудка, легких и прямой кишки [56]. Вплоть до 50% HCC опухолей экспрессируют AFP [57]. Экспрессия AFP опухолями обычно коррелирует с уровнем AFP в сыворотке, хотя эта корреляция не абсолютна. Экспрессия AFP в печени в отсутствии злокачественной опухоли может возникнуть особенно в субнаборе клеток предшественников и во время хронического воспаления, на уровнях обычно более низких, чем при HCC [58]. Пре-клинические исследования продемонстрировали потенциал AFP для клеточной иммунотерапии [59]. Было сообщено, что злокачественные клетки печени продуцируют AFP-L3, даже когда HCC находится на ранней стадии и осоенно когда масса опухоли, начинает снабжаться печеночными артериями.

(2) Glypican-3 (GPC-3) является членом семейства heparan sulfate proteoglycan, контролирующего клеточные деления и регулирующего рост. GPC-3 является антигеном, экспрессируемым у более 70% HCCs, но редко в незлокачественных тканях. В самом деле, положительное окрашивание на GPC-3 может дифференцировать HCC от диспластических изменений при циррозе печени. Недавнее исследование продемонстрировало, что более сильная экспрессия GPC-3 в опухолевых клетках ассоциирована с плохим прогнозом для HCC [60]. Антитела к Glypican-3 были исследованы в качестве терапевтического средства при HCC, или в отдельности или в качестве переносчика лекарства [61-63]. Многочисленные пре-клинические исследования подтвердили доказательства, что GPC-3 может служить мишенью для adoptive клеточной терапии [64,65].

(3) Семейство Melanoma antigen gene (MAGE) состоит из 12 членов и экспрессируется почти исключительно в раковых тканях в широком наборе злокачественных опухолей [66-69]. При экспрессии РНК в HCC, MAGE-1 и -3 экспрессируются приблизительно в 68% опухолей; MAGE-8 экспрессируется у 46%; а MAGE-2, -6, -10, -11 и -12 экспрессируются приблизительно в 30% [70,71]. Некоторые MAGE пептиды, как было установлено, обнаруживают сильную cytotoxic T-lymphocyte (CTL) реакцию у пациентов с меланомой [72,73].

(4) New York esophageal squamous cell carcinoma 1 (NY-ESO-1) является белком, состоящим из 180 аминокислот. Как член семейства cancer testis antigen (CTA), NY-ESO-1, , как было установлено, экспрессируется в сперматогониях, первичных сперматоцитах, оогониях и плаценте и в разных раковых опухолях, таких как меланома, рак яичников, рак желудка и HCC. [74]. Nakamura et al., выявили NY-ESO-1 мРНК в 18 из 41 (43.9%) гепатоцеллюлярных карциномах [75].

(5) Human telomerase reverse transcriptase (hTERT) играет ключевую роль в обеспечении беоссмертия раковых клеток посредством регуляции длины теломер. Было установлено, что 80% - 90% HCCs экспрессируют hTERT [76]. Кроме того, пептиды, содержащие hTERT эпитопы, способны индуцировать hTERT-специфические цитотоксические лимфоциты [77].

(6) NK group 2 member D ligand (NKG2DL) является type II transmembrane-anchored C-type lectin-like белковым рецептором, экспрессирующимся на клетках natural killer (NK) , клетках CD8+ T , субнаборах γδ T леток и на некоторых аутореактивных CD4+ T клетках. Cancer Genome Atlas и микро-массивы выборок HCC обнаруживают, что NKG2DL обычно отсутствует на поверхности нормальных клеток, но избыточная экспрессия наблюдается на злокачественных клетках, предполагается, что это хорошая мишень для CAR-T терапии. [78]. Недавно исследование in vitro сообщило, что NKG2D CAR-T клетки эффективно убивают клетки линии HCC.

(7) Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) является type I мембранным белком из 314 аминокислот (aa), из которых только 26 aa обращены в цитоплазму [79,80]. EpCAM обладает онкогенным потенциалом и активируется в результате высвобождения его внутриклеточного домена, который может переавть сигнал в ядро клетки путем привлечения элементов сигнального пути wnt [81]. EpCAM часто обнаруживается с избыточной экспрессией в широком разнообразии карцином, включая HCC, рак толстой кишки, желудка, поджелудочной железы и груди [82,83].

(8) Mucin1 glycoprotein 1 (MUC1) относится к семейству эпителиальных муцинов человека [84] Его экспрессия в нормальных клетках скрыта от иммунной системы, а его аберрантное гликозилирование (большое количество O-гликозилированных тандемных повторов) на опухолях создает новые эпитопы, распознаваемые иммунной системой [85]. Пре-клинические исследования in vitro и ксенотрансплантатные модели оценивали MUC1 в качестве мишени для CAR-T терапии [86,87].

(9) Вирусные антигены: поверхностные вирусные белки, не контролируемые с помощью доступных антивирусных агентов и обычно сохраняемые на HCC с интегрированным вирусным геномом [88]. In vitro и у мышей [89], CAR-T клетки, нацеленные против HBV поверхностных белков, позволяют человеческим T клеткам убивать HBV-инфицированные человеческие гепатоциты и устранять вирусную ДНК. Интересно, что TCR ген-модифицированные T клетки (T клетки, генетически преобразованные, чтобы обладали высоким сродством, HLA-A2-ограниченные, HCV NS3:1406-1415-реактивные TCR) обусловливают регрессию упрочившихся HCV+ HCC в ксентрансплантатной модели [90,91].

В 2015 сообщалось о TCR преобразованных T клетках против вирусных антигенов (HBsAg), указывалось, что модифицированные T клетки выживают, распространяются и обусловливают снижение уровней HBsAg без усиления воспаления печени или др. токсичности. Однако, не обнаружено эффективности у пациента с конечной стадией метастатической болезни [92].

На International Liver Congress 2020 (LBO12), Sangro et al., представили интересные данные о генетически преобразованных с улучшенным сродством аутологичных SPEAR T-клетках (AFPc332T-клетки) [93]. В этом первом исследовании на человеке с HCC (NCT03132792), пациенты должны были быть HLAA*02:01+ или 02:642+ и обнаруживать экспрессию AFP с помощью иммуногистохимии (IHC) при ≥1+ в ≥20% HCC клетках или сывороточном AFP ≥ 400 ng/mL, ≤5% IHC AFP в нераковой печеночной ткани. 4 пациента получали ~5 billion или более трансдуцированных клеток (three in Cohort 3, and one in the expansion phase): один пациент с полным откликом, один с стабилизированной болезнью и два имели прогрессирующее заболевание. 5 пациентов ранее лечились в двух первых dose cohorts с дозами 100 миллионов и 1 billion трансдуцированных клеток, соотв., и все пациенты обнаруживали хорошую реакцию в виде стабилизации болезни. Благодаря lympho-depletion (fludarabine 30 mg/m2QD в течение 4 дней и cyclophosphamide 600 mg/m2QD в течение 3 дней) пациенты ощущали цитопению (до G4 leukopenia, lymphopenia, и neutropenia), но не отмечено связанной с T-клетками печеночной токсичности. Не было описано DLTs. Интересно, что первый пациент из Cohort 3 имел подтвержденную частичную реакцию (cPR) со 100% снижением повреждений в мишени; одно из повреждений вне мишени оставалось в течение 8 недель. Это было связано с быстрым и устойчивым снижением уровней AFP в сыворотке с 6531 ng/mL до базового уровня 14 ng/mL к 12 неделе.

В августе 2020, Shi et al. опубликовали результаты phase I испытания с GPC3-CAR-T клетками [60]. В двух проспективных phase I исследованиях (NCT02395250 и NCT03146234), взрослые пациенты с продвинутой GPC3+ HCC (Child-Pugh A) получали аутологичную CAR-GPC3 T-клеточную терапию, сопровождаемую cyclophosphamide- и fludarabine-индуцированной lymphodepletion. Всего 13 пациентов получали в среднем 19.9 х 108 CAR-GPC3 T клеток с конечным сроком 24 July 2019. Предварительные данные об эффективности обнадеживают, две частичные реакции и один пациент с устойчивой стабилизацией болезни были живы спустя 44.2 мес. Доля OS спустя 3 года, 1 год и 6 мес. составляла 10.5%, 42.0%, и 50.3%, соотв. Однако, токсичность была основной заботой в виде cytokine release syndrome (CRS), возникшего у 9/13 пациентов, включая один G5 CRS. Этому пациенту, 20.0 х 108 клеток были введены и на следующий день пациент ощутил тяжелую, связанную с CRS гипотензию, температуру, отек легких и повышение в плазме IL-6 (18,000 pg/mL). Несмотря на значительные усилия по спасению, пациент помер от мульти-органной недостаточности на 19 день. 4 др. пациента, получавших высокую дозу стероидов, два из которых также получали mAb tocilizumab против IL6 рецепторов, чтобы избежать CRS.

К сожалению, многочисленные завершенные phase 1/2 испытания пока не опубликованы, касающиеся целенаправленного воздействия на MUC-1 (NCT02587689) или EpCAM (NCT03013712).

В ранних фазах 5 клинических испытаний (Table 1) производится набор для TCR преобразованными (TCRe) T клетками целенаправленного воздействия на AFP (NCT02719782 и NCT04368182), на HBV вирусные антигены (NCT02719782, NCT03899415) или MAGEA1 (NCT03441100). Два испытания нацелены на солидные опухоли и три испытания на гепатоцеллюлярную карциному. Все эти испытания нуждаются в хорошей функции печени (Child A). Главными целями являются безопасность (токсичность, ограничивающая дозу, побочные эффекты, серьезные побочные эффекты) и в целом величина реакции; испытания проводятся при неоперируемой гепатоцеллюлярной карциноме и одно испытание (NCT03899415) при вспомогательных условиях, оценивающих безопасность и клинический успех TCR преобразованных клеточной терапии у пациентов с HBV+ HCC после гепатэктомии или радиочастотного устранения. Результаты их станут известны после 2022.

Table 1. Ongoing clinical trials of TCR engineered (TCRe) T cells in hepatocellular carcinoma.

Проводимые клинические испытания с CAR-T клетками более часты, чем с TCR преобразованными клетками (Table 2). Главной мишенью является Glypican-3 в 5 идущих клинических испытаниях. Интересно, что одно из этих испытаний (NCT03198546) исследует CAR-T-кетки, нацеленные на GPC3 и/или растворимый TGFβ. Др. нацелены только на GPC3 с использованием разных T клеточных конструкций, notably with особенно 4-1BB Zeta цепи [65].

Table 2. Ongoing clinical trials of chimeric antigen receptor (CAR) T cells in hepatocellular carcinoma.

Basket испытания в основном исследуют не совсем обычные мишени, такие как EpCAM при EpCAM позитивном раке (HCC, gastro-intestinal cancer, liver cancer) (NCT03013712) или Claudin18.2, белок, участвующий в плотных соединениях и экспрессирующийся в опухолях ЖКТ (желудка, соединения между пищеводом и желудком, поджелудочной железы и печени) (NCT03302403). Baskets испытания при HCC могут также иметь несколько мишеней, таких как DR5, C-met или EGFRvIII, исследуются совместно в двух испытаниях CAR-T клеток (NCT03638206, NCT03941626).

Касательно характеристик воздействия, в то время как внутривенные вливания являются стандартом, в одном испытании (NCT03993743) используется печеночная артерия для вливания 4-х доз CD147-CAR-T клеток, которые планируется вводить с недельным интервалом. Дополнительно, одно испытание (NCT03980288) в когорте с расширением, исследующем безопасность комбинации CAR-T клеток (CAR-GPC3) с сегодня доступным лечением HCC, TKI или PD-1/PD-L1 моноклональные антитела.

Большинство этих испытаний находится в phase 1, оценивающей безопасность, с возможно максимальной переносимой дозой (MTD) обычно в виде ряда повторных введений CAR-T клеток и ряда пациентов с ограничивающей дозу токсичностью (DLT). Второй целью является персистенция T клеток в периферической крови, реакция (лучшая реакция, продолжительность реакции) и реже характеристики жизнеспособности (PFS, OS). Результаты этих испытаний ожидаются после 2023.

Мониторинг преобразованных TCR или CAR T клеток в принципе осуществляется путем измерения персистенции количества копий ДНК (copies/mg genomic DNA) [60]. Интересно, что техника анализа одиночных клеток (особенно проточная цитометрия) точно определяет композицию ACT продуктов (пропорцию субнаборов CD4+ и CD8+ T клеток) [94]. В самом деле, у пациентов с non-Hodgkin's лимфомой, naive и central memory CD4+ CAR-T клетки от пациентов обнаруживают более высокую противо-опухолевую активность, чем effector memory CD4+ CAR-T клетки, если переносятся животным моделям. Кроме того, central memory CD8+ CAR-T клетки от пациентов обнаруживают более высокую противоопухолевую активность, чем naive и effector memory CD8+ CAR-T клетки[95].

РНК секвенирование одиночных клеток (RNA-seq) также позволяет анализировать состяние активности CAR-T клеток [96]. В гематологических опухолях scRNA-seq демонстрирует, что колонии, которые распространяются после инфузии, в основном возникают из infused кластеров с более высокой экспрессией цитотоксичных и пролиферативных генов [97]. Более того, анализ одиночных клеток может определить секрецию ими цитокинов и цитотоксичность [98].

В единственном испытании на человеке phase 1 CAR T клеток при HCC [60], продукты CAR T-клеток были отслежены с помощью проточной цитометрии и преимущественно оказались окончательно дифференцированными effector memory T клетками (CD45RA+/CCR7-; в среднем, 78.2%) и effector memory T клетками (CD45R-CCR7-; в среднем, 14.1%; колебания в пределах, 0.8-47.4%).

Мы опишем здесь основные изменения в клиническом использовании терапии модифицированными TCR и CAR-T клетками при HCC, включая возможные стратегии преодоления [99].

Во-первых, доступ к опухолевым клеткам (trafficking and homing) может быть особенно сложным для модифицированных TCR/CAR-T клеток, которые могут столкнуться с ограничением сосудов для кровоснабжения или физическим барьером из стромы [100]. Адекватный трафик зависит от многих параметров, таких как конкуренция между хемокинами, секретируемыми опухолями , и хемокиновыми рецепторами на T клетках (напр., CXCR3 и CCR5), хорошее соответствие с эндотелием или эффективный выход из сосудов и адгезия (напр., ICAM-1 и VCAM-1) с внеклеточным матрксом [101]. Одним из возможных решений является введение внутрь опухоли ACT продукта (NCT03993743), или преобразование T клеток в способные воздействовать на компоненты мишени в матриксе, такие как αvβ6 integrin28, VEGF receptor-2 или фибробласты активирующий белок [102,103].

Во-вторых, в солидных опухолях преобразованные клетки д. сталкиваться иммуносупрессивным TME, состоящим из клеточных представителей (actors) (MDSC, M2 macrophages, TRegs, BRegs, DCRegs, CAF) и иммуносупрессивными цитокинами (IL10, TGFB). Эти клетки продуцируют реактивные виды кислорода и азота, а arginase супрессирующие T клетки остаются функциональными [104]. Чтобы преодолеть оксидативный стресс одним из подходов является преобразование CAR-T клеток ко-экспрессирующих catalase (фермент, редуцирующий hydrogen peroxide в воду и кислород ) или HIF1α [105,106]. Однако, подобные решения всё ещё на пре-клиническом уровне.

Идеально, выбранный антиген в качестве мишени ACT д. высоко экспрессироваться на поверхности опухолевых клеток и не являться важным для здоровой ткани [107]. Однако, секвенирование экзома первичных опухолей и метастатических мест предоставило доказательства внутриопухолевой гетерогенности с пространственно разделенными гетерогенными соматическим и мутациями и хромосомным дисбалансом [108]. Более того, формирование опухоли использует совместную эволюцию неопластических клеток вместе с внеклеточным матриксом и сосудистым эндотелием, стромой и иммунными клетками, которые могут усиливать их отличия [109]. Такая антигенная гетерогенность снижает эффективность ACT в солидных опухолях. Кроме того, потеря антигена часто наблюдается в солидных опухолях пациентов после воздействия CAR-T клеток (напр., потеря EGFRvIII в глиобластоме) [110].

Возможным решением для пресечения гетерогенности опухолей и потери антигенов является преобразование Т клеток, нацеленных на множественные антигены одновременно [111]. Использование OR-gate подхода, при котором или один CAR рецептор может быть преобразован, чтобы поддерживать два домена для связывания антигенов (напр., bi-specific или тандемный CAR) или два CAR рецептора могут экспрессироваться в одной и той же Т клетке (напр., бицистроновые или одновременно трансдуцированные CAR), активация CAR-T клеток происходит, если любой из антигенов присутствует на клеточной поверхности [56]. Более простым подходом является усиление иммуногенной клеточной гибели (химиотерапия, онколитические вирусы), чтобы улучшить высвобождение неоантигенов [112].