Сегодня нет лечения инфекции human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Доступная анти-ретровирусная терапия (ART) нацелена на разные ступени цикла репликации HIV. Хотя ART используют для снижения массы HIV ниже границы детекции пока производится медикаметозное лечение, но не уничтожает вирус. Подавление проникновения вируса HIV рассматривается как многообещающая статегия. В частности целенаправленное воздействие C-C chemokine receptor type 5 (CCR5), ко-рецептор превалирующей HIV-1 линии подвергается воздействия с помощью CCR5 ингибиторов или блокирующих антител.[1] Но даже в комбинации с ARTs они не уничтожают вирус.

С одной стороны, знание, что естественно возникшая делеция в 32 нуклеотида (Δ32), вызывает мутацию в локусе CCR5 и приводит к CCR5-tropic (R5-tropic) резистентности HIV-1 линий,[2, 3] сделало возможными некоторые многообещающие подходы.[4] Люди с гомозиготными Δ32 мутациями редки, клинически ничем не примечательны и ведут нормальную жизнь.[5] В 2007, ВИЧ-положительному пациенту, далее именуемому как “Berlin Patient,” трансплантировали трансплантат в виде аллогенных стволовых клеток от донора, -совместимого по human leukocyte antigen (HLA) , гомозиготного по мутации CCR5Δ32 после диагноза острой миелоидной лейкемии. После прекращения АРТ у пациента внимательно наблюдали за титрами вируса. На сегодняшний день, то есть 13 лет спустя, ни вирусной РНК, ни провирусной ДНК не обнаружено, поэтому он был объявлен первым пациентом, излечившимся от ВИЧ. [6-8] В соответствии с принципом Берлинского пациента, ещё два пациента, известных как Лондонский [9, 10] и Дюссельдорфский [11] пациенты были объявлены как излечившиеся. Эти пациенты закладывают возможность переноса резистентности к ВИЧ с донора на пациента. Однако, из-за потенциально тяжелых побочных эффектов аллогенные трансплантаций и затруднений с обнаружением подходящих гомозиготных Δ32 доноров, эта стратегия сегоня не рассматривается как универсальный подход для лечения ВИЧ пациентов.

Напротив, редактирование гена CCR5 в аутологических клетках представляет важный подход по наделению пациентов клеточной устойчивостью к HIV.[12] В конечном счете, редактирование генома с запрограммированными нуклеазами, в особенности, zinc-finger nucleases (ZFN), transcription activation-like effector nucleases (TALENs), MegaTALs и clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein (CRISPR-Cas) нуклеазами были использованы в разных пре-клинических и клинических испытания по разрушению гена CCR5 в первичных CD4+ T клетках или гематопоэтических стволовых клетках и клетках предшественниках (HSCs).[13-22] В клиническом испытании, проведенном Tebas et al., 12 индивидов, живших с ВИЧ, получали одну дозу аутологичных CCR5-отредактированных CD4+ T клеток. Хотя эффект длился недолго, уровень в крови провируса HIV снижался у большинства пациентов, а вливание CCR5-модифицированных аутологичных CD4+ T клеток оказалось безопасным.[15] Для достижения длительных эффектов, однако, CCR5 должен быть модифицирован в HSCs. Это сможет гарантировать, что резистентность к ВИЧ будет передана всем CD4+ иммунным клеткам, а значит также макрофагам и дендритным клеткам. По описанной клинической шкале уровень достигаемый в 25–71% аллелей CCR5 д. быть отредактирован в HSCs, но при использовании ZFN обнаруживается высокая off-target (OT) активность,[18] указывая на довольно высокий генотоксический потенциал в компартменте стволовых клеток. HSCs редактировали также с помощью CRISPR/Cas нуклеаз для лечения ВИЧ-позитивных пациентов с острой лимфатической лейкемией. Частота редактирования CCR5 в трансплантатах ~18% и она ещё дальше разбавляется одновременно трансплантированными не отредактированными HSCs. Не удивительно, возобновление ВИЧ наблюдалось во время прерывания лечения.[20] Мы полагаем, что подход по редактированию CCR5 может оказаться успешным в клинике, если в HSCs будет достигнут более высокий уровень, более 50% биаллельных нокаутов и с высокой специфичностью.

В нашем исследовании мы оценивали TALEN в отношении его способности разрушать аллель CCR5 как с более высокой актиностью, так и с более высокой специфичностью, с использованием установочных параметров, пригодных для использования в клинике. Чтобы продемонстрировать резистентность к инфекции HIV-1, редактирование CCR5 производили в первичных CD4+ T клетках. Система TALENs уже использовалась для разрушения CCR5 в клетках человека,[16, 23, 24], здесь мы показали, что улучшенная разработка TALEN в комбинации с новейшей технологией переноса РНК [25] позволила нам вызывать нокаут CCR5 в CD4+ T клетках с большей активностью и специфичностью. Произведенные Т клетки были резистентными к ВИЧ, генетически стабильны и сохраняли свой потенциал.

Подходы для разрушения CCR5 в первичных CD4+ T клетках и HSCs человека уже были описаны.[13-22] Эти сообщения демонстрировали осуществимость подавления проникновения ВИЧ, хотя и с некоторыми недостатками. Сюда входили низкая эффективность разрушения гена, высокие эффекты вне мишени или отсутствие анализа специфичности, отсутствие анализа эффективности и/или отсутствие совместимости с good manufacturing practice (GMP).[16, 33-35] В данном исследовании мы предоставили эффективное редактирование в локусе CCR5 в первичных CD4+ T клетках с GMP-совместимым способом. manner. GMP совместимость определялась как условие, позволяющее использование GMP-соотв. устройств и исследовательского уровня реагентов, которые доступны в качестве подходящего для GMP материала. При таких условиях мы разрушали до 90% аллелей CCR5 без заметной активности вне мишени, следовательно, использование TALEN высоко специфично. Разрушение региона, который кодирует N- конец CCR5 белка в CD4+ T клетках делает клетки резистентными к инфекции R5-tropic HIV-1, но, как и ожидалось, не к X4-tropic вирусу. Важно, что отредактированные по CCR5 CD4+ T клетки не обнаруживали каких-либо отличий от не отредактированных контрольных клеток в отношении пролиферации и потенции. Это указывает на то, что TALEN обеспечиваемое редактирование CCR5 является эффективным и безопасным для терапевтического применения в CD34+ HSCs.

Наши данные далее продемонстрировали, что низкая частота редактирования CCR5 недостаточна, чтобы устранить ВИЧ инфекцию, демонстрируя, что эффективное разрушение, которое обеспечивается биаллельными нокаутами гена являются важнейшими для достижения клинических эффектов.[15] Это согласуется с недавно опубликованным случаем, подтверждающим, что частота нокаута CCR5 в 18% в трансплантированных HSCs недостаточна для достижения клинического успеха.[20] Др. критической точкой для клинических испытаний является рекрутирование пациентов исключительно позитивных по R5-tropic HIV вариантам, поскольку отсутствие CCR5 будет способствовать распространению X4-tropic вирусов, если он присутствует у пациента. Важность соотв. проверки видна на примере “Essen пациента”[36], который страдал от возобновления X4 после аллогенной трансплантации Δ32 гомозиготных HSC. Осуществление нокаута обоих локусов, кодирующих ко-рецепторы, CCR5 и C-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR4), возможно для CD4+ T клеток [19, 37, 38], но не для HSCs, т.к. CXCR4 является существенным, напр., для HSC homing и развития B клеток.[39, 40]

Побочным эффектом подходов по редактированию генов является генотоксичность, как следствие OT эффектов. OT активность может индуцировать мутагенез, а также провоцировать хромосомные перестройки, оба могут вызывать трансформации клеток. Использование высоко специфичных разработанных нуклеаз является поэтому важным для снижения риска таких эффектов. Несколько инструментов доступно для идентификации событий OT, включая in silico предсказания, которые были использованы в случае [16, 34] и важны для miss important OTs. Др. проведенное исследование [33] по анализу OT с использованием секвенирования всего генома оказалось неспособным обнаруживать редкие OT события. В нашем исследовании мы тщательно оценивали OTs, используя как in silico предсказания, так и путем применения беспристрастного, базирующегося на клетках oligonucleotide capturing assay (OCA). Мы выявили два редких события OT, возникающие в интронах генов, тем самым минимизирующих риски побочных явлений. Напр., OT1/OCA3 в CNOT10 расщеплялись в 0.12% клеток. OCA идентифицировал три дополнительные OTs, один из низ в гене CCR2 . OCA показатели таких OTs были одинаково низкими для OCA3, подтверждая OT активности в пределах 0.1%. В то время как редактирование в окончательно дифференцированных клетках, таких как CD4+ T клетки, снижает риск возникновения озлокачествления, этого не происходит в случае редактирования генома в долго живущих мультипотентных стволовых клетках. Важно, что все функциональные методы, использованные этом исследовании продемонстрировали, что отредактированные по CCR5 клетки ведут себя как и не отредактированные, подтверждая, что экспрессия TALEN не оказывает какого-либо негативного влияния на эти клетки. В целом мы продемонстрировали, что наш новый разработанный TALEN обусловливает разрушение CCR5 с высокой частотой и с низкой генотоксичностью, прокладывает путь к переносу в клинику трансплантаций CD34+ гематопоэтических стволовых клеток.