Существует более 3-х тысяч генов человека, мутации которых связаны с генетическими нарушениями или болезнями, включая рак.[1-4] Как результат необходимы новые подходы, позволяющие сайт-спецфическое редактирование генов человека особенно для болезней с плохим прогнозом при использовании обычного лечения, такого как химиотерапия или традиционная генотерапия.[1] Streptococcus pyogenes CRISPR/Cas система может управляться с помощью короткой guide RNA (gRNA), чтобы генерировать сайт-специфические двунитчатые разрывы почти в любом геномном локусе человека.[5-8] В противоположность др. традиционным не нуклеазным технологиям, которые базируются на гомологичной рекомбинации, абсолютная эффективность CRISPR/Cas9-вызываемых альтераций драматически выше. [6, 8-10] Несмотря на высокую терапевтическую значимость системы CRISPR/Cas9, всё ещё остаются затруднения с надежностью и эффективностью доставки Cas9 нуклеазы в ядро клетки мишени.[9, 10] Вирусные векторы наиболее часто используются для доставки Cas9 нуклеазного гена. Однако, перенос в клинику потенциала вирусных векторов остается ограниченным в основном из-за возможной продолжительной токсичности, ассоциированной с риском интеграции последовательности вируса в геном человека.[11] Не вирусная доставка CRISPR/Cas9 системы может быть многообещающим способом терапии,[12-17] особенно принимая во внимание трудности с упаковкой гена Cas9 большого размера (около 4.2 kb) в вирусный вектор. Кроме того, не вирусные векторы существенно снижают риск интеграции последовательности вируса в геном человека.[18-20]

Базирующиеся на естественных сахаридах катионные переносчики генов были широко изучены благодаря своей биосовместимости и уникальной биологической активности.[21-25] Лактоза является естественным дисахаридом, содержащим один остаток глюкозы и один остаток галактозы. Установлено, что asialoglycoprotein receptor (ASGPr), C-type lectin преимущественно экспрессируется на поверхности паренхимных клеток печени и печеночных раковых клеток,[26] может ихбиратьельно соединяться с остатком галактозы и облегчать процесс эндоцитоза.[27-29] Следовательно, принимая во внимание преимущества ASGPr-обеспечиваемых свойств, целенаправленное воздействие лактозы может усиливать терапевтические эффекты при печеночных болезнях. Кроме того, была использована тактика преобразования reduction-responsive деградируемых катионовых векторов на интродукцию дисульфидных связей.[30-32] Дисульфидные мостики могут быть разорваны в восстановительной среде, чтобы способствовать высвобождению нуклеиновых кислот и снижению токсичности. Сообщалось, что polyhydroxy разветвленные катионовые переносчики генов обладают сверх способностью к биосовместимости и осуществлению трансфекции.[16, 31, 33] Предлагается стратегия приготовления polyhydroxy, reduction-responsive degradable lactose-derived разветвленных катионовых биополимеров для доставки системы CRISPR/Cas9 для лечения orthotopic hepatocellular carcinoma (HCC) посредством эффективного редактирования генов in vivo.

A lactose-derived branched cationic biopolymer (LBP) с богатыми дисульфидными связями и гидроксильными группами впервые был синтезирован посредством легкой one-pot разрывающей кольцо реакции. Биофизические свойства, такие как способность к упаковыванию и чувствительная к reduction способность к деградации, были исследованы сначала, чтобы определить пригодность LBP в качестве переносчика генов. Затем тестировали цитотоксичность, способность к трансфекции и способность к ASGPr-обеспечиваемому целенаправленному воздействию LBP на линии клеток BEL7402 HCC человека. Чтобы проверить пригодность LBP для доставки системы CRISPR/Cas9 редактирования генома, здесь мы использовали хорошо известный онкоген survivin (также наз. BIRC5) в качестве гена мишени. Как член семейства ингибиторов апоптоза (IAP),[34, 35] survivin известен двойной ролью своего белка, который непосредственно регулирует апоптоз и митозы в раковых клетках во время туморогенеза и метастазирования опухолей.[34, 35] Survivin экспрессируетя на высоком уровне почти во всех раковых клетках, включая и HCC, но не обнаруживается в нормальных взрослых тканях. Следовательно, survivin, как полагают, является привлекательной мишенью для противо-опухолевого лечения. Интересно, что мы наблюдали способность LBP явного целенаправленного воздействия на печень. pCas9-survivin (типичная CRISPR/Cas9 плазмида, которая целенаправленно воздействует и вызывает нокаут гена survivin) доставляемая с помощью LBP, была использована для оценки in vivo редактирования гена и противо-раковой эффективности посредством мышей nude, моделироющих orthotopic HCC. Кроме того мы исследовали, существует ли сенсибилизация между pCas9-survivin и sorafenib (SF, широко используемую в клинике multi-kinases целенаправленную терапию для лечения HCC[36]), чтобы повлиять на HCC у мышей.

Figure 1 Schematic illustration of the preparation of lactose-derived branched biopolymer (LBP) and the resultant delivery and gene editing processes with pCas9?survivin to treat orthotopic hepatocellular carcinoma (HCC). A lactose-derived branched cationic biopolymer (LBP) with plentiful bio-reducible disulfide linkages and hydroxyl groups was first synthesized via a facile one?pot ring?opening reaction, and the LBP-mediated delivery of pCas9-survivin, which could target and knockout survivin oncogene, showed effective gene editing and anti-cancer activities in orthotopic HCC mouse model.

a) GPC characterizations of LBP4 in the presence of DTT (10 mm) at different time points. b) AFM images of LBP4/pDNA complex at the mass ratio of 40 in the absence (?) and presence (+) of DTT. c) Cytotoxicity of LBP/pDNA and PEI/pDNA complexes in BEL7402 cell lines at various mass ratios (mean ± SD, n = 3). d) In vitro gene transfection efficiencies of LBP/pDNA complexes at mass ratios from 10 to 60 in BEL7402 cell lines in comparison with those mediated by PEI (Mw ? 25 kDa) at its optimal N/P ratio of 15 (mean ± SD, n = 3). e) CLSM images and flow cytometry of BEL7402 cells treated with LBP2/pDNA or LBP4/pDNA at the mass ratio of 40 and PEI/pDNA at the N/P ratio of 15 for 4 h in the absence (?) and presence (+) of lactose, where YOYO-1-labeled pDNA was shown in green, and DAPI-labeled nuclei were shown in blue. f) Representative fluorescence images of livers in different treatment groups (n = 3).

2.3 In Vitro Characterization with Reporter Plasmids

... Итак, LBP2 и LBP4 обладают низкой цитотоксичностью. Хотя LBP4 не обладает столь выдающимися свойствами целенаправленного действия как LBP2, но LBP4 обнаруживает лучший уровень трансфекции, чем LBP2 in vivo и in vitro. Поэтому, LBP4 с его сбалансированными способностями к целенаправленному воздействию и трансфекции был использован в дальнейшем для доставки системы CRISPR/Cas9 для редактирования генов и противо-ракового действия.

Figure 3 a) Structure of pCas9?survivn. b) Representative images of GFP expression mediated by the LBP4/pCas9 and PEI/pCas9 complexes in BEL7402 cells at the 24th hour after transfection, and the percentages of positive cells were determined by flow cytometry analyses. c) Agarose gel electrophoreses of enzyme digestion PCR products amplified from the survivin locus and off-target sites in BEL7402 cells in the absence (?) and presence (+) of T7EI enzyme. d) Sanger sequencing analysis and T-A cloning sequencing results of PCR amplicons of the targeted sites in control and LBP4/pCas9 groups. e) Western blot of three transfections with LBP4/pCas9 and their controls, and corresponding statistical analyses of relative content of survivin protein expression in control and LBP4/pCas9 at the 48th hour after transfection (mean ± SD, n = 3, *p < 0.05).

... Полученные результаты подтверждают способность к редактированию генома комплексов LBP4/pCas9. При этом BEL7402 клетки, обработанные LBP4/pDNA обнаруживали снижение экспрессии survivin. Нокаут онкогена survivin посредством pCas9 должен достоверно подавлять пролиферацию HCC клеток благодаря восстановлению способности к апоптозу (Figure S8a, Supporting Information). LBP4/pCas9/SF обнаруживает наилучшую подавляющую эффективность HCC клеток, демонстрируя, что pCas9 усиливает чувствительност раковых клеток к лекарствам. Усиливаются апоптические свойства pCas9 (Figure 4a). Процент апоптических BEL7402 клеток после воздействия PBS, LBP4/pDNA, LBP4/pCas9, SF и LBP4/pCas9/SF составлял 0.08%, 0.05%, 16.31%, 17.37% и 32.82%, соотв. (Figure S8b, Supporting Information). Продемонстрировано, что LBP4/pCas9 комплекс обнаруживает меньшую аггрегацию кристаллического фиолетового по сравнению с контролем или LBP4/pDNA группой. (Figure 4b). Figure 4 a) Flow cytometry analyses of the percentages of apoptotic cells at the 72nd hour after transfection in different treatment groups. b) Representative cloning formation images in different treatment groups. c) Representative images of BEL7402 cells in different treatment groups on the surface of lower chambers of Matrigel transwell at the 48th hour after transfection. d) Representative images of wound?healing assays of BEL7402 cells in different treatment groups from 0 to 72 h.

... Наблюдалось снижение инвазивной способности HCC клеток после трансфекции с помощью pCas9. Среди всех групп, LBP4/pCas9/SF всё ещё обнаруживала наивысший ингибирующий эффект на инвазию клеток (Figure 4c). Показано также, что pCas9 доставка с помощью LBP4 может более эффективно подавлять подвижность клеток по сравнению с контрольными группами или LBP4/pDNA группой. В частности, LBP4/pCas9/SF обнаруживает самый низкий процент закрытия ран среди всех групп (Figure 4d; Figure S8c, Supporting Information), подтверждая, что нокаут гена survivin повышает чувствительность HCC клеток к sorafenib.

Эти результаты показывают, что комплекс LBP4/pCas9 сам по себе может вызывать эффективное редактирование генов и подавлять злокачественные проявления HCC клеток. Более того, LBP4/pCas9 комплекс в комбинации с SF демонстрирует наилучший противораковый эффект.

Пролиферацию опухолей оценивали, используя in vivo био-люминисцентные изображения (Figure 5a; Figure S9a, Supporting Information) и tumor radiant эффективность (Figure S9b, Supporting Information). Группа LBP4/pCas9/SF обнаружила наиболее впечатляющий ингибирующий эффект на orthotopic HCC у мышей. Не выявлено достоверной потери веса тела, следовательно, LBP не обладает потенциальной токсичностью in vivo. Опухоли печни спустя 35 дней в группе LBP4/pCas9/SF имели минимальный объем во всех 5 группах. Следовательно, комбинация генотерапии и химиотерапии наиболее значительно ингибировала активность опухолей.

Figure 5 a) Representative bioluminescence, images of each treatment group at 0th and 35th day (n = 5). b) Liver images of each treatment group, where the orthotopic tumor nodules were highlighted with blue solid circles (n = 5). c) Sanger sequencing analyses and T?A cloning sequencing results of PCR amplicons of the targeted sites in the control and LBP4/pCas9 groups. d) Inmmunohistochemical analyses of Cas9 protein expression in heart, liver, spleen, lung, and kidney of the control and LBP4/pCas9 groups. e) Inmmunohistochemical analyses of survivin and ki?67 proteins expressions in tumor tissues after different treatments.

Продемонстрировано, что группе LBP4/pCas9 ген survivin подвергается генному редактированию с помощью pCas9 in vivo. Эффективность редактирования составляет 26.4% в orthotopic HCC. T-A клонирование PCR продуктов вместе с Sanger секвенироанием продемонстрировали, что делеции нуклеотидов возникают наиболее часто в местах редактирования гена (Figure 5c).

ki?67 является хорошо известным маркером пролиферации опухоли, который обычно избыточно экспрессируется в опухолевой ткани.[39] Показано, что экспрессия survivin и ki-67 обнаруживаются в опухолях группы LBP4/pDNA. IHC метод показал, что LBP4/pCas9/SF вызывает наиболее существенную редукцию экспрессии белка ki-67 в orthotopic HCC ткани. Кроме того, окрашивание H&E основных органов мышей не выявило достоверных отклонений после лечения (Figure S10, Supporting Information).

Итак, подтвержадется эффективная потеря функции онкогена после редактирования in vivo, при этом pCas9 , доставляемая с помощью LBP4 обладает эффективным противораковым действием и может способствовать чувствительности к лекарствам.

Происходящий из лактозы биополимер (LBP) успешно использован в качестве системы доставки CRISPR/Cas9 для геномного редактирования in vivo для лечения ортотопической гепатоцеллюлярной карциномы (HCC). Базируясь на биофизических и цитологических характеристиках, LBP обладает прекрасной reduction-responsive деградируемостью, биосовместимостью, способностью к трансфекции и к ASGPr-опосредованной способностью целенаправленного воздействия. Как и в обычной CRISPR/Cas9 системе, pCas9-survivin используется для подавления жизнеспособности HCC. LBP-обеспечиваемая доставка pCas9-survivin продемонстрировала эффективное редактирование гена in vitro, вызывая апоптоз HCC клеток и подавляя пролиферацию. Соотв., in vivo этот метод также подтвердил, эффектиную потерю функции онкогена за счет редактирования посредством нацеленной на печень доставки с помощью LBP системы CRISPR/Cas9. Кроме того, LBP/pCas9 комплекс также достоверно увеличивал противоопухолевый эффект лекарств посредством индукции нокаута онкогена survivin. Итак, представлена привлекательная и безопасная стратегия для рациональной разработки системы доставки CRISPR/Cas9.