Точное редактирование генов ограничено высокой изменчивостью генетических результатов широко используемого NHEJ пути репарации или низкой эффективности более точной гомологичной рекомбинации (rev. (1-4)). Эти недостатки часто приводят к осложнениям и трудоемким процессам отбора для идентификации интересующих генов для редактирования, особенно используется биаллельное редактирование клеток позвоночных (5,6). Когда модифицируемые клеточные линии, напр., высокой эффективности клеточные редакторы генов, могут приводить к трети от всех индивидуальных аллелей, остающихся in-frame после NHEJ репарирования; в результате нокаута клеток, где все копии содержат аллели сдвига рамки считывания, представляющие минимальные результаты (2,4). Кроме того, такая молекулярная гетерогенность обусловливает генотип-фенотип корреляции у F0 основателей у модельных организмов, подобных рыбкам данио, которые трудно интерпретировать, поэтому часто требуются сложные и со многими поколениями скрещиваний схемы, чтобы получить генотипически гомогенных животных прежде использования их в прямых физиологических методах (5,6). Эти ограничения NHEJ-based генного редактирования также потенциально редуцируют его использование в соматических подходах, таких как генотерапия или открытие генов. Для преодоления этого мы разработали альтернативный подход по редактированию генов, имеющий целью использовать MMEJ (Microhomology-Mediated End Joining) вместо NHEJ в качестве точного и подходящего подхода для обратной генетики.

Вследствие разрывов двойной нити ДНК (DSB), MMEJ как полагают соединяет возникающий в результате пробел ДНК c помощью: отжига (annealing) пары коротких участков (3-12 оснований) однонитчатого гомолога (microhomologies: µHs), возникающих в результате 5'-резекции концов DSB (7), отстригая возникающие в результате 3'-flap выступы (8,9), и, наконец, репарируя остов за счет лигирования (ligation) ДНК (10,11). Этот процесс приводит к характерной делеции, где последовательности между парой µHs используются для репарации и один из повторов сам по себе теряется (12) (see (13) for a review). Такой паттерн делеций пригоден в качестве эвристики (heuristic) для идентификации возможных базирующихся на MMEJ репараций в смешанном пуле репарации. Способность генерировать предсказуемые генотипы (14), иногда даже двать в результате одиночные крупные результаты (идентичный аллель у более половины исходов после редактирования) (15), это делает MMEJ привлекательной альтернативой по сравнению с NHEJ для точного геномного преобразования (16-19).

Нами и др (15,16,19) было почто, что DSBs целенаправленно полученные сайтах, скорее всего репарируются посредством MMEJ, существенно увеличивая гомогенность получаемых в результате репараций у рыбок данио. Несмотря на это неизвестен настоящий биохимический механизм того, как MMEJ репарирует DSBs, были описаны (20-23) программные инструменты, предсказывающие возникновение базирующихся на MMEJ только контекстных последовательностей, окружающих любой их данных желательный сайт DSB. В частности, мы опубликовали MENTHU (22), метод, который скринирует преимущественно генетические последовательности для DSBs, чтобы генерировать определенное большинство (single majority) исходов в результате MMEJ, в виде aka PreMAs (predominant MMEJ alleles) (Figure 1A and B). Противоположные обычным разработки целенаправленного воздействия, с использованием MENTHU-рекомендованных SpCas9 и TALEN мест разрезов в PreMAs используются боле часто, облегчая последующий скрининг venантных рыбок данио путем снижения изменчивости последовательностей возникающего пула аллелей (15). Одновременно инструменты ForeCasT (20) и inDelphi (23) были разработаны независимо для предсказания вероятности возникновения индивидуальных исходов репарации после вызываемых с помощью Cas9 в клетках млекопитающих DSBs и недавно были рассмотрены Lindel (21). Здесь мы описываем незавимое от выборки прогнозирование PreMA, осуществляемое с помощью MENTHU в стволовых клетках эмбрионов мышей (mESC) , используя в качестве движетеля ForeCasT, в сравнении его с inDelphi и Lindel, и предлагая улучшения к MENTHU. Кроме того, мы оцениваем способность inDelphi и Lindel предсказывать подавляющее большинство (single majority) сдвигов рамки считывания в результате инсерций 1 пн и соотв. предлагая метод MENdel, комбинацию MENTHU и Lindel для предсказания DSBs , скорее всего, в результате сдвига рамки считывания, вызываюшщей подавляющее число исходов. Наконец, мы оценивали практически MENdel в целом, используя сценарии случаев: генерацию нокаутов генов посредством мутаций сдвига рамки считывания. С этой целью мы осуществили скрининг, чтобы тестировать набор из 54 генов позвоночных (челвека и рыбок данио) варьирующих размеров для раннихCas9 и Cas12a обнаружимых сайтов, скорее всего, как результат single majority сдвига рамки считывания. Это делает возможным первоначальные подсчеты на пригодность инструментов предсказания репарации ДНК, таких как MENdel, чтобы идентифицировать воспроизводимые места репарации DSB на базе их частоты и распределения внутри кодирующей последовательности генов. Мы описали как MENTHU и inDelphi действуют сравнительно лучше, чем Lindel в отношении предказаний PreMA, как Lindel обеспечивает наилучшее прогнозирование инсерций в 1bp и как метод MENdel обеспечивает самое большое перекрывание для предсказаний сдвигов рамки считывания среди всех проанализированных инструментов, что способствует использованию MENdel для разработки экспериментов по редактированию генов для функциональной геномики или генотерапии, это подтверждено нашими подсчетами, что ~90% генов позвоночных будут иметь, по крайней мере, один ранний сайт мишень для DSB, скорее всего, в результате single majority сдвига рамки считывания.



Figure 1.
MENTHU predicts which DNA double-strand breaks likely result in single majority deletions. (A) Different DNA double-strand breaks (DSBs) can generate indel profiles with dissimilar distributions. Being able to discern the genotype heterogeneity level between targetable DSBs prior to experimental applications would be beneficial for reverse genetics and gene therapy applications. (B) MENTHU (22) is a software tool that analyzes the DNA sequence surrounding any given DSB and predicts whether it will result in a PreMA: an MMEJ-mediated repaired sequence where half or more of the repair outcomes share the same genotype. B'. MENTHU identifies every possible µH pair (with homology arms µH₁ to µH_n of length λ1 to λn) and calculates the corresponding distance between the µHs of each pair (δ1 to δn). B''. Based on the expected MMEJ deletion pattern, δi and λi are used to calculate the expected deletion length Δi . Pattern scores πi for every possible MMEJ deletion are calculated as described by Bae et al. (16). The MMEJ deletions are then rank ordered by descending pattern score and a MENTHU Score for the DSB is calculated by taking the ratio between the largest pmax and the second largest pattern score πmax-1. B'''. MENTHU utilizes two criteria that need to be concomitantly true for a DSB to be labeled as a PreMA. The δ of the MMEJ-deletion with the highest pattern score πmax and the MENTHU Score for the DSB need to be less than or equal to 5 bp and more than or equal to 1.50, respectively, for a positive PreMA prediction.

Итак, эксперименты по редактированию генов обычно выявляют склонную к ошибкам non-homologous end joining репарацию разрывов двойной нити ДНК. Микрогомологией обусловленное соединение концов (MMEJ) может генерировать более предсказуемые исходы в функциональной геномике и соматических терапевтических аппликациях. Мы сравнивали три алгоритма предсказания репарации DSB - MENTHU, inDelphi и Lindel - при идентификации MMEJ-repaired, homogeneous genotypes (PreMAs) на основании независимой базы данных из 5,885 самостоятельных Cas9-обусловленных событий репарации DSB в эмбриональных стволовых клетках. MENTHU правильно идентифицирует 46% из всех возможных PreMAs, чувствительность увеличивается в ~2- и ~60-раз по сравнению с inDelphi и Lindel, соотв. Напротив, только Lindel корректно предсказывает превалирующие инсерции в одно основание. Мы описали новый алгоритм MENdel, комбинацию MENTHU и Lindel, который обеспечивает наибольший прогнозируемый охват гомогенных out-of-frame мутаций в этой большой1 базе данных. Затем мы подсчитали частоты Cas9-целенаправленно вызываемых гомогенных сдвигов рамки считывания, индуцирующих DSBs в кодирующих регионах позвоночных в случае открытия генов с использованием MENdel. 47 из 54 генов (87%) содержали, по крайней мере, один ранний двиг рамки считывания, индуцирующий DSB и 49 из 54 (91%) давали подобный результат при выявлении Cas12a-обусловленных делеций. Мы полагаем, что использование MENdel поможет исследователям использовать MMEJ в области обратного генетического скрининга и с достаточной внутригенной плотностью значений, оставаясь жизнеспособным для почти всех редактирований генов с потерей функции благодаря терапевтическому редактированию.