Разработка стратегий персонализованной или прецизионной медицины приведет к увеличению использования подходов лечения на заказ под индивидуальные характеристики пациентов. Большая часть этого процесса спецификации лечения базируется на генетическом анализе пациентов или их опухолей. В то время как исследования генетики рака привели к новым стратегиям для более целенаправленной терапии рака, генетический анализ более доброкачественных состояний часто запаздывает. Публикации Traffic часто подчеркивают влияние мутаций на доставку белков при болезнях человека.^{1, 2} Идентификация генетических мутаций, ответственных за синдромы педиатрической врожденной диареи, представляет собой наглядный пример того, как генетический анализ влияет на диагностику и в конечном счете лечение моногенной патологии. В последние годы генетические исследования радикально изменили алгоритмы диагностики, пригодные для презентации синдромов врожденной диареи.³ Теперь, когда важно секвенировать полный экзом или полный геном у пациентов с не диагностированным синдромом врожденной диареи, то использование в новом веке персонализованной клеточной биологии, позволяющей выявлять генетические мутации, сегодня связано с быстрыми проявлениями изменений в клеточной биологии и клеточной физиологии.

Недавние исследования идентифицировали мутации в ключевых регуляторных белках, ответственных за врожденные синдромы диареи. Основной класс белков, затрагиваемых этими мутациями, являются белки, участвующие в доставке пузырьков в энтероциты, включая MYO5B, DGAT1, STX3, Munc18?2 и TTC7A.³ Эти мутации, по-видимому, нарушают доставку ключевых транспортеров в апикальную мембрану, чтобы обеспечивать соотв. абсорбцию натрия и воды из просвета кишечника. Вообще-то, наиболее изученный синдром врожденной диареи является microvillus inclusion disease (MVID), которая вызывается укорочением или миссенс мутациями в MYO5B это приводит к потере функции MYO5B.^{4, 5} Менее тяжелый родственный синдром врожденной диареи может вызываться мутациями или syntaxin 3 или MUNC-18-2.^{6, 7} Недавние исследования показали, что потеря MYO5B вызывает дефицит переноса в апикальную часть NHE3 и SGLT1, тогда как CFTR по-прежнему доставляется в апикальную мембрану.⁸ Т.к. болезнь впервые была описана по присутствию крупных включений в ворсинках выстилающих энтероцитов, и MYO5B KO мышиные модели подтвердили включения в микроворсинки, но это не является причиной дефекта апикальной доставки.^{8, 9} В самом деле, анализ включений микроворсинок у MYO5B KO мышей показал, что не распознанная апикальная часть пути эндоцитоза в энтероциты у этих мутантных мышей ответственна за образование этих включений.¹⁰ Эти находки продемонстрировали, как анализ генетических мутаций может приводить к распознаванию базовой клеточной биологической информации. Т.о., стало ясно в результате ряда исследований, что д. существовать множественные пути доставки пузырьков в апикальные мембраны энтероцитов и, скорее всего, множественные примеры эндоцитоза и рециклинга. В самом деле, разрушительное влияние потери MYO5B или инактивации может происходить благодарфя ряду Rab белков, которые могут взаимодействовать с MYO5B, включая Rab11a, Rab11b, Rab25, Rab8a, Rab10 и Rab6.^11-15

Пример MYO5B и MVID также подчеркивают наличие др. проблем при установке определенного диагноза у пациентов с врожденной диареей. Важно, что все пациенты с MVID обладают биаллельными MYO5B мутациям или в гомозиготной или в компаундной гетерозиготной форме. Индивиды с одиночным гетерозиготным мутантным аллелем не обнаруживают фенотипических проявлений. Присутствие двух поврежденных аллелей может быть подтверждено по биаллельному наследованию мутаций от родителей. Демонстрация биаллельного наследования подчеркивает, почему родители пробандов д. быть исследованы c помощью секвенирования "trio"-всего экзома (ie, секвенирования пациента и обоих родителей) как наиболее эффективный и обстоятельный способ генетического анализа. Когда один из родителей не доступен для секвенирования или когда один из аллелей может возникнуть в результате мутации de novo, то необходимы более сложные методы для демонстрации, что оба аллеля у пробанда повреждены,¹⁶, поскольку гетерозиготные мутанты MYO5Bстремятся быть бессимптомными. Также количество вновь идентифицированных мутаций в MYO5B продолжает увеличиваться. Поскольку некоторые из них могут быть обнаружены в определенных критических регионах моторного домена или моторном плече рычага, то вопрос о действительном влиянии может иметь важное значение для постановки диагноза. Поскольку морфологические критерии иногда могут помочь, т.к. присутствие включений в микроворсинках чрезвычайно изменчиво. В нормальных энтероцитах, MYO5B распределяется под апикальной щеточной каёмкой, так что отсутствие иммуноокрашивания MYO5B или неправильное расположение MYO5B м. поддерживать альтерации в функциональной моторной активности. Немногие моторные мутации были изучены непосредственно и нарушения функции мутантного белка могут быть продемонстрированы на примере мутации P660L, присутствующей у Navajo MVID пациентов.¹⁷ В то время, как полная потеря MYO5B, приводящая к MVID может быть воспроизведена на мышах,^{8, 9, 18, 19} влияние определенных мутаций на специфические аспекты болезни остаются неясными. Так, неясно, действительно ли определенные мутации могут индуцировать ряд болезненных проявлений, отражая изменчивость в тяжести дефицита доставки. Кроме того, поскольку большинство MVID пациентов обнаруживает тяжелую болезнь кишечника, также как и умеренный холестаз, то ясно только, что у некоторых пациентов может проявляться только болезнь печени.^{20, 21} Молекулярное воздействие этих мутаций не было определено детально, так что неясно, как эти MYO5B мутации вызывают преимущественно специфичные для печни проявления.

Мышиные модели предоставляют важные системы для интерпретации делеций и мутаций генов. Анализ мышиных моделей потери MYO5B является критическим для понимания дефектов доставки.^{8, 18} Более того, хорошо отлаженные методы продукции CRISPR мутаций у мышей сегодня разработаны и используются, помогая выявлять новые генетические мутации в течение 4-6 мес. Несмотря на это, вообще-то методы с наибольшей пользой заключаются в приготовлении и характеризации дефицитов клеточной биологии и физиологии в энтероидах, происходящих из биоптатов от пациентов или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) от пациентов. В частности, энтероиды, присутствующие культуре клеток in vitro, происходят из стволовых клеток, растущих в трехмерных матрицах, которые могут поддерживать все типы кишечных клеток и воспроизводить многие физиологические клеточные функции. Эти культуры энтероидов быстро развиваются из биоптатов пациентов в течение 4-6 недель и изучаются в ряде клеточных биологических систем, включая сравнение паттерна трафика в энтероидах с помощью иммуноокрашивания между биоптатами от пациентов и энтероидами. Человеческие энтероиды также могут поляризоваться в в монослои, и использовать их интерфейс воздух-жидкость для терминальной дифференцировке для получения полностью развитого щетиночного края и соотв. переноса транспортеров и апикальных энзимов в щетиночном крае. Происходящие из iPSC энтероциты могут быть также использованы и могут быть получены от пациентов с помощью эндоскопии, но процессы клональной дифференцировки сложны , а настоящая окончательная дифференцировка изучена недостаточно. Все эти происходящие от пациентов органоидные системы, моделирующие эпителиальный компартмент, который является фокусом для большинства синдромов врожденной диареи скорее, чем стромальные или иммунные элементы, которые вносят вклад в др. болезни, такие как с ранним началом воспаление толстого кишечника.

Остается вопрос, как детальный анализ альтераций клеточной биологии и клеточной физиологии, происходящих от мутаций белков переносчиков может быть внедрен в клиническую медицину, чтобы облегчить более быструю постановку диагноза и лечение. В случае врожденной диареи недавние публикации COngenital Diarrhea and Enteropathy (PediCODE) консорциума поспособствовали пути разработки энтероидов и органоидов из биоптатов во время первой диагностической эндоскопии, в сочетании с детальным иммуноокрашивающим фенотипированием ткани биоптата и секвенирования всего экзома пробанда и его родителей.³ Этот путь определенно предоставляет собой наиболее эффективный подход к таким болезням, но в случае идентификации новых мутаций, быстрые скоординироанные усилия для определения молекулярного влияния предполагаемой мутации необходимы. Подобные усилия часто могут определить патогенную мутацию и направлять терапевтические вмешательства, как, напр., у пациентов с мутациями, которые приводят к потере DGAT1.^22-24 Пока ускоренный генетический диагноз не может гарантировать, что возможно правильное лечение, а существующие генотерапевтические подходы не подходят для восстановления функции всего малого кишечника. Необходимо также признать, что некоторые синдромы врожденной диареи, обусловленные моногенными мутациями, даже угрожающими жизни, могут разрешаться спонтанно, если поддерживать детей в раннем детстве за счет полного родительского питания. Тогда слизистая кишечника сможет найти пути обхода специфических мутаций и вылечиться спустя определенное время.

Становится ясно, что вступаем в новую эру, когда характеристика клеточных биологических и клеточных физиологических функций пациентов на базе энтероидов и органоидов будет играть очень важную роль в постановке диагноза и назначении соотв. лечения. Чтобы достичь персонализованой клеточной биологии, врачи должны выстроить строгие взаимоотношения с клеточными биологами, чтобы объединить энтероидные препараты с характеристиками, а также с прямым молекулярным анализом в нормальный клинический способ действия для ведения пациента с врожденной диареей своевременно. Это значит, что клеточные биологи д. быть мобилизованы как часть общего коллектива врачей с привлечением генетиков и неонатологов.