Исследования, проведенные на монозиготных и дизиготных близнецах, вместе с др. затронутыми членами семей выявили строгую ассоциацию между общими генетическими состояниями и нарушениями, такими как ASD (Tick et al., 2016) и шизофрения (Sullivan et al., 2003). Успехи молекулярной биологии открыли уникальную возможность изучать точные генетические механизмы некоторых нарушений. Напр., исследования генетических ассоциаций позволили определить специфические локусы, чувствительные к генетическим аномалиям, картируя заслуживающих внимание кандидатов для целенаправленной терапии (Niemi et al., 2018).

Copy number variation (CNV) результат или делеции, дупликации или инверсии геномной последовательности. CNV является генетическим механизмом, позволяющим создание генетических отклонений в популяции, но они также могут оказываться причиной разных NDDs (Sebat et al., 2007; Takumi and Tamada, 2018). CNVs вызывают геномные отличия за стчет структурных вариантов, которые могут вызывать сложные перестройки аллелей и хромосом (Malhotra and Sebat, 2012) с помощью разных механизмов (Zhang et al., 2009). Хотя single-nucleotide polymorphisms (SNPs) являются главным источником общих генетических вариаций в популяциях, эффекты CNV, как было установлено, отличаются от эффектов SNPs на генетическую изменчивость экспрессии генов, так что нарушается доза генов и регуляция генов, это подчеркивает важность CNVs для генетических нарушений (Stranger et al., 2007). CNVs повсеместно присутствуют в геноме человека, обеспечивая разные уровни экспрессии генов у разных индивидов (Freeman et al., 2006). Это важно для выяснени этиологии разных состояний, таких как attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) (Elia et al., 2010), ASD (Pinto et al., 2010) и шизофрения (Xu et al., 2008).

WS, напр., является NDD, вызываемой гетерозиготными микроделециями в хромосоме 7q11.23 (Pober, 2010). Гаплонедостаточность, вызываемая с помощью делеций около 26 генов WS хромосомном регионе (WSCR) проявляется среди прочего плохой приспособленностью, чрезмерной дружелюбностью, уникальным интеллектуальным профилем и повышенной тревожностью (Pober, 2010). Идея существования специфических локусов, чувствительных к генетической изменчивости, находит подтверждение на примере хромосомного региона 7q11.23, поскольку микродупликации в WSCR, как было установлено, ассоциируют с ASD (Sanders et al., 2011; Morris et al., 2015). Следовательно, CNVs, такие как делеции и дупликации в WSCR вызывают когнитивные, биологические, физиологические и поведенческие дефекты, симптомы и фенотип которых зависит от генетической вариации.

Генетические альтерации, лежащие в основе NDDs могут затрагивать несколько генов. Однако, некоторые NDDs имеют моногенную причину (Renieri et al., 2003; Betancur and Buxbaum, 2013), такие как связанные с SHANK3 мутации при ASD (Peзa et al., 2011) и мутации потери функции methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2) при RTT (Amir et al., 1999). Моногенные NDDs связаны с нарушениями, обусловленными мутациями в одном гене. Предполагаемые механизмы моногенных NDDs могут включать SNPs, которые сильно меняют продукт гена (Zhou et al., 2016), и изменчивость генетической последовательности одного гена, включая делеции, дупликации, инверсии или замалчивание специфической последовательности одного гена (Kishino et al., 1997; Guy et al., 2001; Ramocki et al., 2010). Постнатальные терапевтические подходы могут предоставить лучшее лечение моногенным нарушениям.

Будучи фатальным для мужчин, RTT является прогрессирующим NDD у женщин, обычно вызывается de-novo доминантной потерей функции X-сцепленного гена MECP2 (Amir et al., 1999), заболевание характеризуется нормальным развитием до 6 - 18 мес., сопровождается тяжелым снижением психиатрической, моторной и лингвистической способности (Hagberg et al., 1983). MECP2 является геном риска, т.к. его дупликация ассоциирует с младенческой гипотонией, умственной отсталостью, эпилепсией, нарушениями речи и аутистическими свойствами у мальчиков, тогда как девочки остаются в основном незатронутыми болезнью (Ramocki et al., 2010). Fragile X синдром является еще одним примером NDD, ассоциированным с доминантной X-сцепленной аберрацией. Большинство случаев синдрома ломкой X вызывается замалчиванием транскрипции гена FMR1 (Fu et al., 1991). Затронутые индивидя являются в основном мужчинами и у них присутствуют симптомы, которые варьируют по тяжести и характеру, включая умственную и эмоциональную неспособность (Garber et al., 2008).

SHANK3 является пост-синаптическим каркасным белком, который формирует платформу для комплексов пост-синаптических уплотнений в glutamatergic синапсах (Baron et al., 2006; Monteiro and Feng, 2017). Гаплонедостаточность по SHANK3 ассоциирует с ASD, особенно с Phelan–McDermid синдромом (Wilson et al., 2003; Durand et al., 2007). Более того, мутации вставки одиночных неуклеотидов в одну из копий гена SHANK3 вызвали тяжелые нарушения речи и умственную отсталость у двух братьев (Durand et al., 2007). Моногенный вклад SHANK3 в ASD и ASD-подобные синдромы оценивали в немногих исследованиях, подтвердив необходимость дальнейшего изучения этого гена риска и его эффектов на NDDs (Moessner et al., 2007; Gauthier et al., 2009; Peзa et al., 2011; Mei et al., 2016; Zhou et al., 2016; Amal et al., 2018).

Эпигенетические модификации рассматриваются как промежуточное звено между биологией и внешнесредовыми влияниями (Feil and Fraga, 2012). Основные эпигенетические механизмы включают метилирование ДНК (Moore et al., 2013) и модификации гистонов (Bannister and Kouzarides, 2011). Хотя оригинальная последовательность ДНК остается неизменной, эпигенетические альтерации влияют на экспрессию генов и функцию клеток (Dall’Aglio et al., 2018). Эпигенетика и некоторые NDDs оказываются связаны, включая ASD (Ladd-Acosta et al., 2014) и ADHD (Wilmot et al., 2016).

Впечатляющим примером NDD, вызываемым эпигенетическими альтерациями, является AS, характеризующийся уникальным когнитивными, личностными и физиологическими профилями, включая умственную отсталость, частые судороги повышенную улыбчивость и веселость (Kishino et al., 1997). AS обусловлен генетическим механизмом, наз. импринтинг, при котором материнский и отцовский аллель отличаются своим вкладом в фенотипические проявления благодаря метилированию неактивного аллеля (Kishino et al., 1997). AS характеризуется дефектом в материнской копии гена UBE3A, которая может быть делетирована (70%), мутирована (10%), отсутствовать (однородительская дисомия, 2–3%) или функционировать неправильно из-за дефекта импринтинга (3–5%) (Williams et al., 1995). Подобно AS, Prader–Willi syndrome (PWS) также вызывается дефектами UBE3A. Однако, при PWS, отцовская копия UBE3A неактивна (из-за делеции или по др. причинам) (Cassidy, 1984). AS и PWS обнаруживают нарушения функций в 15q11.2-q13, но они отличаются, при этом неактивный аллель является результатом метилирования; материнская копия при AS и отцовская копия при PWS (Knoll et al., 1989; Reis et al., 1994). AS и PWS подтверждают идею, что не только имеет значение тип генетического варианта (делеция, дупликация, инверсия), предопределяющий эффекты биологические и поведенческие аспекты, но и также качественные особенности поврежденного аллеля.

Успехи молекулярной биологии позволили ученым получить четкую информацию о генетических основах, отвечающих за определенные NDDs. Напр., индивиды с WS обнаруживают сходный генетических дефект в 95% случаев (Korenberg et al., 2000). Однако, генетическая архитектура большинства NDDs очень сложная (Devlin and Scherer, 2012; Lesch, 2016; Deciphering Developmental Disorders Study, 2017), и поэтому необходима разработка множественных генетических терапевтических подходов, чтобы повысить арсенал позитивных воздействий. Более того, генетические дефекты включают не только мутации, передаваемые зародышевой линией, но и также пост-зиготические de-novo мутации, которые могут вносить вклад в соматический мозаицизм головного мозга, вызывая в результате аномальное развития головного мозга и NDDs (D’Gama and Walsh, 2018). Кроме того, генетические основы NDDs могут быть полигенными, затрагивая многие системы органов и регионы головного мозга и вызывая аномальное когнитивное и физиологическое развитие на всю жизнь. Более того, поскольку гены риска возникновения NDD, такие как ASD, были классифицированы как обладающие синаптической активностью или важные для развития, то недавние исследования показали, что такое подразделение не аккуратное, поскольку генетические мутации могут приводить ко множественным дефицитам (Heavner and Smith, 2020). Подтверждение таких барьеров чрезвычайно важно для выяснения генетических причин NDDs и разработки генетических терапевтических инструментов.

Высокая гетерогенность генетических дефектов, таких как CNVs, SNPs и эпигенетических повреждений ограничивает наши усилия связать специфические дефекты генов с соотв. поведенческими и нейрологическими фенотипами (Devlin and Scherer, 2012). Эти ограничения существуют и в клинике, где ASD, напр., диагностируется в основном на исследовании поведения индивида и на базе DSM руководств и в меньшей степени на генетическом скрининге или биологических исследованиях.

Разные животные модели, такие как грызуны (Crawley, 2012) и non-human primates (NHPs) (Kishi et al., 2014; Miller et al., 2016), обладают некоторыми хорошо сохранившимися биологическими и поведенческими характеристиками, которые присутствуют и у людей. Поэтому моделирование генетических состояний людей с использованием лабораторных животных очень важно для понимания механизмов, лежащих в основе разных симптомов и фенотипов при разных генетических нарушениях.

Генетические инструменты, такие как система Cre-LoxP (Schwenk et al., 1995) и CRISPR-Cas9 (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats and CRISPR-associated protein) (Ran et al., 2013) позволяют создавать животные модели, которые экспрессируют специфические человеческие или не человеческие генетические состояния, ответственные за возникновение NDDs. Использование этих генетических инструментов на разных ст. развития дает механистическое понимание траектории развития таких генетических альтераций и понимание аномального развития при разных NDDs (Amir et al., 1999; Sakurai et al., 2011; Segura-Puimedon et al., 2014; Enkhmandakh et al., 2016; Zhou et al., 2016). Напр., точное целенаправленное воздействие на специфические гены, которые делетируются при WS, с использованием этих генетических инструментов помогают выявлять роль и нижестоящие взаимодействия генов, делетируемых из WSCR у людей, улучшая нашу способность анализировать, как делетируемый ген при WS ассоциирован с разными фенотипическими отклонениями, связанными с нарушением (Sakurai et al., 2011; Segura-Puimedon et al., 2014; Barak et al., 2019). Однако, одни и те же манипуляции у модельных животных и человека не всегда дают те же самые биологические или поведенческие фенотипы (Osborne, 2010, Zoghbi and Bear, 2012).

Разные NDDs, такие как ASD и шизофрения, обладают сходными генетическими основами (de Lacy and King, 2013). На молекулярном уровне было предположено, что дефекты развития и поддержания синапсов являются ключом к возникновению этих нарушений (Kenny et al., 2014). Shank3 является интересным геном в смысле наблюдения взаимодействий между ASD и шизофренией. Недавно разные мутации Shank3 у мышей, как было установлено, приводят к дисфункции синапсов и к ASD или характерным для шизофрении мотивам (Zhou et al., 2016).

Мышиная модель позволяет нам получить значительно больше механистической информации по этиологии NDDs. Напр., использование мышиной модели для WS, позволило выявить новый аспект того как WS проявлятся с ЦНС (Bey and Jiang, 2014; Barak et al., 2019). Результаты этого исследования показали ключевую роль нейронального гена Gtf2i, гена, связанного с hypersocial фенотипом (Dai et al., 2009; Antonell et al., 2010; Sakurai et al., 2011; Borralleras et al., 2015), участвующего в формировании и поддержании миелина. Аномалии целостности белого вещества головного мозга обнаружены на мышиных моделях WS и затем были оценены в тканях людей, пролив новый свет на способ действия нарушения в ЦНС и обнаружив новые перспективы потенциальных терапевтических агентов для WS у людей (Barak et al., 2019).

Др. NDD, изученным механистически на мышиной модели , стал синдром ломкой Х. Избыточная активация mGluR5, metabotropic рецептора глютамата, как было установлено, вносить вклад в патологию синдрома ломкой Х (Dцlen et al., 2007). Кроме того, RTT также был смоделирован на мышиных моделях, когда мыши несли укороченный аллель Mecp2, вызывающий нарушения обучения и памяти, дисфункцию синапсов и аномалии ультраструктуры синапсов на ранних ст. развития, указывая на ранний временной промежуток для описываемого патогенеза RTT (Moretti et al., 2006).

Из-за удивительных различий между грызунами и людьми , исследования, проведенные на грызунах не воспроизводились при клинических испытаниях (Hyman, 2014; Izpisua Belmonte et al., 2015). Чтобы заполнить этот пробел, были исследованы генетические инструменты для создания NHP моделей разных медицинских обстоятельств (Okano et al., 2012; Kishi et al., 2014; Kumita et al., 2019). NHP модели, как полагают, более аккуратно представляют обстоятельства у людей, как в когнитивных, так и биологических аспектах, благодаря снижению эволюционного расстояния между этими животными моделями и людьми. Однако, генетические инструменты для NHPs всё ещё далеки от уровня, применяемого в исследованиях грызунов.

В 2009, трансмиссия через зародышевую линию была достигнута у обычных мартышек (Callithrix jacchus), это предоставило исследователям альтернативную модель для изучения событий у людей (Sasaki et al., 2009). Обычные мартышки оказались ценными кандидатами для моделирования NDDs благодаря своим уникальным поведенческим и когнитивным свойствам, сходными с таковыми у людей (Dell’Mour et al., 2009), и общими биологическими, анатомическими и онтогенетическими характеристиками с людьми (Abbott et al., 2003).

После мартышек были получены и др. NHP модели NDDs (Zhou et al., 2019), используя генетические инструменты, такие как экспрессия генов вирусов и редактирование генов с помощью CRISPR-Cas9. Напр., избыточная экспрессия Mecp2 (Liu et al., 2016) или дефицит Shank3 (Zhou et al., 2017) были смоделированы на cynomolgus обезьянах (Macaca fascicularis), в попытке лучше понять и охарактеризовать дефекты нейронов и поведения при ASD. Были также разработаны модели RTT на cynomolgus обезьянах, используя TALEN редактирование. Сходство между проявлениями RTT у моделей и людей было удивительным, включая структурные, поведенческие и иммунологические аспекты (Chen et al., 2017).

Чтобы понять, действительно ли генетические основы и поведенческие отклонения при NDDs являются общими между животными моделями и людьми, учены разработали технику для проверки выдающихся поведенческих характеристик при разных NDDs у животных, такие как повторяющееся поведение (Crawley, 1999, 2008; Moy et al., 2008), OCD (Burguiиre et al., 2015; Monteiro and Feng, 2016), когнитивные свойства (Brooks et al., 2005; Crawley, 2008; Wolf et al., 2016), нарушения социального поведения (Crawley, 1999, 2008; Moy et al., 2008; Netser et al., 2009), моторные функции и страхи (Crawley, 1985). Эти тесты позволили оценить новые животные модели для разных NDDs и также проверить, действительно ли потенциальное лечение облегчает поведенческие дефекты.

Нервная система человека постоянно меняется (Marнn, 2016; Silbereis et al., 2016), при этом в специфические периоды в ходе развития пластичность и чувствительность головного мозга изменяются очень сильно, также известны критические периоды (Hensch, 2004; Hьbener and Bonhoeffer, 2014). Одним из механизмов, как полагают, играющим основную роль в NDDs, является аномальное образование и регуляция синапсов и белковых комплексов во время таких критических периодов (Ramocki and Zoghbi, 2008; Harlow et al., 2010; Zoghbi and Bear, 2012; Meredith, 2015; Marнn, 2016). Прекрасным примером важности времени терапевтического воздействия стало недавнее исследование мышиной модели AS, которое продемонстрировало дифференциальную эффективность возобновления экспрессии Ube3a на разных ст. развития (Silva-Santos et al., 2015). Это исследование продемонстрировало, что хотя синаптическая пластичность в гиппокампе восстанавливается независимо от времени вмешательства, но др. симптомы, такие как моторные дефекты, страхи, повторяющееся поведение и эпилепсия облегчались только при раннем вмешательстве (Silva-Santos et al., 2015).

Однако, в некоторых работах обсуждается роль критического периода для воздействия на NDDs. Недавнее исследование показало, что некоторые из фенотипических отклонений, присутствующих при этих нарушениях, могут быть облегчены или обращены вспять в результате постнатального воздействия, после окончания критического периода (Ehninger et al., 2008; Castrйn et al., 2012; Hьbener and Bonhoeffer, 2014). Напр., кондиционная knock-in мышиная модель Shank3 показала, что восстановление экспрессии Shank3 у взрослых мышей приводит к улучшению как на молекулярном, так и поведенческом уровне (Mei et al., 2016). Более того, нейрологические дефекты на мышиных моделях RTT смягчались после реактивации экспрессии MeCP2 как у взрослых, так и незрелых мышей (Guy et al., 2007). Эти исследования подтвердили, что разные регионы головного мозга и функции имеют отличающиеся критические периоды и что постнатальные генетические воздействия при NDDs могут быть эффективными даже после применения на поздних постнатальных стадиях.

Доставка терапевтических агентов к областям мишеням по всему телу и особенно в головной мозг является ещё одной проблемой для разработки генотерапии. Перенос терапевтических агентов в ЦНС нуждается в преодолении гемато-энцефалического барьера (BBB) (Hawkins and Davis, 2005; Abbott et al., 2010). К сожалению, большинство терапевтических агентов не может проходить через BBB без дополнительного вектора переноса (Pardridge, 2005). Как результат доставка генов в ЦНС сильно зависит от инвазивности метода, позволяющего прямое воздействие терапевтического вектора на специфические регоны головного мозга, исключающего необходимость пересечения BBB. Методы прямого вмешательства в ЦНС включают доставку через череп с помощью intraparenchymal, intracisternal, intrathecal и intracerebroventricular инъекций [Figure 1]. Эти инвазивные методы обычно нуждаются в stereotaxic инъекциях и хирургических вмешательствах, с возможностью использования долго-действующих депо или катетров, высвобождающих лекарства. Основными преимуществами использования таких методов доставки является обхождение BBB и прямое воздействие высоких концентраций терапевтических агентов на специфические регионы головного мозга. Однако, эти методы считаются менее терапевтическими из-за необходимости терапевтического вмешательства и склонностью к инфекциям и др. хирургическим осложнениям, приводящих к повышению внутричерепного давления.

Figure 1: Illustrative description of routes of administration of gene-therapy agents. (A) Facial vein injection in neonatal pup, (B) retro-orbital injection, (C) tail vein injection, (D) intrathecal injection, (E) stereotaxic injection.

Неинвазивные подходы особенно для трансдукции ЦНС, включают внутривенные (IV) и назальное введение лекарств. методы IV введения [Figure 1] просты и эффективны с использованием ветора переноса, который может пересекать BBB, такой как adeno-associated virus (AAV) серотипа AAV9 (Zincarelli et al., 2008; Duque et al., 2009; Foust et al., 2009) и PHP.eB (Chan et al., 2017; Dayton et al., 2018). Системное применение, благодаря своей природе наиболее пригодно для терапии и его легко осуществлять на непрерывной основе. Однако, системное введение имеет и некоторые недостатки, такие как: 1) ограниченное биораспределение терапевтического агента по всему телу, приводящее к низким концентрациям терапевтического агента в мишени и тем самым требующее доставки более высоких доз лекарства по сравнению с инвазивными методами; 2)мультисистемная иммунная реакция, зависимая от вектора переноса; 3) токсичность в разных тканях, таких как печени из-за усиленного накопления агента. Введение через нос, позволяет обходить BBB благодаря транспортировке лекарства через носовую полость в ЦНС. Увеличиваются доказательства эффективности внутри-носового переноса лекарств в ЦНС, в частности частиц, которые неспособны к самостоятельному пересечению BBB (Crowe et al., 2018).

AAV является непатогенным, не иммуногенным агентом переноса, способным целенаправленно воздействовать на ткани и органы после генетического преобразования вируса (Burger et al. 2005; Mandel et al., 2006; Duan, 2016; Hocquemiller et al., 2016; Srivastava, 2016; Naso et al., 2017; Hudry and Vandenberghe, 2019). Использование AAV стало широко распространенным во многих биологических исследованиях, т.к. является эффективным инструментом переноса и манипуляций с генами (Hermonat and Muzyczka, 1984; Kay et al., 2001; Daily et al., 2011; Borralleras et al., 2015; Luoni et al., 2019), с обнадеживающими результатами и клиническими успехами (Mingozzi and High, 2011; Ylд-Herttuala, 2012). Др. вирусные векторы, такие как лентивирусы — подтип ретровирусов, также пригодны для генотерапии (Dull et al., 1998; Galimi and Verma, 2002; Park, 2007; Cockrell and Kafri, 2011); но здесь основное внимание AAV (Hacein-Bey-Abina et al., 2003a, b) и генотоксичности (Montini et al., 2006). Одним из примеров использования AAV в качестве терапевтического агента при NDD является введение экзогенного Ube3a у мышей, моделирующих AS (Daily et al., 2011). Прямое введение Ube3a-трансдуцирующего AAV9 вектора в гиппокамп улучшает раннюю фазу long-term potentiation (LTP) и ассоциативное обучение AS мышей по сравнению с контролем (Daily et al., 2011). Др. примером исследования восстановления гена при использовании AAV при непосредственном введении в ЦНС стали мыши, моделирующие WS (Borralleras et al., 2015). Инъекции внутрь цистерн Gtf2i-трансдуцирующего вектора мышам с полной делецией WSCR улучшало поведенческие признаки, такие как координация движений, общительность и страхи и нормализовало экспрессию молекулярных факторов, таких как brain-derived neurotrophic factor (Bdnf) в специфических регионах головного мозга (Borralleras et al., 2015). Первоначально способность преобразованного вектора AAV была ограничена, между двумя инвертированными терминальными повторами помещалось не более 4.7 kb (Wu et al., 2010). Во-вторых, даже если AAV в основном не патогенен и не иммуногенен, в некоторых исследованиях обнаружены доказательства печеночной генотоксичности AAV вследствие манипуляций с геном in vivo с помощью AAV вектора, приводящих к гепатоцеллюлярной карциноме (Donsante et al., 2007; Chandler et al., 2015) and liver failure (Hinderer et al., 2018). Использование метода AAV обладает критическим ограничением применительно к NDDs, которое вызывается генетическими дефектами в ЦНС, поскольку проникновение AAV через BBB ограничено. Это ограничение требует прямого введения вектора в ЦНС с помощью хирургического вмешательства, тем самым снижается ценность такого лечения в клинике. Однако, недавно получена новая и захватывающая AAV капсида, PHP.eB, с улучшенной эффективностью проникновения BBB при системном введении вируса (Chan et al., 2017). Интересно, что RTT мыши с генетически кодируемой мутацией Mecp2 были подвергнуты лечению с помощью IV системного использования Mecp2-трансдуцирующего PHP.eB вируса в возрасте 4 недель, в результате наблюдалась задержка прогрессирования симптомов и увеличение продолжительности жизни (Luoni et al., 2019).

NDDs мало пригодны для генотерапии с помощью AAV, т.к. большинство из них проявляется в виде системных нарушений и не являются моногенными и нуждаются в терапевтических агентах, проникающих в ЦНС.

Естественно возникшие AAVs имеют ограниченный тропизм и поэтому необходим метод селекции AAV, склонных к специфическим типам клеток. Cre recombinase-based AAV targeted evolution (CREATE) является методом разработки капсид AAV с высокой трансдукционной эффективностью и клеточной специфичностью (Deverman et al., 2016). Путем использования CREATE, разработаны ЦНС-специфические капсиды, способные к успешной трансдукции нейронов с помощью PHP.B и PHP.eB серотипов и трансдукции астроцитов с помощью PHP.S серотипа (Chan et al., 2017). Помимо преобразования капсид специфичность трансдукции увеличивается благодаря зависимой от промотора экспрессии трансгена (Shevtsova et al., 2005; Gray et al., 2011). Следовательно, трансдукция специфических типов клеток ЦНС посредством IV системного применения сегодня осуществима с помощью исправленных вектора, капсид и промотора. Необходима разработка ткане-специфических капсид и определение специфичных для типов клеток промоторов.

Расширение способностей кассет для AAV трансдукции трансгенов также важно для для облегчения генетического воздействия с помощью AAV. Экспрессия трансгена в векторе зависит от интересующего гена, клеточно-специфического промотора и репортерной последовательности и способности включать не более 4.7 kb, всё это ограничивает потенциал повторного внесения более длинных генов. Сегодня используются подходы с двум и тремя векторами, каждый из которых экспрессирует часть трансгена (Duan et al., 2001, 2003; Hirsch et al., 2016; Pate et al., 2019). Исследования на NHP с использованием AAV в качестве генотерапии редки, особенно при NDDs. Всё же AAV успешно трансдуцировали экспрессию генов у NHP (Samaranch et al., 2012; Hinderer et al., 2014; Gyцrgy et al., 2019).

CRISPR-Cas9 является ценным модификатором генетических последовательностей и функции, обнаруживая при этом огромный потенциал для клинического использования. Геномное редактирование с помощью CRISPR в основном однократное, продолжительное (Cong et al., 2013; Doudna and Charpentier, 2014; Sander and Joung, 2014). CRISPR в основном используется для генерации трансгенных модельных животных (Wang et al., 2013; Yang et al., 2013; Niu et al., 2014; Kumita et al., 2019; Offen et al., 2019; Qiu et al., 2019; Zhou et al., 2019) и для ex vivo генетических манипуляций, позволяющих создавать генетически модифицированных линий клеток в течние 2–3 недель (Ran et al., 2013). Однако, технология CRIPSR сталкивается с проблемами, такими как лшоаниченная эффективность HDR и методов доставки.

Для преодоления ограничений в доставке, предлагается использование AAV в качестве вектора переноса Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9, 4.2 kb) и sgRNA (Senнs et al., 2014). Однако, из-за ограничений способности AAV’ к упаковке трансгена, предложено использование двух векторов, несущих или SpCas9 или sgRNA молекулу. В 2014, in vivo генетическое редактирование с помощью CRISPR-Cas9 было осуществлено с двумя векторами, с помощью манипуляций с уровнями немногих генов в ЦНС мышей, включая Mecp2 ассоциированный с RTT и нарушениями в виде умственной отсталости (Swiech et al., 2015). Химерные серотипы разных AAV векторов были также модифицированы, чтобы улучшить эффективность трансдукции ЦНС, делая возможным перенос sgRNA, нацеленной на специфический ген риска шизофрении miR137 и делетируя его ЦНС-специфическим способом у CRISPR-Cas9 knock-in мышей (Murlidharan et al., 2016). В др. исследовании CRISPR-обусловленная супрессимя экспрессии мутантного гена Htt (mHtt) в striatum HD140Q knock-in мышей, моделирующих болезнь Huntington’s, ослабило двигательные нарушения (Yang et al., 2017).

Более короткие ортологи молекулы Cas9 были недавно обнаружены, такие как Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9, 3.16 kb) (Ran et al., 2015) и Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9, 2.95 kb) (Kim et al., 2017), со всё увеличивающимся потенциалом действия в качестве экспрессионного вектора для CRISPR, способные упаковывать Cas9 нуклеазу и sgRNA в один AAV вектор.

Геномное редактирование соматических клеток ЦНС с терапевтической целью оказалось возможным olkz коррекции мышечной дистрофии Дюшена у взрослых модельных мышей путем использования воздействия AAV-CRISPR, базирующееся на SaCas9 (Nelson et al., 2016). Подход с не вирусной доставкой также является подходящим для переноса CRISPR-родственных продуктов в ядра ткане-специфическим способом. Напр., комбинация AAV и липидных наночастиц для доставки CRISPR продуктов в печень оказывает терапевтическое действие (Yin et al., 2016). Однако, инструменты для системной доставки липидных наночастиц и др. не вирусных молекул в ЦНС пока ещё в разработке. необходимо также подтверждение потенциала CRISPR-обеспечиваемой генотерапии для лечения NDDs.

Antisense oligonucleotides (ASOs) короткие последовательности нуклеиновых кислот, способные гибридизироваться со специфическими молекулами мРНК и мешать дальнейшей их трансляции в белок (De Mesmaeker et al., 1995). Такие ASOs являются главными кандидатами модификации уровней белка и действуют как терапевтические агенты при NDDs, вызывая неправильную экспрессию генов. Напр., синдром дупликации MECP2 распространенное NDD у мужчин, вызывает 1% из необъясненных случаев X-сцепленной умственной отсталости (Lugtenberg et al., 2009). Затронутые индивиды обнаруживают судороги, эпилепсию, повторяющиеся инфекции, умственную отсталость и задержку психомоторного развития (Ramocki et al., 2010; Van Esch, 2011). Постнатальное использование ASO для лечения облегчает симптомы у взрослых мышей, имеющих трансгенную дупликацию Mecp2 и моделирующих RTT (Sztainberg et al., 2015). Более того, ASO воздействие коррелирует с уровнями экспрессии MECP2 мРНК в лимфобластоидных клетках пациентов с дупликацией MECP2 (Sztainberg et al., 2015).

Воздействие специфической последовательностью ASOs, направленной против Ube3a-ATS приводит к снижению Ube3a-ATS и увеличению уровней Ube3a in vitro и in vivo. В клинике воздействие ASO активирует молчащий отцовский Ube3a аллель по всему головному мозгу смягчает когнитивный дефицит у животных, моделирующих AS (Meng et al., 2015).

ASOs также оказались эффективны в ходе лечения др. связанных с ЦНС состояний, таких как восстановление слуха у мышей, моделирующих тяжелую мышечную атрофию (Passini et al., 2011). Всё это подтверждает терапевтический потенциал ASO при разных связанных с ЦНС состояний, включая и NDDs.

Хотя область генотерапии быстро прогрессирует, количество успешных клинических испытаний пока ограничено. Некоторые многообещающие аспекты прогресса в этой области необходимо развивать дальше, среди них упомянутые выше такие как RNA interference (RNAi) и не вирусные методы генотерапии.

RNAi это процесс, при котором малые, некодирующие РНК последовательности, такие как short interfering RNA (siRNA) (Chang et al., 2009) и microRNA (miRNA) (Lee et al., 1993; Lee and Ambros, 2001; Shomron, 2010), регулируют экспрессию генов посредством деградации мРНК или подавления трансляции белков сиквенс-специфическим образом. Нарушение регуляции RNAi молекул, ассоциированное с NDDs (Chang et al., 2009; Xu et al., 2010; Meza-Sosa et al., 2012; Sun and Shi, 2015), подчеркивает их пространственно-временную значимость для нормального развития головного мозга. Ведутся обширные исследования роли т механизмов процессов RNAi в качестве возможных новых терапевтических подходов.

Многообещающими устройствами для осуществления генотерапии в ЦНС включают использование наночастиц (Lee et al., 2018), который способны переносить некоторые терапевтические агенты, такие как нуклеиновые кислоты и белки. Более того, наночастицы обеспечивают клеточно-специфическую доставку своего груза и снижают токсичность (Mizrahy et al., 2019). Соотв. субнаборы наночастиц, являющиеся полимерными наночастицами (Dikpati et al., 2012), солидными липидными наночастицами (Hou et al., 2003) и нанолипосомами (Allen and Cullis, 2013), все они обладают способностью проходить через BBB.