Прогрессирующий семейный внутрипеченочный холестаз (PFIC) тяжелое врожденное заболевание печени, обнаруживаемое в ранний период жизни с высокими уровнями сывороточных желчных солей и биллирубина. Описано 6 типов болезни, две из них обусловлены дефицитом ABC транспортера; ABCB11 (bile salt export pump) у типа 2; ABCB4 (phosphatidylcholine floppase) у типа 3. Кроме того, функция ABCB11 затрагивается и у 3-х др. типов PFIC. Отсутствие эффективного лечения делает необходимой трансплантацию печени у большинства пациентов. Наблюдаются долговременные побочные эффекты, напр., обусловленные пониженной супрессией иммунитета, необходимой для предупреждения отторжения органа, генотерапия может быть подходящим подходом, на что указывают исследования животных, моделирующих PFIC3.

PFIC является гетерогенной группой рецессивно наследуемых тяжелых нарушений печени [1,2]. Все типы присутствуют с детства или младенчества со всё увеличивающимися сывороточными желчными солями и биллирубином, сопровождаемых зудом, оказывающим существенное влияние на качество жизни. Все формы PFIC

редкими аутосомными рецессивными заболеваниями, а недостаток накачки желчных кислот (BSEP) нарушает обработку желчных кислот, наблюдаемую при тяжелых формах болезни. Недостаточность может быть обусловлена мутациями в гене ABCB11, кодирующем BSEP, напр., или потерей экспрессии BSEP в результате мутаций в гене NR1H4, кодирующем Farnesoid X Receptor (FXR), который важен для экспрессии BSEP [3-6]. Отсутствие BSEP в мембранах канальцев, обусловленное мутациями в Myosin VB (MYO5B), используемых для его транспорта, или снижение активности BSEP, обусловленное нарушениями целостности и состава мембран канальцев, нарушает экспорт желчных солей из гепатоцитов [7-9]. Помимо нарушений экспорта желчных солей, PFIC может возникать в результате дефицита ABCB4, участвующего в поддержании phosphatidylcholine в желчи, необходимого для смягчения эффекта детергента, влияющего на желчные соли путем формирования смешанных мицелл [10]. Недавно выявлены мутации в Tight Junction Protein 2, кодируемым геном (TJP2) в качестве причины PFIC [11]. Хотя мутации TJP2 могут нарушать целостность плотных соединений, такие пациенты не страдают от холеостаза и др. холангиопатий, как этого следовало ожидать в случает протекания желчи и как наблюдается при дефиците Claudin, напр.[1]. Все типы PFIC я. моногенными нарушениями и в конечной стадии нуждаются в трансплантации печени.

Все формы PFIC сопровождаются желтухой и повышенными уровнями желчных кислот в сыворотке [1]. Начало болезни варьирует между разными типами PFIC. ABCB11/BSEP (PFIC2), TJP2 (PFIC4) and FXR (PFIC5) обнаруживается в первый мес. после рождения и быстро прогрессирует. Наличие дефицита ATP8B1 (PFIC1) часто обнаруживается спустя месяцы после рождения, его прогрессия умеренная. Обе др. формы с дефицитом ABCB4 (PFIC3) и MYO5B (PFIC6) диагностируются позднее в разных возрастах и обнаруживают умеренную или медленную прогрессию [1]. После диагностики холестаза; сывороточные параметры, биопсия печени и генетический анализ используются для идентификации генетической причины холестаза. Напр., высокий уровень gamma GT наблюдается только при дефиците ABCB4 (PFIC3) [12] тогда как дефицит FXR приводит к присутствию повышенных уровней Alpha FetoProtein (AFP) в сыворотке [6]. Биопсия печени используется для верификации отсутствия белков. участвующих в физиологическом формировании желчи в канальцах ил в др. механизмах, таких как внутриклеточное накопление белка, вызывающее повреждения гепатоцитов и холангиоцитов. Идентификация причины позволяет начать лечение, хотя все современные воздействия при PFIC, в лучшем случае, лишь замедляют прогрессирование болезни. Воздействие Ursodeoxycholic acid (UDCA) снижает гидрофобность пула желчных кислот, это лечение первой очереди при всех типах PFIC. Эффективность этого лечения зависит от типа мутации, при этом пациенты, несущие missense мутации обнаруживают лучшую реакцию по сравнению с плным дефицитом [5,13]. У пациентов с миссенс мутациями в ATP8B1 или ABCB11 гене, которые влияют на укладку белка, 4-phenylbutyrate, восстанавливает присутствие этих транспортеров в мембранах канальцев, хотя и на низком уровне[14-16]. Симптомы смягчаются при снижении пула желчных солей с помощью желчной diversion или с помощью предупреждения потребления кишечником путем связывания желчных солей с cholestyramine [1]. Эффективность и безопасность фармакологического подавления потребления желчных кислот с использованием ингибиторов apical sodium dependent bile transporter (ASBT) может быть др. подходом редукции пула желчных кислот [17,18]. Диаррея является побочным эффектом, обусловленным повешением количества желчных кислот, достигающих толстого кишечника. В этой связи, FXR активация для снижения синтеза желчных кислот в гепатоцитах может быть способом преодоления узкого горлышка и в комбинации с подавлением ASBT может быть эффективным подходом [19,20]. Некоторые из этих терапий облегчают симптомы и замедляют прогрессирование болезни, не не излечивают. Для недавно идентифицированной генетической причины PFIC, в именно TJP2-, FXR- и MYO5B-дефицитов нет терапии [1].

Прогресс в осуществлении трансплантаций печни в последние декады привел к представлению о orthotopic liver transplantation (OLT) [21]. Долговременные осложнения заключаются в потере трансплантата и повышении риска инфекций и развития рака из-за лечения, супрессирующего иммунитета. Ранние тяжелые повреждения печени у многих пациентов, страдающих от PFIC, нуждаются в трансплантации печени во время младенчества. Эта процедура становится стандартной для лечения детей с конечной стадией печеночной болезни, что обеспечивает 20-ленюю жизнеспособность у более 80% [22,23]. Частичные трансплантации печени улучшают величину совпадения между трансплантатом и реципиентом и смягчают нехватку части соотв. донорской печени без нарушения жизнеспособности [24]. Это также делает возможными трансплантации от членов семьи.

Для всех тяжело пораженных пациентов трансплантация печени на сегодня единственная терапия, которая может быть успешно осуществлена у детей, страдающих от PFIC [25]. Описаны дополнительные осложнения этой серьезной процедуры. Пациенты с мутациями, которые полностью устраняют функцию ATP8B1, обнаруживают печеночное жировое перерождение донорской печени. Для предупреждения этого осложнения необходимо комбинировать трансплантацию печени с тотальной внутренней желчной diversion, но при этом вне-печеночные симптомы, подобные тяжелой диаррее сохранятся [2,25,26]. Также у пациентов с тяжелым FXR дефицитом возникают осложнения после трансплантации, у них также развивается жировая инфильтрация печени [1]. У пациентов с дефицитом ABCB11 (BSEP) симптомы холестаза появляются повторно после OLT из-за иммунной реакции, подавляющей функцию BSEP [27].

Использование генотерапии под контролем Adeno Associated Viral (AAV) векторов для рецессивных моногенных болезней было разработано и показана ее безопасность и эффективность, поступила на рынок, хотя и в ограниченном количестве. Сегодня известны базирующиеся на AAV-векторе генотерапии, такие как Glybera, для лечения дефицита Lipoprotein Lipase (LPL), Luxturna [28], для лечения Retinal Pigment Epithelial (RPE) 65-related дистрофии сетчатки, и Zolgensma, для лечения Spinal Muscular Atrophy (SMA) [28-30]. Многообещающие безопасность и эффективность установлена на небольших клинических исследованиях AAV генотерапии, которые ожидают регистрации и разрешения выхода на рынок. Напр., подобный подход для лечения Choroidenemia [31], дефицита aromatic l-amino acid decarboxylase [32], Pompe’s Disease [33,34], Duchenne Muscular Dystrophy (ongoing: NCT03375164), Becker’s Muscular Dystrophy [35], Limb-Girdle Muscular Dystrophy [36], X-linked myotubular myopathy (ongoing: NCT03199469), haemophilia A [37] and haemophilia B [38,39], все демонстрируют эффективность. Однако, возникают некоторые вопросы безопасности, особенно при клинических испытаниях болезней, нуждающихся в системных высоких дозах вектора. Печеночная токсичность описана для доз AAV выше 1 х 10-14 vg/kg, указывая на то, что это может стать проблемой при некоторых подходах [40]. Генотерапия для глазных болезней имеет относительно немного узких мест, поскольку глаза довольно доступны, высоко компартментализованы и иммуно-привилегированны [41], и в них возможны не системные инъекции. Лечение SMA с помощью Zolgensma, нацеленного на моторные нейроны, понуждает использовать интратекальные инъекции и высокие дозы вектора, вызывающие временные воспаления печени [42,43]. Недавно в испытании по целенаправленному воздействию на X-сцепленную миотубулярную миопатию, произошли две трагические смерти пациентов детей в когорте, получавшей самую высокую дозу вектора [44]. Оба пациента погибли из-за прогрессирующей дисфункции печени и последующего фатального сепсиса после приема лечения 3 х 10-14 vg/kg. Пациенты, подвергшиеся воздействию более низких доз вектора, 1 х 10-14 vg/kg, не обнаруживали каких-либо побочных эффектов. Печеночный тропизм AAV векторов, приводит к токсическим уровням вектора в гепатоцитах, осложняя генотерапию нарушений, нуждающихся в высоких дозах вектора в общем крообращении, сходные примеры наблюдаюся для всех мышиных нарушений. В случае генотерапии при PFIC, AAV-обеспечиваемый перенос генов в печень особенно важен. При лечении врожденных нарушений печени, тропизм AAV к печени является главным преимуществом, поскольку более низкие дозы вектора необходимы для терапевтической эффективности. ряд клинических испытаний по лечению дефицита Factor VIII или Factor IX при гемофилии A или B у пациентов также привлекает наш интерес.

Спустя три года после изучения увеличения дозы при лечении гемофилии A, осуществленном Pasi с колл. [37], была показана долговременная эффективность. Все 15 взрослых пациента, получали 6 х 10-12 vg/kg вплоть до 6х 10-13 vg/kg внутривенно AAV5-hFVIII. Не было обнаружено токсичности для печени, хотя в некоторых случаях повшались уровни Aspartate Transaminase (AST) , которые успешно лечились с помощью глюкокортикоидов. Активность фактора VIII в плазме восстанавливалась, приводя к сильному снижению показателей кровоточивости и использования рекомбинантного Factor VIII. Хотя спустя три года, уровни в плазме фактора VIII всё ещё сохранялись на терапевтическом уровне, постепенно снижаясь со временем. Более продолжительное отслеживание необходимо, чтобы понять, действительно ли фактор VIII будет оставаться лечебным или необходимо повторное лечение. Исследования по увеличению доз при дефиците Factor IX также подтвердило безопасность и эффективность, когда уровни достигали 40–50% от нормальной активности Factor IX [39]. Долговременное отслеживание старых исследований дефицита Factor IX продемонстрировало долговременную эффективность [38]. У таких пациентов AAV8 вектор инъецированный 9 лет тому назад, всё ещё производил клинически достаточное количество Factor IX. Следовательно, такая стратегия лечения пригодна для тяжелых нарушений печени.

AAV векторы не интегрируют активно в геноме хозяина, а персистируют в ядре в эписомной форме [45,46]. Важным преимуществом этого является отсутствие генотоксичности, которая, напр., может вызывать формирование опухолей, как это наблюдается при интеграции ретровирусного вектора [47,48]. Во время клеточных делений эти эписомы не копируются и распределяются по дочерним клеткам. Это делает AAV векторы менее пригодными для лечения печеночных нарушений сразу после рождения. Рост печени приводит к потере первоначальной эффективности [49,50]. Пролиферация гепатоцитов также индуцируется после повреждений печени, напр., после частичной гепатэктомии [51]. Это осложняет использование AAV-обеспечиваемой генотерапии для нарушений в результате повреждений гепатоцитов, таких как дефицит Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) и PFIC. Проводимые сейчас исследования безопасности и эффективности AAV генотерапии проводятся на болезнях взрослых, которые не приводят к печеночным повреждениям. Недавние пре-клинические исследования показали, что AAV-обеспечиваемая генотерапия для PFIC осуществима.

Дефицит ABCB4, по-видимому, наилучший пример для изучения пригодности генотерапии при PFIC. Поскольку доступны пригодные животные модели и ранее было показано, что частичная коррекция с помощью трансплантации гепатоцитов приводит к терапевтическому исправлению [52]. Мыши Mdr2-/- (Abcb4-/-) оказались подходящей моделью PFIC3 [10,53]. Тяжесть патологии зависела от линии мышей, при этом FVB мыши обнаруживали более тяжелые фенотипческие отклонения по сравнению с C57Bl/6 мышами. Регулировка посредством диеты с добавкой cholate увеличивает гидрофобность желчи мышей, это ухудшает болезненные проявления [54]. В недавнем исследовании мы изучали пригодность AAV8-hABCB4 обеспечиваемой коррекции у взрослых Abcb4-/- мышей с генетическим фоном C57Bl/6 [55]. После использования вектора отслеживали эффективность в течение 6 мес., используя cholate для воспроизведения токсичности желчи человека [54]. Это тс е подтвердило концепцию путем демонстрации долговременной коррекции, что проявлялось в нормализации параметров печеночных повреждений AST, Alanine Transaminase (ALT) и Alkaline Phosphatase (ALP), и отсутствием фиброза. Восстановление достаточного содержимого Phosphatidylcholine (PC) в желчи является предварительным условием продолжительной коррекции с использованием AAV. В случае недостаточной коррекции, присутствующая пролиферация гепатоцитов приводит к потере AAV векторов и тем самым к дальнейшему снижению присутствия PC в желчи и тем самым к повышению повреждений печени. Это было продемонстрировано Weber et al. . при этом Abcb4-/- FVB мыши обнаруживали более тяжелые фенотипические отклонения [56]. Такие мыши подвергались воздействию AAV вектора, состоящего из кодон-оптимизированного hABCB4, спустя 2 недели после рождения , а эффект отслеживался в течение 12 недель. У самцов, такое воздействие выглядело эффективным, но у 50% самок исправления терялись. Чтобы преодолеть это вторую когорту инъецировали два раза спустя 2, а затем 3 недели позднее. Такой протокол обеспечил продолжительную коррекцию и это по тяжести фенотипических отклонений было сравнимо с PFIC3 пациентами. Оба исследования показали, что долговременная коррекция болезни, вызываемой пролиферацией гепатоцитов, с использованием не интегрирующихся AAV векторов осуществима, но только если достаточна эффективность.

У PFIC3 пациентов начало болезни наблюдается в юном возрасте у детей и поэтому в идеале терапия д. проводиться на ранней стадии. Это осложняет использование не интегрирующихся векторов, подобных AAV. Проведено несколько исследований, показавших, что первоначальные исправления со временем теряются при воздействии на новорожденных или молодых животных [49,50]. Более того, индукция пролиферации после (частичной) потери коррекции будет вносить вклад в потерю эписомных трансгенов и будет ускорять снижение терапевтической эффективности. Это узкое место можно преодолеть с помощью стратегии, которая имеет целью интеграцию терапевтического трансгена. Siew et al. тестировали интеграцию терапевтической конструкции, состоящей из специфичного для печени промотора и codon-optimized человеческого ABCB4 трансгена, фланкированного piggyBac transposase короткими терминальными повторами [57]. Совместное введнени этой конструкции вместе с вектором AAV2/8, содержащим piggybac экспрессионную кассету ювенильным FVB Abcb4-/- мышам приводит к интеграции терапевтической конструкции, обесчпечивая на всю жизнь экспрессию hABCB4 т коррекцию болезни. Интеграция происходит неслучайно , но транспозоны вызывают интеграцию в тесной близи к активно транскрибируемым регионам генов, точкам старта транскрипции и открытым структурам хроматина [58,59]. Ни один из регионов проанализированных интеграций не был сцеплен с известными генами, играющими роль в гепатоцеллюлярной кациономе [59]. Тем не менее нельзя это исключить. Целенаправленное воздействие на интеграцию трансгена в безопасный геномный локус лежт за пределами данного обзора.

Очевидной мишенью, обеспечивающей интеграцию в активном регионе гепатоцитов, локус Albumin. Недавно проведено исследование с целью достижения интеграции с помощью Homologous Directed Repair (HDR) лишенного промотора Factor IX в кодирующий регион этого локуса без использования нукелеазы [60]. Т.к. эписомная конструкция лишена промотора, а само-расщепляющийся белок добавляется к трансгену, то его экспрессия регулируется с помощью экспрессии альбумина. Отсутствие промотора и нуклеаз повышает безопасность этой “generide” стратегии. Основой этого подхода является доставка Factor IX, кодируемого трансгеном, фланкированного двумя гомологичными плечами гена albumin с комплементарной последовательностью, кодирующей желательный регион интеграции. Используя generide стратегию Muro et al. продемонстрировали, что она может быть использована для коррекции метаболических нарушений, хотя и см низкой эффективностью [61]. Индукция разрывов двойной нити в этом локусе должна стимулировать HDR и эффективность интеграции. В последующем исследовании была установлена повышенная коррекция за счет комбинирования generide подхода с AAV-saCas9, наводящей на локус albumin [62]. Во всех исследованиях использованы новорожденные мыши, моделирующие использование сразу после рождения, когда печень активно растет, а гепатоциты пролиферируют. Последнее является большим преимуществом, поскольку во время клеточных делений активна система HDR , тогда как она неактивна в покоящихся клетках [63]. В данном исследовании пожизненная терапевтическая коррекция патологии установлена вскоре после воздействия сразу после рождения. Более того, не выявлено интеграции вне мишеней, что составляет основу профиля безопасности этой системы модуляции генов [62]. Такая стратегия целенаправленной интеграции, по-видимому, является подходящей для лечения PFIC сразу после рождения.

Осуществимость in vivo AAV-обеспечиваемой не интеграционной генотерапии описана только для PFIC3. При этой болезни активность по очистке от желчных солей, которая вызывает патологию, может быть нейтрализована с помощью частичной коррекции уровней phosphatidylcholine в желчи [64]. Становление экспрессии ABCB4 в достаточном проценте гепатоцитов должно предупреждать дальнейшие повреждения, останавливать прогрессирование болезни и останавливать пролиферацию гепатоцитов, предупреждая тем самым потерю генома эписомным AAV вектора, обусловленное делением клеток [55,56]. AAV-обеспечиваемая in vivo генотерапия, использующая не интеграционную стратегию, по-видимому, менее пригодна для др. типов PFIC.

В случае PFIC1 и 2, их патофизиология управляется с помощью индивидуальных клеточных stressors. Эти стрессы вызываются снижением целостности мембран (при PFIC1) [65] и накоплением внури клеток желчных солей (при PFIC1 и 2) [66]. Следовательно, все гепатоциты нуждаются в коррекции, чтобы остановить повреждения, вызываемые пролиферацией гепатоцитов. Высокая доза вектора для гарантии трансдукции всег гепатоцитов может приводить к печеночной токсичности. Последующая пролиферация для компенсации потери гепатоцитов будет приводить к потере не интегрированных копий AAV векторов, вызывая потерю коррекции. Для обоих типов стратегии интеграционной генотерапии предупреждение потери генома вектора во время клеточных делений, по-видимому, является обязательным условием устойчивой коррекции. Современное состояние искусства интегрирующей системы AAV-обеспечиваемой генотерапии, характеризуется низкой эффективностью, но если используется у новорожденных мышей, то процент откорректированных клеток может достигать 24% от всех гепатоцитов [62]. Это указывает на то, что терапевтическая коррекция при PFIC1, 2 и 3, по-видимому, осуществима из-за увеличения жизнеспособности клеток с правильно интегрированной копией соотв. гена. Напротив, геномы эписомных AAV векторов, чьи интегрированные гены копируются во время клеточных делений и трансфицируют обе дочерние клетки. Благодаря этому происходит перенос возможности выживания их производным в ограниченном количестве откорректированных гепатоцитов, которые будут повторно занимать печень, как это происходит с трансплантированными гепатоцитами [52,67].

Патофизиологические механизмы, вызывающие повреждения печени при PFIC4, 5 и 6, выявлены совсем недавно. При PFIC4 отсутствие функционального TJP2 ведёт к неправильному расположению claudin, приводя к около-клеточному протеканию желчи [68]. пациенты с PFIC5 обнаруживают дефицит ядерного FXR, который играет центральную роль в синтезе и гомеостазе желчных кислот (BA) . Поскольку передача сигналов FXR также необходима для экспрессии ABCB4 и ABCB11, то его дефицит приводит к отсутствию экспрессии этих двух транспортеров, приводя к накоплениюв внутри клеток BA при PFIC1 и 2 [69]. Недавно описано, что PFIC6 вызывается биаллельными миссенс мутациями в MYO5B. Этот белок играет центральную роль во внутриклеточном транспорте мембранных белков и такие MYO5B мутанты приводят к неправильному расположению ABCB11 и, как следствие, приводят, к накоплению внутри клеток желчных солей [7,9]. Базируясь на патофизиологии этих трех типов болезни, ясно, что только стратегии интеграционной генотерапии подходят для лечения, т.к. преимущества в жизнеспособности откорректированных гепатоцитов могут приводить к заселению вновь печени и последующему исправлению болезни.

Живтоные модели важны для изучения пригодности, проверяя концепцию генотерапии для этих типов PFIC. Для PFIC4, необходимо смоделировать дефицит TJP2. Нокаут всего тела был получен, но возникали летали во время эмбрионального периода [11]. Поэтому понадобились дополнительные модели, такие как специфичный для гепатоцитов нокаут путем скрещивания TJP2 gene floxed мышей с Alb-Cre мышами или даже с кондиционно индуцибельной моделью [70]. FXR-дефицитные мыши были получены, но помимо печеночного фенотипа эта модель обладала широким набором симптомов в соотвестствии с центральной ролью этого ядерного рейептора во многих процессах. В дополнение к нарушениям регенерации печени, наблюдался повышенный печеночный туморогенез и холестаз, кишечная патология, атеросклероз и нарушения нейрологических функций [71-74]. Это подтверждает, что генотерапия, которая нацелена только на печень, может частично оказаться лечебной. Мышиные модели MYO5B-дефицита были получены с доминирующими симптомами в виде Microvillus Inclusion Disease (MID). Недавнее исследование показало, что MID мыши, обнаруживают тотальный нокаут по всему телу MYO5B, и не подходят для модели холестаза. Перенос аберрантного белка на апикальные мембраны гепатоцитов приводит к PFIC6 фенотипическим отклонениям, он обусловлен миссенс мутациями, затрагивающими моторный домен, но не вызывают полный дефицит MYO5B [75]. Присутствие дикого типа MYO5B частично исправляет неправильную локализацию апикальных белков в линии клеток гепатомы, подтверждая, что генотерапия, по-видимому, вполне подходящий подход. Проверка концепции этой стратегии необходима на новой мышиной модели, экспрессирующей одну специфическую миссенс мутацию, идентифицированную у пациентов с PFIC6.

Геном дикого типа AAV состоит из длиной в 4.8 Kb одиночной нити ДНК. Хотя AAV векторы могут упаковывать до некоторой степени более длинные геномы, а более длинные геномы приводят к менее эффективной упаковке или упаковке части конструкции. Максимальная способность, позволяющая эффективную упаковку ограничена 5.2 Kb [76]. Кодирующие последовательности для белоков, дефицитных при разного типа PFIC, являются длиной 3753 bp для hATP8B1 (PFIC1), 3963 bp для hABCB11 (PFIC2), 3858 bp для hABCB4 (PFIC3), 3570 bp для hTJP2 (PFIC4) и 1458 bp для hFXR (PFIC5). При PFIC6, канонический сплайс-вариант MYO5B состоит из 5544 bp, но более короткий сплайс-вариант состоит из 2889 и 1257 bp. Как только специфическая миссенс мутация в моторном домене MYO5B вызывает холестаз, то ген добавляющая терапия такого более короткого сплайс-варианта , если он функционален, может в теории подойти, но только в комбинации с делецией экспрессии эндогенного мутантного MYO5B белка. Домен MYO5B, связывающий Rab11, играет критическую роль в изменении расположения апикальных белков в гепатоцитах, приводя к PFIC6 [75]. Это подтверждает, что использование AAV-обеспечиваемой генотерапии для нокаута экспрессии этого домена с использованием, напр., CRISPR/Cas может оказаться правильным. Такое лечение не требует ни гомологичной репарации, ни доставки донорской матрицы, обе из них ограничивают эффективность in vivo коррекционной генотерапии. Важно, что помимо трансгена, AAV конструкция содержит одну poly A консенсусную последовательность, промотор, если используется не-интегрирующая стратегия или лва гомологичных плеча в случае интеграционного подхода и инвертированные терминальные повторы, необходимые для упаковки. Эти потребности делают разработку интегриующихся и не интегрирующихся терапевтических конструкций при ограниченной способности упаковки AAV, затруднительной, но выполнимой для PFIC1 - 5. Отсутствие печеночного холестаза у пациентов с полным отсутствием MYO5B, подтверждает, что генотерапия, которая блокирует экспрессию MYO5B в случае миссенс мутации в мотороном домене, может частично исправлять неправильную локализацию апикальных белков и теоретически может стать подходящим подходом для лечения PFIC6.

Применение генотерапии к изолированным клеткам пациента имеет огромное значение и преимущество перед in vivo подходами, из-за отсутствия вмешательства пред-существующего иммунитета, отсутствия иммунной реакции на вектор, отсутствия токсичности вектора, из-за исключительного целенаправленного воздействия на затронутые типы клеток и меньшей инвазивности [28]. Ex vivo генотерапия впервые продемонстрировала терапевтическую эффективность по коррекции наследственных болезней гематопоэтических стволовых клеток (HSCs) [77]. Такая коррекция ex vivo выгодна в основном из-за экспериментов с трансплантациями костного мозга для культивирования и предварительного кондиционирования тканей от пациентов. Некоторые HSC ex vivo генотерапии обнаружили долговременные эффекты и одна из них была зарегистрирована, а именно Strimvelis [78-80]. Трансплантации доноров, происходящих из гепатоцитов, были применены к пациентам, страдающим от разных форм наследственных нарушений печени [81]. Некоторые исследования сообщали о частичной коррекции болезни, указывая на функциональную способность трансплантированных гепатоцитов. Во всех исследованиях этот эффект проявлялся временно, в большинстве благодаря иммунной реакции на доноры, происходящие из гепатоцитов. Коррекция гепатоцитов, происходящих от пациентов, осуществлялась путем преодоления иммунитетом обусловленной потери трансплантированных гепатоцитов, для осуществления долговременной коррекции. Однако, небольшое исследование по лечению семейной гиперхолестролемии, вызываемой дефицитом low-density lipoprotein receptor (LDLR), не обнаружило терапевтической эффективности [82]. Частично такая низкая эффективность может быть объяснена использованием ретровирусного вектора, который в противовес лентивирусном у вектору, не трансдуцирует неделящиеся клетки, такие как зрелые гепатоциты. Кроме того, это испытание также показало сложность процедуры, включая частичную резекцию печени, чтобы изолировать, культивировать и трансдуцировать количество гепатоцитов, необходимое для терапевтического эффекта. Далее, в противоположность трансплантациям костного мозга, эксперименты с кондиционированием реципиента ограничены. В целом это показывает лишь осуществимость подхода, если откорректированные гепатоциты обладают преимуществами в жизнеспособности, приводя к частичной репопуляции печени с помощью откорректированных клеток. Повреждения печени, наблюдаемые при всех типах PFIC показывают, что откорректированные гепатоциты могут быть способны заселить печень таких пациентов. Исследования на соотв. пре-клинических моделях PFIC2 и 3 продемонстрировали, что трансплантированные гепатоциты в сомом деле заселяют печень [52,67]. При др. типах PFIC существенные преимущества в жизнеспособности откорректированных клеток не были продемонстрированы.

Коррекция гепатоцитов пациентов с использованием ex vivo генотерапии и последующей их трансплантации требует интеграции терапевтической конструкции или коррекции генома хозяина. Наиболее эффективным вектором для подобного типа генотерапии являются лентивирусные векторы, которые трансдуцируют неделящиеся клетки, такие как гепатоциты. Такие векторы интегрируются в основном в активные гены, которые могут увеличивать риск туморогенеза. Для традиционных ретровирусных векторов этот риск, в самом деле, приводил к возникновению острой лейкемии [47,83].По сравнению с вектором, использованном в этих ранних исследованиях, безопасность лентивирусных векторов была увеличена [84]. Эта третья генерация лентивирусных векторов была использована в некоторых клинических испытаниях, при этом не наблюдалось появление опухолей [85-87]. Ex vivo генотерапия с использованием зрелых гепатоцитов, получаемых от пациентов оказывается очень проблематичной, особенно с точки зрения необходимости больших количеств клеток. Чтобы сделать этот метод пригодным, пролиферация д. быть существенной, для получения достаточных количеств эффективных подходов. В этом отношении использование стволовых клеток, посредством induced pluripotent stem cells (iPSCs) или из печени, остается обязательным. В комбинации с эффектом на жизнеспособность, эти ex vivo откорректированные клетки могут быть эффективны. Недавнее исследование серьезных болезней кожи привело к полному восстановлению после трансплантации откоррективрованых стволовых клеток кожи [88]. Для печени это сложнее, но может быть возможным в будущем.

Использование AAV векторов показало безопасность и эффективность в клинике для некоторых врожденных болезней, включая нарушения, затрагивающие печень. Среди этих подходов не интеграционный подход активно исследовался. В свете раннего начала серьезных повреждений и сохранения пролиферации в случае недостаточной эффективности, для всех PFIC, интеграционные подходы необходимы для улучшения клинического использования. Ex vivo генотерапия взрослых гепатоцитов, сопровождаемая трансплантацией, по-видимому, является потенциальной возможностью благодаря преимуществам жизнеспособности откорректированных клеток, что способствуетих заселению печени. Сегодня in vivo генотерапия кажется более обнадеживающей для всех типов PFIC.

Основным беспокойством для интеграционной генотерапии является индукция туморогенеза, наблюдавшийся в раннихз исследованиях тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID) у пациентов [77]. Сегодня адекватное внимание к туморогенезу при исследованиях генотерапии ускорило разработку безопасной, интегрирующей в геном генотерапии. Способность к интеграции in vivo подходов генотерапии, включая CRISPR/Cas9 подает большие надежды в пре-клинических исследованиях, поскольку интеграция управляема и поэтому может контролироваться с помощью Cas9 [56]. Сегодня одобрена первая AAV-управляемая Cas9 генотерапия в клиническом испытании для Leber’s congenital amaurosis 10 (LCA10) и производится набор пациентов (NCT03872479). В частности оценки безопасности д. определить четкость исходов для будузего использования in vivo интеграционной генотерапии и при др. наследственных болезнях.

Легкая доступность органов, таких как глаза, шейка матки и печень, являются хорошими мишенями для интеграционной генотерапии [89]. Преимущества в пролиферации гепатоцитов в условиях стресса и болезни печни предоставляют важный аргумент для выбора интеграционной генотерапии при определенных типах PFIC.

Осуществимость генотерапии отличается для разных типов PFIC. Дефицит ABCB11 (PFIC2) обнаруживает сложные клинические ожидания, поскольку болезнь клеточно автономна и у пациентов может возникать гепатоцеллюлярная карцинома (HCC) или cholangiocarcinoma’s (CCC) [90-92]. Хотя интеграционная генотерапия приводит к заселению печни, присутствие не откорректированных клеток нельзя исключить и поэтому сохраняется постоянный риск. Поэтому даже после эффективного лечения у таких пациентов, сохраняется риск развития HCC и последующей OLT [93]. Доступные сегодня методы генотерапии, по-видимому, являются эффективными для предупреждения печеночной неспособности, пока доступна подходящая донорская печень, но не может заменить трансплантации печени у PFIC2 пациентов.

При PFIC5, дефиците FXR, потенциальная роль генотерапии сравнима с таковой для пациентов с PFIC2. FXR важен для транскрипции гена ABCB11 и экспрессии BSEP во всех гепатоцитах. Подобно PFIC2 пациентам, пациенты PFIC5 обнаруживают риск развития HCC в раннем возрасте. Даже после эффективной генотерапии присутствие не откорректированных гепатоцитов приводит к сохранению риска развития HCC. Кроме того, широкий ряд процессов регулируется с помощью FXR приводя к осложнениям болезни и поэтому коррекция болезненной печени не излечивает от патологии во всех затронутых тканях. PFIC6 вызывается мутациями в специфических частях белка MYO5B, затрагивающими его способность к транслокации белков на апикальные мембраны [75]. Большинство MYO5B-дефицитных пациентов преимущественно страдают от Microvillus Inclusion Disease [7]. Лишь для подгруппы пациентов, страдающих от PFIC6, у которых печеночная патология является главным симптомом, нацеленная на печено генотерапия устраняет экспрессию мутантного MYO5B и поэтому является приемлемой опцией.

Сегодня генотерапия для лечения PFIC1, 3 и 4, по-видимому, наиболее подходит для переноса в клинику. Дефицит ABCB4 изучен лучше всего в трех пре-клинических исследованиях, все они продемонстрировали эффективность и подтвердили концепцию нацеленной на печень in vivo генотерапии. Патология печени, вызываемая дефицитом ATP8B1 (PFIC1) также является привлекательной мишенью для интеграционной генотерапии, поскольу преимущества в жизнеспособности откорректированных клеток способствуют заселению печени. Однако, этот подход не подходит для внепеченочных симптомов и неясно насколько эффективными будет лечение в случает жировой инфильтрации печени, как это наблюдалось после OLT у таких PFIC пациентов. У пациентов, страдающих от PFIC4, необходима повторная экспрессия TJP2 для формирования функциональных плотных соединений в печени, это может также привести преимуществу в жизнеспособности откорректированных клеток [11]. Т.к. патология, вызываемая дефицитом TJP2, по-видимому, ограничена печенью, то возможно это хорошая мишень для in vivo генотерапии. Необходима разработка кондиционной специфичной для печени of a модели с нокаутом TJP2 для PFIC4, т.к. от нокаута всего тела особи нежизнеспособны.

In this review, we discussed the most recent in vivo and ex vivo approaches for using gene therapy in patients with PFIC, and addressed future developments within this field. Further, we elaborated on the clinical feasibility for all types of PFIC. The safety and efficacy results from many clinical trials conducting gene therapy are sufficiently positive to push the application of gene therapy for PFIC patients closer to the clinic. We can conclude that state of the art in vivo non-integrating gene therapy approaches will most likely not provide lifelong correction, due to a loss of AAV vector genomes caused by hepatocyte proliferation. However, the transient correction can slow down the decrease in liver function. Only integrating strategies that provide survival benefit to the corrected cells seem suitable for sustained efficacy in PFIC.

The feasibility to translate state of the art in vivo integrating gene therapies, upon showing proof of concept in pre-clinical models, into the clinic depends on the type of PFIC. Although integrating gene therapy would cure the PFIC2 and 5 phenotype, these patients remain at risk to develop HCC or CCC. Gene therapy for PFIC6 will only be effective for the small group of patients with the mutations in the motor domain of MYO5B that dominantly suffer from liver symptoms. Although MYO5B is too large to be packaged into AAVs, treating PFIC6 by knocking out gene expression of the mutated protein in the liver using AAV-mediated gene therapy or another approach to deliver CRISPR/Cas9 specifically to the hepatocytes, in theory could be a promising option. In most of MYO5B deficient patients, the pathology in the intestine is much more severe and will not be mitigated by AAV-mediated in vivo liver-directed gene therapy. PFIC1, 3 and 4 do seem good candidates for integrating gene therapy strategies targeting the diseased hepatocytes and could provide life-long correction in patients suffering from these severe life-threatening disorders