Phenylketonuria (PKU) вызывается рецессивным наследуемым дефицитом phenylalanine hydroxylase (PAH) (OMIM: 261600), является наиболее распространенной врожденной ошибкой метаболизма (IEMs) и приводит к hyperphenylalaninemia и нейротоксическим эффектам фенилаланина на головной мозг.¹ PAH является цитозольным печеночным гомо-тетрамером, который метаболизирует L-phenylalanine (Phe) в L-tyrosine.² В отсутствие функции PAH, возникает хроническая не поддающаяся лечению гиперфенилаланинемия, приводящая к тяжелым нейрологическим повреждениям, к умственной отсталости, психологическим нарушениям и судорогам.^1,3 Важно отметить, что клинические проявления PKU образуют непрерывный континуум в пределах от умеренной hyperphenylalaninemia (blood Phe = 120-600 µM) через умеренную PKU (blood Phe = 600-1200 µM), до очень тяжелой, классической PKU (cPKU) (blood Phe > 1200 µM), в зависимости от количества остаточной активности PAH в печени пациентов. Из-за тяжести основное внимание уделяется предупреждению нейрологических симптомов, все дети, рождающиеся в развитых странах, подвергаются скринингу на гиперфенилаланинемию и подвергаются пищевому лечению с ранней жизни.⁴

Современным стандартны лечением PKU прием в течение всей жизни пищи с ограниченным содержанием Phe, но содержащей критические питательные вещества, включая аминокислоты иные, чем Phe, вместе с витаминами и минералами, которые индивиды с PKU неспособны извлекать из сильно ограниченной диеты.^5-8 Нарушения доступа к специализированной медицинской пище превалируют в США из-за непоследовательного страхового покрытия, особенно у взрослых. Это сопровождается хронической hyperphenylalaninemia, когнитивными и поведенческими симптомами и функциональной неспособностью.⁹ Попытки фетеральных законодательных органов гарантировать униформное страховое покрытие к медицинской пище в разных штатах осуществляется посредством Medical Nutrition Equity Act. Благодаря диете успешно предупреждаются основные проявления этой болезни, когнитивные и поведенческие аномалии и даже могут появиться индивиды, которые успешно сохраняют в крови концентрации Phe между 120 и 360 µM, рекомендованными пределами.⁸ Наблюдаемые аномалии могут включать низкий IQ, дефицит функции исполнительной системы и психиатрические отклонения (страхи и депрессия), их показатель увеличивается с увеличением в крови концентрации Phe.^10-12

Недавно US Food and Drug Administration (FDA) одобрила заместительную ферментную терапию (pegvaliase) для взрослых с неконтролируемой hyperphenylalaninemia на фоне диеты, при этом было выявлено драматическое улучшение контроля за Phe в крови^13-16, но это связано со значительным показателем иммунитетом обусловленных реакций гиперчувствительности против чужеродного белка. Кроме того, pegvaliase не разрешен для использования индивидами менее 18 лет. Pegvaliase терапия требует ежедневных инъекций, тогда как генотерапия обладает потенциалом коррекции болезни при одиночном воздействии. National PKU Alliance (NPKUA) информирует и поддерживает людей с PKU, свыше 85% членов комитета интересуются использованием генотерапии в качестве единственного введения, обеспечивающего облегчение на всю жизнь.⁹ Пре-клинические исследования с использованием adeno-associated virus (AAV)-обусловленной терапией с добавлением гена у Pahenu2/enu2 мышей показали высокую эффективность, но эффективность была ограничена новорожденными мышами.^17,18 Такая потеря терапевтической эффективности является многофакторной, включая потерю AAV эписом при делении клеток печени, отсутствие избирательных преимуществ для PAH+ печеночных клеток и высокий терапевтический порог PKU (~10% откорректированных гепатоцитов необходимы для снижения Phe в крови).^{19- 21} Поиски более подходящей генотерапии является целью данного исследования, коррекции мутаций, вызывающих PKU у Pahenu2/enu2 мышей с использованием целевого, подхода с интегрирующимися AAV. Мы использовали CRISPR/Cas9 нуклеазную систему^22,23, чтобы индуцировать разрывы двойной нити (DSB) вблизи мутации Pahenu2 и улучшить возможности для гомологичной рекомбинации с предоставлением репарационной матрицы, обладающей последовательностью дикого типа (WT) . Ожидалось, что такая коррекция будет долговременной, даже если подвергнутые целенаправленному воздействию гепатоциты будут делиться, а их геном реплицироваться. Барьером, препятствующим эффективности этого подхода, стала способность достигать достаточных количеств правильно отредактированных гепатоцитов, чтобы продуцировать физиологически достаточные улучшения в очистке от Phe в отсутствие какого-либо преимущества в избирательном росте для PAH+ клеток. Чтобы преодолеть это препятствие, использовали ингибитор non-homologous end joining (NHEJ), чтобы облегчить homology-directed repair (HDR) и повысить частоту успешных репараций гена в нашей системе.²⁴

Модельные мыши Pahenu2/enu2 с cPKU оказались идеальными для проверки принципа, т.к. содержали одиночную missense мутацию в гене Pah, связанной с hyperphenylalaninemia. Патологическая c.835T > C missense мутация изменяет позицию аминокислоты 263 с фенилаланина на серин, разрушая соответственно функцию каталитического домена PAH. Pahenu2/enu2 гомозиготы обладают всеми симптомами классической нелеченной человеческой PKU, включая концентрацию в крови фенилаланина выше 2000 µM при потреблении обычной мышиной пищи, гипопигментацию и ассоциированную нейропатологию, конгитивные и поведенческие отклонения.^25-27

Помимо ингибитора non-homologous end joining (NHEJ) , vanillin, одновременно вводили вирусное лекарство, способствующее homology-directed repair (HDR) вместе с AAV-доставляемой репарационной матрицей. Такая комбинация сделала возможной пожизненную коррекцию аллеля Pahenu2 у части подвергшихся действию лекарства гепатоцитов мышей с PKU, это обеспечило частичное восстановление активности PAH в печени, существенно снизило содержание фенилаланина в крови и препятствовало материнским PKU эффектам во время разведения. Эта работа показывает, что CRISPR/Cas9 редактирование гена является многообещающим инструментом для устойчивого редактирования гена при PKU.