Серповидно-клеточная болезнь (SCD) является разрушительной болезнью с существенной болезненностью и смертностью (Gardner, 2018). Это моногенная болезнь крови, вызываемая точечной мутацией в гене β-глобина человека (HBB), кодирующем субъединицу гемоглобина. SCD возникает благодаря мутации в HBB аллеле, наз. hemoglobin S (HbS). Точечная мутация (замена A на T) в 6-м кодоне гена HBB приводит к превращению аминокислоты valine в глютаминовую кислоту, в результате возникают существенные изменения в поведении и происходит преобразование формы молекулы гемоглобина (Frenette and Atweh, 2007, Gardner, 2018). Аномальный HbS гемоглобин приводит к накоплению и полимеризации белка, который превращает эритроциты в форму серпа полумесяца. В отличие от круглой формы, эластичных нормальных эритроцитов серповидные клетки имеют жесткую и остроконечную форму, поэтому легко агрегируют и крепко приклеиваются к внутренней поверхности узких кровеносных сосудов. Как результат закупорка, неадекватное снабжение кислородом ткани и повреждения органов, наблюдаемые при дальнейшем прогрессировании болезни (Ashley-Koch et al., 2000). Кроме того, измененная форма эритроцитов укорачивает продолжительность жизни эритроцитов по сравнению с нормой, это вызывает хроническую анемию, ухудшающую здоровье пациентов (Azar and Wong, 2017, Gardner, 2018). Клинически, присутствие гомозиготного варианта (HbSS) представляет наиболее тяжелую форму SCD по сравнению с гетерозиготными мутациями (Frenette and Atweh, 2007).

Серповидно-клеточная болезнь затрагивает около 100000 пациентов только в США (Hassell, 2010, Piel, 2013, Wierenga et al., 2001). Распространенность признака HgS и β-thalassemia (др. широко распространенная мутации HBB) возрастает до 10% и 13.1% в некоторых регионах Турции, соотв. (Altay and Gurgey, 1986, Beksac et al., 2011, Bircan et al., 1993, Canatan, 2014, Canatan et al., 2006, Guvenc et al., 2012, Kilinc, 2006, Mendilcioglu et al., 2011, Topal et al., 2015, Tosun et al., 2006, Zeren et al., 2007). Это заболевание имеет широкое распространение особенно в sub-Saharan Африке, Средиземноморском бассейне, на Среднем Востоке и Индии. SCD является всё возрастающей глобальной проблемой со здоровьем . Приблизительно 300000 детей рождаются с серповидно-клеточной анемией каждый год и эта величина может возрасти до 400000 к 2050 (Piel et al., 2017). Несмотря на высокий показатель SCD, отсутствует какое-либо безусловное лечение.Современное лечение это преимущественно доступные поддерживающие агены, снижающие тяжесть болезни и осбожнения. Наиболее распространенным является использование при SCD переливаний крови, воздействие hydroxyurea и вакцинации, предупреждающие риск серьезных инфекций (Aliyu et al., 2006).

Трансплантации аллогенных стволовых клеток являются многообещающим лечением SCD и сходных болезней клеток, которое базируется на доступности соотв. доноров, обладающих здоровыми HSCs, а их трансплантации пациентам (Kahraman et al., 2014, Ozdogu et al., 2018b, Shenoy, 2011, Yesilipek, 2007, Yesilipek et al., 2018). Даже если имеются успешные резултаты этого метода он не является универсальным лечением, поскольку доноров недостаточно, и поскольку имеет место graft versus host disease (GVHD) и др. токсические воздействия (Ozdogu et al., 2018a, Ozdogu et al., 2018b). Аутологические трансплантации в ex vivo откорректированных HSCs являются многообещающим методом для устранения проблем с аллогенными трансплантациями (Simsek et al., 2010, Yucel and Kocabas, 2018). Моногенные болезни крови, такие как SCD, могут лечиться путем коррекции мутаций напрямую используя инструменты геномного редактирования, известых также как преобразованные нуклеазы. Эти нуклеазы, как было установлено, обладают высоким потенциалом терапевтического использования (Kuscu et al., 2014). Недавно, типа II CRISPR/Cas9 система стала наиболее модной для геномного редактирования и многообещающим подходом для прямой коррекции мутаций, которые вызывают моногенные болезни, такие как SCD (Hoban et al., 2016, Vakulskas et al., 2018).

Система CRISPR/Cas9 нуклеаз состоит из ДНК-связывающей CRISPR RNA (crRNA), кодирующей guide-RNA (gRNA), вспомогательной trans-activating crRNA и Cas9 нуклеазы (Hussain et al., 2019). CrRNA содержит 20-нуклеодидов (nt) наводящей последовательности, которая соединяется с со специфическими 20 парами оснований ДНК мишени в геноме за счет Watson-Crick спаривания оснований. Распознавание мишени с помощью Cas9 нуклеазы зависит от последовательности protospacer contiguous motif (PAM), ассоциированного с регионом связывания ДНК. Cas9 нуклеаза индуцирует разрывы двойной нити на 3 пары оснований выше PAM последовательности.

Сераовидно-клеточная болезнь является одной из наследственных болезней, которая может привести к технологии терапевтического генного редактирования. Т.к. она вызывается точечной мутацией в гене HBB, то возможно эффективная индукция изменений оснований, чтобы восстановить функциональную beta субъединицу гемоглобина. Недавние исследования показали возможность репарации HBB , используя CRISPR/Cas9 систему для CD34 + HSCs (DeWitt et al., 2016). Исследование подтвердило эффективность редактирования генов для локуса HBB и восстановление с его помощью продукции WT β-globin. Пока при этом всё ещё наблюдается определенная активность вне мишени в HSCs и K562 клетках. Эти исследования подтвердили, что точный и специфичный для SCD подход всё ещё необходим для снижения активности CRISPR/Cas9 системы вне мишени и необходимо улучшение HDR. Поэтому мы стремимся разработать специфичную для SCD gRNA с высоким сродством к HBB локусу в тесной близи с мутацией в SCD, чтобы индуцировать DSBs и сделать возможной репарацию гена HBB с помощью варьирующей длины HDR матриц, которые бы перекрывали все возможные мутации.

Итак, мы исследовали эффекты активного воздействия на мишени стандартной gRNA и вновь разработанной более длинной gRNA. Было установлено, что более длинная gRNA обладает более высоким сродством к ДНК мишени в то же время сохраняет ту же самую способность целенаправленного воздействия и Cas9 индукции DSBs. HDR механизм запускался с помощью одновременной доставки донорской ДНК репарационной матрицы в форме циркулярной плазмиды. Мы подтвердили наличие методологического подхода для эффективного целенаправленного воздействия с помощью высокого сродства к ДНК мишени и генерации желательный модификаций в HBBгене.