Во внутреннем ухе USH гены экспрессируются в сенсорных волосковых клетках слуховой улитки в 5 вестибулярных органов (Fig. 2). Usher белки оказываются ассоциированными с двумя специализированными структурами: пучками волосков, в которых звуковые волны и/или движения головы превращаются в изменения мембранного потенциала (т.наз. механо-электрическая трансдукция), а цепочка синапсов служит местом высвобождения нейротрансмиттера (Fig. 2).

Fig. 2. The mammalian inner ear, and cross section of the snail-coiled cochlea illustrating the organization of the auditory organ), with the hair cells and associated cochlear ganglion neurons. The mammalian inner ear consists of the vestibule (balance organs), which detect linear and angular accelerations, and the cochlea, the hearing organ, which detects sound waves (A). The cochlea is made up of three fluid-filled compartments with differing ionic composition: the scala vestibuli and the scala tympani, both filled with perilymph, and the scala media, filled with endolymph (A,B). The scala media houses the auditory sensory epithelium, the organ of Corti, consisting of one row of inner hair cells (IHCs), three rows of OHCs, and various types of supporting cells (B).

В последние годы помимо идентификации новых Usher генов и диагностических инструментов, основной прогресс произошел в понимании роли Usher белков благодаря разным подходам от (1) расшифровки биофизических свойств Usher молекул; (2) идентификации молекулярных сетей, в которых участвует каждый USH белок; и (3) до выяснения природы и кинетики физиологических, морфологических и молекулярных механизмов, лежащих в основе сенсорных дефицитов Usher (rev. Bonnet and El-Amraoui, 2012; El-Amraoui and Petit, 2014; Mathur and Yang, 2015). Охарактеризованы десятки мышиных моделей, в точности воспроизводящих слуховые, а иногда и вестибулярные фенотипы USH пациентов. Эти исследования установили ключевую роль USH1 и USH2 белков в пучках волосков (Fig. 3A and B). USH белки кооперируются и взаимодействуют, чтобы сформировать молекулярные комплексы, которые обеспечивают нормальное формирование, организацию и функцию пучков волосков. Во время развития USH1 белки формируют гетеромерные структуры, необходимые для формирования временных апикальных связей между стереоцилиями, прикрепленными к стержневым актиновым филаментам (Fig. 3). Вместе эти молекулярные и структурные соединения необходимы для собственно образования cohesive стереоцилий и обычной формы пучков волосков. На взрослых стадиях USH1 белки также формируют стержневой аппарат механо-электрической трансдукции, при этом cadherin-23 и protocadherin-15 формируют связи на кончиках, которые управляют (gates) механо-электрической трансдукцией канальных комплексов complex (Fig. 3). USH2 белки не обязательны для связанности (cohesiveness) стереоцилий. Вместо этого они необходимы во время поздней стадии морфогенеза пучков, когда они формируют щиколоточные (ankle) связующие комплексы в основании стереоцилий. Эти структуры необходимы во время терминальной стадии формирования пучков волосков, делая возможным создание типичных U- и V-образных слуховых IHCs и OHCs (Fig. 3). Белок USH3a, clarin-1, как было установлено, играют роль в механо-электрической трансдукции, поскольку также действуют как важные организаторы IHC синаптической активной зоны (Geng et al., 2009, 2012; Dulon et al., 2018).

Fig. 3. USH proteins properly shape the developing hair bundle, the sound-receptive structure of hair cells. (A) The stereocilia of the hair bundle are connected to each other by different subsets of fibrous intersterocilia links varying overtime, with some also connecting the stereocilia to the kinocilium. Shown here is a differentiating hair bundle (around P8 in mouse) illustrating the position of the early transient lateral links, the ankle links, and the tip-link. Note that cis-homodimers of cadherin-23 interact in trans with cis-homodimers of protocadherin-15 to form the upper and lower parts of the tip-link, respectively. At the upper extremity of the tip-link, cadherin-23 is connected to the actin core of the stereocilia through interactions with USH1 proteins: harmonin b, Sans and/or myosin VIIa. (B) In the absence of Usher proteins, the normal development and proper shaping of the hair bundle are impaired, as shown in the absence of the USH3a protein, clarin-1 (adapted from Dulon et al., 2018). IHC: inner hair cell, OHC, outer hair cell. (C) Amphibian photoreceptor cone cells with well-developed calyceal processes (green in the schematic representation), F-actin based microvilli surrounding the base of the light-sensitive outer segment. Upon protocadherin-15 (USH1F) knockdown in Xenopus tropicalis, the maintenance of the calyceal processes is impaired, which affects the morphogenesis of the photoreceptor outer segment displaying abnormal tilting (modified from Schietroma et al., 2017). bar = 1 µm. (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the Web version of this article.)

Поскольку огромное большинство USH мышиных моделей воспроизводит слуховые и вестибулярные фенотипические отклонения пациентов Usher, эти модели неспособны воспроизвести фенотип сетчатки. Поэтому был достигнут ограниченный прогресс в понимании механизмов синдрома Usher в сетчатке и идентификации новых лечений дегенерации сетчатки, ассоциированной с этой болезнью. Исследования на сетчатке нескольких видов (мышах, свиньях, лягушках, обезьянах и людях) пришли к заключению, что отсутствие USH1 ретинального фенотипа у мышей, скорее всего, обусловлено отсутствием у грызунов в фоторецепторных клетках calyceal отростков, F-actin-заполненных колец, расположенных в основании наружных сегментов фоторецепторов (Sahly et al., 2012). У приматов фоторецепторные клетки, как полагают, содержат USH1 белки, которые оперируют точно также, как стереоцилии (Fig. 3A), образуя сеть белков, обеспечивающих межмембранные соединения между наружным сегментом фоторецепторов и окружающими calyceal отростками (Fig. 3C). Исследования сетчатки Xenopus tropicalis далее подтвердили, что отсутствие функционального USH1 белка у этого вида вызывает отклонения в calyceal отростках, это также приводит к нарушению роста и организации вновь формируемых дисков, которые составляют наружный сегмент (Fig. 3C, and Schietroma et al., 2017).

USH2 белки (usherin, Adgvr1 и whirlin) были обнаружены в пространственно ограниченном внутреннем сегменте мембранного региона, который окружает ресничку (cilium) соединяющую фоторецептор, регион periciliary ridge мембранного комплекса, где пузырьки контактируют (dock) с плазматической мембраной во время транслокации наружного сегмента. USH2 мутантные мыши, лишенные usherin или длинной изоформы whirlin, как было установлено, вызывают аномалии сетчатки, включая дегенерацию сетчатки (rev. Maerker et al., 2008; El-Amraoui and Petit, 2014; Mathur and Yang, 2015, 2019).

Функция белка USH3, clarin-1, в сетчатке пока неизвестна, главным образом, из-за отсутствия соотв. модельных USH3 животных, воспроизводящих ретинальный фенотип людей и из-за множества конфликтующих результатов относительно локализации clarin-1 в фоторецепторных клетках, ретинальных промежуточных нейронах и Мюллеровских клетках (Xu et al., 2020).

В последние годы широкий круг терапевтических стратегий продемонстрировал свою эффективность в преклинических исследованиях, а некоторые даже подверглись клиническому испытанию с целью улучшения зрения слепнущих пациентов (Sahel et al., 2019). Кульминацией этих исследований стало недавнее разрешение первой коммерческой добавки гена, нацеленной на моногенное сенсорное нарушение, врожденный Leber Amaurosis, вызывающий преждевременную потерю зрения. Этот продукт, LUXTURNA™ (voretigene neparvovec-rzyl; Spark Therapeutics, Inc., Philadelphia, PA), доставляет нормальную копию кДНК гена RPE65 с adeno-associated virus (AAV) в клетки сетчатки для лечения ретинальной дистрофии, ассоциированной с биаллельной RPE65 мутацией (Russell et al., 2017; Maguire et al., 2019).

Значительное количество клинических испытаний предложено для удлинения жизнеспособности клеток сетчатки и остановки снижения зрения. Usher пациенты были привлечены к некоторым испытаниям, разработанным для лечения поздно начинающегося прогрессирующего retinitis pigmentosa. Напр., некоторые пациенты с ранним началом retinitis pigmentosa, включая USH2 и USH3, получали импланты капсул человеческих NT-501 клеток, с помощью которых осуществляли субретинальную доставку ciliary neurotrophic factor (CNTF). Этот фактор поддерживает жизнеспособность клеток, особенно колбочек и останавливает постепенную потерю зрения (Trials #NCT00447980; #NCT01530659). Это испытание сегодня завершено, но результат этого исследования пока не опубликован. Первое исследование, посвященное Usher генотерапии у людей находится в I/II клинического испытания, осуществляемого с помощью субретинальной доставки на базе лентивируса (EIAV) гена USH1B, MYO7A. Это испытание было завершено по желанию спонсора (Sanofi) of clinical development plans and priorities (Trial #NTC01505062). Др. USH1B испытание проводится с использованием AAV-обеспечиваемой доставки, вектора, который наилучшим образом подходит для трансдукции фоторецепторов, преимущественных клеток мишеней при USH1 ретинопатии (Jacobson et al., 2008; Schietroma et al., 2017). Принимая во внимание очень большой размер MYO7a, использована оптимизированная система из двух векторов, использованных для доставки гена в виде двух фрагментов с возможностью его реконструкции в полную длину кодирующей последовательности в клетках мишенях (rev. McClements and MacLaren, 2017; Trapani, 2019). Используя разные двойные векторы, инъецируемые в сетчатку для достижения успешной экспрессии функционального myosin VIIa, получены многообещающие результаты с гибридными векторами (Dyka et al., 2014; Trapani et al., 2014). Клинические испытания ведутся в Европе с добавлением MYO7A с помощью двойных AAV векторов, чтобы воздействовать на сетчатку USH1B пациентов (UshTher, Horizon, 2020; Trial #NCT02065011).

AAV-обеспечиваемая генная экспрессия описана для довольно стабильного, длящегося уже несколько лет клинического испытания у людей и собак (Wojno et al., 2013). Однако, несмотря на обнадеживающую заместительную генотерапию, этот подход не подходит для очень крупных генов (более 10 kb), или которые экспрессируют множественные важные изоформы, такие как CDH23, USH2A или GPR98/ADGVR1. Др. клиническое испытание, также в фазе I/II (ProQR, Stellar; Trial #NCT03780257), оценивает безопасность и переносимость в отношении специфичной к мутациям терапевтической стратегии, инъекций в стекловидное тело антисмыслового олигонуклеотида (ASO), QR-421a, предназначенного для пропуска мутантного экзона 13 гена USH2A. В самом деле, один из наиболее патогенных вариантов крупного USH2A гена (~71 'rpjy, 15606 bp) затрагивает экзон 13 у людей. Для этого клинического испытания были разработаны ASOs, предназначенные вызывать in-frame делецию экзона 13, позволяя тем самым обходить мутантный сайт. В отсутствии подходящих животных моделей с USH2A-обусловленной потерей зрения, эффективность QR-421a тестировалась на модельных Ush2a рыбках данио (Dona et al., 2018; Han et al., 2018).

ASOs целенаправлено воздействовали на РНК и ограничивались болезнями, подходящими для репарации путем блокирования трансляции или специфических сайтов сплайсинга. Др. подходы целенаправленно воздействовали на специфические Usher мутации исследуются, хотя подходящие модели всё ещё отсутствуют. Это исследования: (1) Translational Read-Through-Inducing Drugs (TRIDs), которые целенаправлено воздействуют на nonsense мутации и могут использоваться при генных болезнях, независимо от из качественных особенностей. TRIDs были оценены в сетчатке Ush1c мышей (Goldmann et al., 2010, 2011, 2012). Новое поколение aminoglycosides NB30, NB54 и химерного соединения PTC124 было оценено в отношении их токсичности для сетчатки и эффективности считывания ими nonsense патогенного варианта, p.Arg31*, в гене Ush1c (Godmann et al., 2012). Эти лекарства показали подходящую биосовместимость и приводили к частичному восстановлению экспрессии harmonin в сетчатке после воздействия, но они не были оценены в отношении их действия во внутреннем ухе; (2) Overlack et al. (2012) использовали Zinc Finger nucleases (ZFNs), в качестве инструмента для редактирования гена, чтобы целенаправленно воздействовать на нонсенс мутации в USH1C. Мутация p. p.Arg31* была внесена в мышиную Ush1c ДНК. Получены стабильные p.Arg31*-Ush1c и контрольная Ush1c клеточные линии путем переноса трансфицирующих плазмид Flp in-HEK293 клетки. Гомологичная рекомбинация с использованием ZFNs целенаправлено воздействовала на несмысловой патогенный вариант и была оценена на белковом и геномном уровне. Эта работа также показала пониженную токсичность в клеточных культурах. Хотя разрывы двойной нити и гомологичная рекомбинация были достигнуты in vitro, процесс оказался достоверно менее эффективным in vivo в неделящихся клетках. ZFNs (такие как TALENs) сегодня заменены более подходящей системой CRISPR/Cas9; (3) Наконец, исследования на фибробластах человека с использованием CRISPR/Cas9 недавно выявили успешную репарацию распространенной мутации в гене USH2A, c.2299delG, которая отвечает за 31% всех случаев USH2 (Fuster-Garcia et al., 2017). В первых экспериментах Fuster-Garcia et al. оценили USH2A-специфические sgRNAs путем внесения двух экзонов 13 USH2A распространенных мутаций с помощью гомологичной рекомбинации в HEK клетках, c.2299delG, c.2276G > T. Отбор плазмид Cas9-sgRNA демонстрирует эффективность разрезания и эффективность homology-directed repair (HDR) свыше 16% in vitro. Тот же самый подход был использован для оценки репарации мутаций патогенного варианта c.2299delG в фибробластах человека. Эффективность HDR была низкой, но обнаружимой после коррекции производительности в 2.5% и не обнаруживала активность вне мишеней. С разработкой новых инструментов, позволяющих более эффективное воздействие на мишени, увеличится использование редактирования генов для лечения нарушений у людей, включая и синдром Usher, в ближайшем будущем.

Как и глаза, внутреннее ухо оказывается доступным и имеет относительно иммуно-привелигированное окружение, подходящее для разработки потенциального лечения. Информация о генетической этиологии и обнаружение молекулярных механизмов болезней поможет выбору наиболее подходящей стратегии облегчения, предупреждения и/или коррекции массы сенсорных дефицитов, связанных с внутренним ухом (see Fig. 4). Некоторые подходы, предназначенные для др. генетических болезней, недавно стали использовать для целенаправленного воздействия на разные Usher гены.

Fig. 4. Various therapeutic approaches are used for the Usher syndrome. (A) Viral mediated approaches to rescue hearing and balance deficits make use of distinct conventional and synthetic adeno-associated virus (AAV) vectors, which can be delivered through different routes of administration. One major disadvantage of AAVs, however, is their low viral capacity, limited to ?4.7-5 kilobases, including promoter region, the transgene, and polyA 3?region, between the two inverted terminal repeats (ITRs). Out of the 10 USH cDNAs, only 5 can fit into AAVs: USH1C, USH1G, CIB2, WHRN, and CLRN. (B) Mutation specific approaches can be used that are not restricted by the size of the targeted gene. These include anti-sense oligonucleotide (ASO) or gene editing strategies, notably CRISPR/Cas9. As illustrated, guide RNAs are designed to target a specific region of the DNA that includes nuclease specific PAM motifs. Guide RNAs direct Cas9 endonucleases to the specific PAM motifs and cleaves or edits the targeted site. Different CRISPR tools have been engineered that use different PAM motif and Cas9 endonucleases. These nucleases can generate double stranded or single stranded DNA cleavage; they can disable cleavage of one DNA strand or allow base editing with the use of a dead Cas9. Gene alteration, repression, activation and correction can now be precisely designed with the use of these new tools (see Knott and Doudna, 2018).

Классическая стратегия генотерапии использует внесение функциональной копии дефектного гена, добавление или замещение гена. В этом случае кДНК, кодирующая функциональный ген упаковывается в вектор, который может быть доставлен непосредственно в внутреннее ухо. Разные векторы были оценены, включая и аденовирусы (AdV), adeno-associated viruses (Chien et al., 2015a, 2015b; Dazert et al., 1997; Husseman and Raphael, 2009; Kesser et al., 2008; Li Duan et al., 2002; Sacheli et al., 2013; Takada et al., 2015; Venail et al., 2007; Zhang and Bergelson, 2005), ретровирусы (Bedrosian et al., 2006), лентивирусы (Bedrosian et al., 2006; Han et al., 1999; Pietola et al., 2008; Wei et al., 2013; Wang et al., 2013, Yang et al., 2013) и Herpes Simplex вирус (Chen et al., 2001; Derby et al., 1999). Благодаря своей низкой иммуногенности в проведенных клинических испытаниях в дополнение к установленной эффективности в разных типах клеток внутреннего уха, AAVs стали страндартным вектором для будущей генотерапии во внутреннем ухе (rev. Ahmed et al., 2017; Fukui and Raphael, 2013; Lustig and Akil, 2019; Omichi et al., 2019; Sacheli et al., 2013) (Ahmed et al., 2017; Devare et al., 2018; Lustig and Akil, 2019; Omichi et al., 2019; Ren et al., 2019; Taiber et al., 2019).

Впервые описанные примерно 50 лет тому назад, AAVs состоящими из одной нити, ДНК вирусами, принадлежащими к семейству Parvoviridae. Они были выделены у широког круга органи змов и не ассоциированы с какой-либо болезнью. Их номенклатура (AAV2/1, AAV2/8, etc…) такова, что серотип вируса обозначается вторым числом; а первое число обозначает тип инвертированного терминального повтора (ITR) (короткую последовательность ДНК, которая образует фланги AAV генома и позволяет ему формировать контактемеры в клетках хозяина). При этом почти все векторы, используемые для генотерапии содержат AAV типа 2 ITRs. Эффективность вектора измеряется по его эффективности, с помощью которой трансген доставляется, и его специфичности к типу клетки мишени (тропизм). Во внутреннем ухе, независимо от причинного гена, успешность и эффективность целенаправленного воздействия на на волосковые клетки зависит от нескольких параметров: серотип вируса, чистота вируса, титр, способ введения и используемый промотор (напр., cytomegalovirus CMV, hybrid CAG, hair cell specific, etc.), вместе с возрастом развития, при котором осуществляется лечение (Ahmed et al., 2017, Corey and Maguire Hearing Research SI, 2019; Emptoz et al., 2017; Fukui and Raphael, 2013; Isgrig et al., 2019; Yoshimura et al., 2019). Многообещающие результаты по замещению гена были получены при использовании отличающихся AAVs, чтобы замещать 4 USH гена, USH1C, USH1G, USH2D и USH3A.

USH1C: ген USH1C кодирует каркасный белок harmonin (Fig. 1). Мутация основательница в USH1C, c216 G > A, была идентифицирована у пациентов южной Луизианы (Lentz et al., 2005, 2010). Этот патогенетический вариант, расположен в экзоне 3, он создает скрытый 5' splice сайт, которые используется преимущественно после аутентичного 5' splice сайта в экзоне 3. Этот патогенный вариант приводит к транслокации укороченного белка, лишенного всех доменов PDZ и PST (see Fig. 1) необходимых для каркасной функции harmonin. Терапия с помощью замещения гена была оценена на модельных нокаутных мышах, у которых воспроизводится Ush1c. c216 G > A мутация (Lentz et al., 2010; Pan et al., 2017). Pan et al. (2017) использовали преимущества вновь сгенерированного синтетического вектора, AAV2/Anc80L65 (Landegger et al., 2017; Zinn et al., 2015), предпологаемого родоначальника широко изученных AAV2/1, 2/2, 2/8 и 2/9. Анализ родоначальной последовательности компонентов вирусной капсиды привел к созданию in silico эволюционно промежуточных образования (Zinn et al., 2015), среди которых AAV2/Anc80L65, как было установлено, успешно и эффективно целенаправленно воздействует на волосковые клетки новорожденных мышей (Landegger et al., 2017).

Pan et al. (2017) использовали AAV2/Anc80L65 для доставки кодирующей последовательности для двух изоформ harmonin, как известно, экспрессирующегося в волосковых клетках. Harmonin-b преимущественно располагается на верхнем кончике плотности сцепления (Grillet et al., 2009; Michalski et al., 2009), а harmonin-a ассоциирует с полоской синапсов, где он модулирует voltage-зависимые кальциевые каналы (Gregory et al., 2013). Инъекции AAV2/Anc80L65-CMV-harmonin-b через круглое окошечко мембраны (round window membrane (RWM)) в P1 приводит к целенаправленной экспрессии и коррекции harmonin на кончике стереоцилий, а также к восстановлению нормальной морфологии пучка волосков и к функциональной механо-чувствительности. Важно, что стратегия способствует жизнеспособности волосковых клеток и восстанавливает чувствительность к звукам, обычно отсутствующую (при более 100 dB), до порогов столь низких как 30 dB в лучшем исполнении и ~50 dB при среднем, со значительным улучшением при более низких частотах до 16 KHz. Кроме того, harmonin-a содержащие векторы не приводят к серьезному улучшению свойств мутантных волосковых клеток и чувствительности слуха. При вестибулярных нарушениях у этих мышей заместительная терапия Ush1c также оказывается неспособной восстанавливать функцию волосковых клеток, хотя в целом устраняет поведение кручения у обработанных мышей (Pan et al., 2017).

USH1G: Ген USH1G кодирует каркасный белок sans (Fig. 1). Emptoz et al. (2017) оценили заместительную генотерапию у модельных мышей USH1G. Ush1g+/- мыши обнаруживают выраженную глухоту и вестибулярные нарушения. Разные AAV серотипы были использованы для доставки посредством RWM при P2.5: AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5 и AAV2/8. Вектор AAV2/8 из Penn vector core facility был использован для исследования. Перенос с помощью вируса Ush1g кДНК привел к устранению дефектов пучков волосков, к частичному восстановлению слуха с более100 dB до ~75 dB в регионе низких частот и к достоверному устранению вестибулярных нарушений, на что указывало восстановление angular vestibular ocular reflexes (Emptoz et al., 2017).

USH2D: Ген USH2D кодирует PDZ содержащий белок whirlin (Fig. 1), который экспрессируется на кончике и временно в основании стереоцилий. Разные изоформы whirlin, длинные и короткие (Fig. 1), нацелены на разные регионы пучка волосков и экспрессируются во внутреннем ухе во время развития (Mathur et al., 2015; Mathur and Yang, 2019). Патогенетические варианты, приводящие к возникновению преждевременного стоп кодона в whirlin N- и C- терминальных регионов, приводят к синдрому Usher типа 2D, USH2D, и не синдромальной рецессивной глухоте, DFNB31, соотв. (Mathur and Yang, 2015, see Table 1). В своем первоначальном исследовании Chihien et al. (2016) продемонстрироали, что инъекции RWM длинной изоформы whirlin, AAV2/8-CMV-whirlin, приводят к восстановлению высоты пучков волосков, но без существенного восстановления слуха, возможно из-за низкой скорости трансдукции волосковыми клетками. В последующем исследовании, используя тот же самый вектор, но путем доставки через др. маршрут, инъекций в задний полукружный канал, Isgrig et al. (2017) получили более высокую степень трансдукции волосковыми клетками у whirler мышей и достоверное, хотя и слабое восстановление функции слуха, при этом улучшались средние пороги от более 100 dB у не леченных мышей до 80 dB в среднем у инъецированных мышей, при этом пороги в наилучших случаях оказывались примерно в 60 dB для чистых тонов в 8 KHz. Восстановление функции баланса оказывалось достоверным при снижении поведения кружения, улучшении плаванья и rotarod действий.

USH3A: ген USH3A кодирует tetraspan-подобный гликопротеин, clarin-1 (Fig. 1). Патогенные варианты USH3A ассоциированы с post-lingual прогрессирующей потерей слуха и пигментной дегенерации сетчатки. Три разных исследования замещения генов опубликованы для USH3A (Table 2). В каждом использовали разные мышиные модели: нокаутные мыши, обнаруживающие трансген, состоящий из Clrn1-ITR под контролем регуляторных элементов, чтобы управлять экспрессией волосковых клеток и постнатальным подавлением (Geng et al., 2017), две мышиные модели тотального нокаута (Clrn1^ex1-/-: Gyorgy et al., 2018, и Clrn1^{ex4 -/-}: Dulon et al., 2018), и мыши с кондиционным нокаутом с делецией гена Clrn1, специфичной для волосковых клеток, Clrn1^ex4fl/fl, Myo15^cre+/- мыши (Dulon et al., 2018). Для этих исследований использовали разные вирусные векторы: AAV2/8 (Geng et al., 2017; Dulon et al., 2018) и AAV2/9 капсидный вариант (AAV2/9-PhPB с CAB промотором и woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element или WPRE) (Gyоrgy et al., 2018).

Table 2. List of gene replacement and mutation specific-based therapeutic strategies carried out in the inner ear of Usher mouse models. RWM, round window membrane.

Dulon et al. (2018) показали, что три разные изоформы Clrn1 экспрессируются в органе слуха. Clarin-1 обнаруживается в пучке волосков и синаптической зоне волосковых клеток рыбок данио (Ogun and Zallochi, 2014; Gopal et al., 2015). он, как было установлено, играет функциональную роль в обеспечении механо-электрической трансдукции в пучках волосков (Geng et al., 2012; Dulon et al., 2018) и в полоске синапсов волосковых клеток, модулируя экзоцитоз посредством взаимодействий с L-типа кальциевыми каналами и harmonin (Dulon et al., 2018). Стратегии замещения гена у мышей с тотальным нокаутом выявили, что экспрессия вариантов Clrn1 , кодирующих предсказуемую принципиальную изоформу, экспрессируемую в волосковых клетках (clarin-1 isoform 2), практически не приводит к восстановлению слуха (Geng et al., 2017; Dulon et al., 2018). Разные исходы наблюдали Gyоrgy et al. (2018) с заместительной генотерапией с использованием Clrn1 изофоры 2 у Clrn1^ex1-/- с дальнейшим улучшением в области низких частот. Однако, сходное воздействие у мышей с задержкой начала при делеции Clrn1 (Clrn1^ex4fl/fl Myo15^{cre +/-}) приводило к достоверному восстановлениею с более 100 dB порогов ABR у нелеченных мышей до порогов уровня дикого типа у леченых мышей (30-40 dB) aна ст. P22-P24 (Dulon et al., 2018). Сдвиг порога к 60-70 dB наблюдался и на ст. P60, вообще-то благодаря низкой эффективности трансдукции в OHCs.

В этих исследованиях восстановление слуха у леченых Usher модельных мышей часто было низким и неполным, возможно из-за низкой величины вирусной трансдукции в слуховых OHCs при использовании обычных AAVs (Emptoz et al., 2017; Isgrig et al., 2017). Значительно лучшее восстановление слуха получали при внесении синтетических AAVs Anc80L65, которые, как было установлено, инфицируют улитковые IHCs и OHCs с высокой эффективностью (Landegger et al., 2017). Недавнее исследование показало. что два др. AAVs с лучшим показателем эффективности инфицирования IHCs и OHCs, а именно, AAV2/9-PHPB (Gyоrgy et al., 2018, 2019; Lee et al., 2020) и синтетический AAV2/2.7m8 (Isgrig et al., 2019). WВ то время как AAV2/2.7m8 инфицирует также внутренние pillar клетки и внутренние phalangeal клетки с высокой эффективностью, было также установлено, что предпочтительной мишенью являются волосковые клетки улитки по сравнению с вестибулярными волосковыми клетками (Isgrig et al., 2019). Дальнейшие исследования на мышах и особенно крупных животных, таких как не человекообразные приматы, необходимы для тестирования этих вирусов. Оптимизация наиболее эффективных промоторов и методов доставки (semicircular canal or macular, round window approach) может улучшить степень восстановления слуха ( и баланса).

Чрезвычайно важно, что способность к клонированию у AAVs ограничена всего 4.7 Kb (see Fig. 4A). С тех пор, как две ITRs из AAV приблизительно в 0.2-0.3 Kb всего, а чужеродная кДНК может быть внесена двумя 2 ITRs д. быть менее 4.4 Kb. Превышающая этот размер кДНК может быть внесена векторами превышающими 5 kb, будет приводить к несоразмерности транслируемых продуктов с гетерогенной длиной и укорочением на 5' конце (Wu et al., 2010). Как видно Table 1 and Fig. 1, некоторые USH гены превышают возможности AAV, а некоторые экспрессируют разные изоформы. Поэтому альтернативным подходом необходимым для крупных генов может стать адаптированная терапия. Лентивирусы и аденовирусы (AdV) являются привлекательными частично благодаря своей способности упаковывать крупные объемы (до 36 Kb для третей генерации AdV), но побочные эффекты, связанные с токсичностью и иммунной реакцией привели к снижению интереса к их использованию для генотерапии (Hendrickx et al., 2014). Интересно, что низкая способность AAVs может быть преодолена путем использования двух AAV векторов, т.е кодированием двух кодирующих фрагментов гена и восстановлением из них полной длины кодирующей последовательности в клетках мишенях (rev. McClements and MacLaren, 2017; Trapani, 2019; Reisinger, 2019). Во внутреннем ухе два недавних исследования оценивали пригодность двух AAVs у мышей, нацеленных на ген DFNB9, Otof, кодирующий otoferlin, предполагаемый Ca2+ сенсорный ключ для высвобождения синаптического нейротрансмиттера в IHCs (Akil et al., 2019; Al-Moyed et al., 2019). После инъекции двух AAVs, один с 5' частью Otof кДНК, сопровождаемый splice донорским сайтом, второй с splice акцепторным сайтом, сопровождаемый Otof 3' C-терминальным регионом, восстановление полной длины otoferlin белка в IHCs приводило к продолжительному восстановлению его экспрессии и к устранению глухоты до дикого уровня. Этот подход, к заместительной генотерапии с помощью AAVs всё ещё пригоден только для генов менее 9 kB , т.к. необходимо вместить промотор, сигналы к poly-adenylyation и в зависимости от подхода, splice акцепторы и доноры. Два Usher гена MYO7A (USH1B) и PCDH15 (USH1F) могут использоваться для целенаправленного действия с помощью двойной генотерапии. Ведется клиническое испытание в Европе с MYO7A на двух AAV векторах, чтобы целенаправленно воздействовать на сетчатку и потерю зрения у пациентов с USH1B (UshStat, Horizon, 2020; NCT02065011), но эффективность этого подхода для Usher генов во внутреннем ухе ещё предстоит определить.

В противоположность замещению генов, подходы по репарации мутаций разработаны, чтобы корректировать данный патогенетический вариант , не нарушая структуру всего гена. Одним из главных преимуществ является то, что восстанавливаемая кодирующая последовательность и все родственные регуляторные элементы остаются интактными, тем самым сохраняются физиологические уровни экспрессии гена в соотв. клетках. Эти молекулярные подходы используют малые молекулы, лекарства. короткие однонитчатые олигонуклеотиды ил инструменты для редактирования генома (ZFNs, TALENs и особенно CRISPR/Cas9). Некоторые из этих инструментов были успешно использованы для осуществления репарации Usher и/или генов глухоты с обнадеживающими результатами.

USH3A: В поиске малых молекул Alagramam et al. (2016) использовали базирующийся на клетках высоко-производительный скрининг для идентификации малых молекул, способных стабилизировать CLRN1N48K. CLRN missense патогенный вариант, pN48K, как было установлено, приводит к снижению экспрессии и неправильной локализации белка CLRN1N48K. Идентифицирована ведущая молекула (BF844), которая действует как протеосомный ингибитор и повышает стабильность белка посредством модуляции HSP90 и HSP60. Введенная внутрибрюшинно с дозой эскалации, начинающейся с 10 mg/kg на ст. P10, BF844 успешно защищала Clrn1N48K knockin мышей от прогрессирующей потери слуха. В отсутствие Ush3a модель потери зрения эффективно отвечала на это соединение, смягчая потерю зрения, что необходимо ещё подтвердить.

USH1C: Lentz et al. (2013) разработали анти-смысловую олигонуклеотидную стратегию, нацеленную на Acadian USH1C мутацию. Для этой мутации, разработаны разные ASOs, предназначенные подавлять скрытые сплайс-сайты, созданные аномально за счет 216 G > A патогенного варианта, и восстанавливать экспрессию откоррктированной нормальной РНК. Системные инъекции новорожденным, наиболее эффективные для ASOs (отобранным in vitro) привели к восстановлению экспрессии полной длины harmonin у Ush1c c.216G > A мышей, восстановлению морфологии пучка волосков и восстановлению функции слуха по оценке ABR и баланса по оценке поведения в открытом поле (Lentz et al., 2013).

Появление нового Cas9 энзима (высокой точности и укороченной версии с соотв. сайтом распознавания PAM) позволило ещё больше расширить пределы целенаправленного действия Cas9 и повысить специфичность редактирования генов (Gyоrgy et al., 2019). Выдающиеся и многообещающие результаты недавно получены с использованием cationic-lipid (Gao et al., 2018) и AAV -обеспечиваемой (Gyоrgy et al., 2019) доставки CRISPR-Cas9 и компонентов ген-специфической single guide RNA (sgRNA) для разрушения мутантного Tmc1 аллеля у Beethoven (Bth) мцшей, модели доминантной формы DFNA36 потери слуха у людей. Lipid-mediated Cas9/sgRNA доставка в улитке Tmc1Bth/WT мышей привела к умеренному улучшению порогов слуха спустя 4 недели после воздействия (Gao et al., 2018). Сохранение слуха было умеренным и неустойчивым даже при низких частотах, это объясняется недостаточным количеством отредактированных волосковых клеток и/или отсутствием специфичности Cas9 энзима, что приводит к нежелательной инактивации WT TMC1 аллеля (отличие только в одну пару оснований от нормального аллеля) (Gao et al., 2018). Недавнее использование Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9-KKH), более короткого варианта, который влезает в один AAV, существенно улучшило результаты аллель-специфичного геномного редактирования при доминантной потере слуха. Интересно, что PAM последовательность этого Cas9 варианта "NNNRRT" была использована для отбора эффективных sgRNAs, что было подтверждено in vitro и in vivo на примере специфической индукции indels только в Tmc1Bth/WT, но не в Tmc1WT/WT отредактированных клетках. AAV-обеспечиваемая доставка SaCas9-KKH/sgRNA комплекса оказалась успешной в предупреждении глухоты у Tmc1 Bth/WT мышей в течение года (Gyоrgy et al., 2019). Необходимы дальнейшее тестирование и оценка таких подходов для USH генов, CRISPR-Cas9 теперь открывает широкий набор инструментов с повышенной специфичностью к мишени (Doudna and Charpentier, 2014; Lino et al., 2018). Такие инструменты могут быть использованы для разрушения доминантных мутаций или коррекции рецессивных мутаций посредством HDR или редактирования оснований. Во многих примерах однако, использование более крупных вариантов Cas9 оказывается необходимым, что требует разных устройств для доставки (напр. липосом, частиц золота), вирусных векторов с большой ёмкостью для груза, таких как аденовирусы и лентивирусы или использование двух AAV векторов для упаковки энзима вместе с gRNA и если необходимо, то и донорской ДНК (для HDR) (rev. Knott and Doudna, 2018; Lino et al., 2018). Двойные векторы AAV были успешно использованы in vivo для редактирования генома из др. генов с расщепленным CRISPR редакторами оснований (Truong et al., 2015; Winter et al., 2019; Lim et al., 2020).

За исключение пациентов с USH3, глухота является врожденной в большинстве форм синдрома Usher, USH1 и USH2. Начало потери слуха и границы частот перцепции различаются между мышами и людьми. Внутреннее ухо мышей функционально незрелое при рождении, они начинают слышать только во время второй постнатальной недели. Напротив, внутреннее ухо человека полностью функционально до рождения, оно достигает своего окончательного созревания in utero примерно к 20 неделям беременности (Hepper and Shahidullah, 1994). Сходным образом, в то время как у мышей клетки prosensory домена выходят из клеточного цикла примерно на день эмбриогенеза 12 (E12), у людей выход из клеточного цикла уже происходит на 7 неделе (W7, после зачатия) (Roccio et al., 2018). У плодов человека, MYO7A-позитивные волосковые клетки обнаруживаются в канале улитки на ст. W11, тогда как у мышей они обнаруживаются приблизительно на ст. E13. Присутствуют ли эти клетки и всё ещё жизнеспособны при рождении у пациентов с синдромом Usher? К сожалению, сегодня нет технологи, позволяющей видеть сенсорные клетки вдоль слухового органа у новорожденных детей.

Поэтому остаются вопросы, как успехи, достигнутые на модельных животных перенести на пациентов. В то время как USH1 пациенты часто диагностируются в течение нескольких первых лет, USH2 и USH3 пациенты обычно диагностируются в более позднем возрасте перед созреванием или у взрослых.

В ожидании переноса в клинику, необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить пригодность методов для контролируемой, безопасной и эффективной доставки во внутреннее ухо прицельно на сенсорные волосковые клетки в разные промежутки времени. Учитывая важность tonotopic информации о преобразовании звуков, степень и скорость трансдукции вирусами волосковых клеток имеет огромное значение для восстановления слуха по всем частотам у людей. Более 100 AAV серотипов было идентифицировано и преобразовано, чтобы улучшить их трансдукцию в ткань мишень. Ряд вирусов, нацеленных на волосковые клетки, был оценен на мышах (rev. Corey and Maguire, Hearing Research, Special Issue, 2020). Тропизм, однако, как известно, отличается у разных видов и вирусные векторы, оцененные на мышах, могут оказаться неэффективными у людей. Исследования на крупных модельных животных, таких как не человеко-образные приматы, с начлом появления слуха у плодов и сравнимыми акустическими пределами и чувствительностью, сходными с таковыми у людей, окажутся способными к надежной и эффективной оценке терапевтических возможностей для генов глухоты, до переноса технологии в клинику.

Относительно доставки генов, минимальные и не инвазивные методы локальной доставки сегодня разрабытываются для лечения нарушений внутреннего уха. Из-а очень ограниченного объема раствора, который может быть доставлен во внутреннее ухо, необходимы концентрированные соединения или вирусные векторы высокого титра, чтоб осуществить качественную трансдукцию сенсорных клеток от базальных высокой частоты витков до апикальных низкой частоты витков улитки. Отсутствие нежелательной экспрессии вирусов в нежелательных клеточных мишенях также необходимо оценить и проверить на токсичность. Наконец, принимая во внимание длительную продолжительность жизни человека, необходимы одиночные инъекции в детстве, гарантирующие длительный терапевтический эффект. Если не так, то сколько повторных инъекций необходимо для поддержания терапевтического успеха и если так, то не будут ли повторяющиеся инъекции усиливать риск токсичности и иммунной реакции?

Successful outcomes in retinal treatment is likely to facilitate translation of these novel therapies to the inner ear. Interestingly, most of the gene therapy reports in mice showed optimal recovery of hearing sensitivity in lower frequencies. Because cochlear implants expand along the higher frequency region of the hearing organ, the combination of such a device with gene therapy may be the first step in the development and assessment of biological therapies for hearing loss. Gene and drug delivery to the inner ear remains technically challenging. While similar approaches as cochlear implantation may be envisaged, biological treatments have to be applied in an optimal manner that will preserve the delicate, often already compromised, structures that are embedded within the inner ear. Innovative surgical technologies are thus necessary to deliver newly developed therapies in a safe and efficacious manner. New developments in the field of viral-mediated targeting (e.g. new and more efficient AAVs) and gene editing (e.g. improved Cas9 variants, increased homologous directed repair efficiency) will provide opportunities to optimize gene replacement and/or repair. Building upon precise knowledge of a given gene, determination of the pathogenic variant and natural history of the disease, it is now possible to design and evaluate the best and most efficient therapeutic strategy for patients. However, important considerations need to be addressed before any of these therapies can be applied to patients. One major question is whether the new therapies will be used to complement or replace current hearing devices, if clinically proven to outperform hearing prostheses. Realistic endpoints will have to be determined and carefully discussed with patients, particularly when such therapies may not restore function but rather halt progression of the disease. Nevertheless, science has now opened new doors for the treatment of genetic hearing loss and Usher syndrome. Transfer of this knowledge to the clinic with require concerted efforts by scientists in diverse fields such as virology, immunology, molecular and cell biology and physiology along with audiologists and physicians.