Кора надпочечников является первичным местом синтеза стероидов и является важным органом. Кора подразделена на гистологически и функционально самостоятельные концентрические слои, которые окружают центральную medulla. Непосредственно под капсулой, которая покрывает всю железу, это zona glomerulosa (ZG) продуцирует mineralocorticoids (в основном aldosterone), а зона fasciculata (ZF) синтезирует глюкокортикоиды (главные биоактивные субстанции - это cortisol у людей и и corticosterone у грызунов). Люди также имеют zona reticularis (ZR), которая синтезирует андрогены надпочечников (Fig. 1A). Продукция минералкортикоидов находится под контролем renin-angiotensin-aldosterone системы, при этом глюкокортикоиды контролируются hypothalamic-pituitary-adrenal осью. Глюкокортикоиды регулируют метаболизм глюкозы, воспаление, иммунную реакцию, мышцы и скелетную массу, а также познавательную деятельность, а также самочувствие и память; тогда как минералкортикоиды контролируют объем внеклеточных жидкостей и гомеостаз натрия и поэтому важны для поддержания кровяного давления.

Fig. 1. A) Schematic representation of the different zones found in the postnatal human adrenal cortex. Adrenocortical stem/progenitor cells are scattered in the capsule and in the ZG. Differentiation of stem cells to mature ZG and ZF cells, as well as centripetal streaming of older steroidogenic cells, governs the adrenal self-renewal. Pathways, such as the SHH and WNT/β-catenin, are crucial for early differentiation events, while apoptosis is frequently observed at the cortex/medulla boundary in senescence cells, marking the end of their life-cycle. B) List of genes whose mutations result in primary adrenal insufficiency and that could therefore be a target of gene therapy approaches.

Кора надпочечников возникает из надпочечник-гонадного предшественника, группы клеток в целомическом эпителии, экспрессирующих транскрипционный фактор steroidogenic factor 1 (SF-1, или nuclear receptor subfamily 5, group A, member 1, NR5A1). Клетки, экспрессирующие SF отслаиваются от дорсального целомического эпителия в мезонефрическую мезенхиму и выделяются, чтобы сформировать зачатки надпочечников и гонад. Затем зачаток надпочечника пронизывается мигрирующими клетками нервного гребня и Шванновскими клетками, которые д. сформировать мозговой слой (medulla) и фибробластам-подобные клетки, которые будут формировать капсулу (Mariniello et al., 2019). SF-1, является главным регулятором стероидогенеза, как было установлено, является важным для развития коры надпочечников посредством соединения с чувствительными элементами в промоторных регионах стероидогенных генов и позитивно регулируя из транскрипцию (Val et al., 2003; Bland et al., 2004). Интересно, что с использованием Cre мышиных моделей, удалось продемонстрировать, что в плодном надпочечнике Sf-1 позитивные клетки дают начало субнабору клеток капсулы (Wood et al., 2013).

Сегодня ясно, что кора надпочечников является динамичным органом, обладающим способностью к самообновлению в течение всей жизни у грызунов (и предположительно у людей), чтобы замещать старые клетки и поддерживать или расширять зоны в соответствии с физиологическими потребностями в стероидах или в ответ внешние фармакологические стимулы. Напр., диета с высоким содержанием натрия или лечение ингибиторами Angiotensin Converting Enzyme (ACE) приводит к сокращению ZG, напротив при диете с низким содержанием слои происходит её экспансия. Лечение синтетическими глюкокортикоидами, такими как dexamethasone, приводит к атрофии ZF благодаря управляемому HPA снижению уровней ACTH; ZF обычно регенерирует после прекращения воздействия. Исследования по отслеживанию клонов с использованием генетически модифицированных мышей продемонстрировали, что самообновление желез надпочечников поддерживается за счет пула стволовых клеток и клеток предшественников, которые расположены внутри капсулы и в субкапсулярных регионах ZG, чье поддержание, активация и дифференцировка контролируются сложной сетью передачи паракринных сигналов, выявленных в течение последней декады; примером таких путей являются передачи сигналов Sonic Hedgehog (SHH), Fibroblast Growth Factor (FGF), wingless-type MMTV integration site и (WNT)-beta catenin/R-spondin (Mariniello et al., 2019). Недавно в исследованиях на мышах было установлено, что кора обновляется зависимым от пола способом, при этом самки мышей обнаруживают в 3 раза более высокий оборот, чем самцы. У самок, но не у самцов, этот процесс базируется на непрерывном рекрутировании Gli1-экспрессирующиъ стволовых клеток из капсулы и более высокой скорости пролиферации стероидогенных клеток по сравнению с самцами. Экспериментальные доказательства с использованием отслеживания клонов у Gli1-CreERT2 мышей подтвердили, что рекрутирование Gli1-позитивных клеток капсулы и высокий уровень оборота в тканях управляются с помощью женских гормонов и репрессируется андрогенами (Grabek et al., 2019). Предполагается, что подобные половые отличия могут проявлять себя и в пол-специфических болезнях, напр., это может объяснить высокое превалирование болезней надпочечников у женщин (Charmandari et al., 2014). Необходимы дальнейшие исследования с целью выявления связи между половым диморфизмом и пол-специфическими болезнями и может в конечном итоге привести к развитию пол-специфического лечения.

Недостаточность надпочечников проявляется, когда кора не может продуцировать адекватные уровни глюкокортикоидов, одновременно с или без дефицита минералкортикоидов и андрогенов. Addison's болезнь (аутоиммунный adrenalitis), редкое, но потенциально угрожающее жизни эндокринное нарушение, является наиболее распространенной причиной первичной недостаточности надпочечников и результатом двухсторонней деструкции коры надпочечников, приводящей к снижению продукции адренокортикоидных гормонов, включая cortisol, aldosterone и androgens (Charmandari et al., 2014). Др. причиной первичной недостаточности надпочечников является congenital adrenal hyperplasia (CAH) аутосомно рецессивное нарушение с общим показателем 1:15000 живорожденных во всем мире. Тяжесть болезни варьирует в пределах от легкой формы, которая может не определяться вплоть до половозрелости до угрожающему жизни состоянию с началом болезни при рождении или в раннем детстве. Болезнь возникает в результате мутаций в генах, кодирующих ферменты, которые необходимы для биосинтеза минералкортикоидов, глюкокортикоидов и половых стероидов (Fig. 1B) и это приводит к нарушению продукции стероидов (дефициту глюкокортикоидов и минералкортикоидов, гиперплазии коры надпочечников и к избыточной продукции андрогенов). Мутации в разных стероидогенных энзимах, а именно, в cytochrome P450 side chain cleavage (P450 SCC) энзиме, кодируемым CYP11A1 (cytochrome P450, family 11, subfamily A, member 1) геном, 11β-hydroxylase (кодируемой геном CYP11B1: cytochrome P450, family 11, subfamily B, member 1), 3β-hydroxysteroid dehydrogenase 2 (кодируемой геном HSD3B2 ), и дефицит 17-hydroxylase/17, 20-lyase (кодируемой геном CYP17A1 : cytochrome P450, family 17, subfamily A, member 1) были описаны. Тем не менее большинство случаев CAH (более 95%) обусловлено мутациями в гене CYP21A2, который кодирует 21-hydroxylase (21-OH) и превращает progesterone в 11-deoxy-corticosterone и 17-hydroxyprogesterone в 11-deoxycortisol. Тяжесть клинических проявлений коррелирует с тяжестью молекулярного дефекта. Классическая CAH характеризуется полной или неполной потерей активности 21-hydroxylase и проявляться как солончаковая пустошь (salt-wasting (SW)) (потеря натрия, обусловленная недостаточной продукцией aldosterone) или simple virilising (SV) CAH (вызываемая низким уровнем ACTH приводит к избыточной продукции DHEA зоной reticularis и к периферическому превращению DHEA в testosterone и dihydrotestosterone). У новорожденных девочек SW и SV формы CAH вызывают свойства маскулинизации (virilised) и могут характеризоваться неясной природы гениталиями. Не классическая CAH является менее тяжелой формой болезни, проявляющейся в поздний период жизни андрогенизацией женщин и не проявляется у мужчин. Сегодня известно более 30 др. физических и генетических причин первичной недостаточности надпочечников и их причины постепенно выясняются (Buonocore and Achermann, 2020).

Заместительная гормональная терапия у пациентов с недостаточностью адреналина единственно доступна для лечения и в большинстве случаев это продолжается в течение всей жизни. Использование синтетических глюкокортикоидов заменяет недостаток эндогенного кортизола и действует как негативная обратная связь на гипоталамус и гипофиз, чтобы подавлять секрецию CRH и ACTH, и тем самым снижать синтез гормонов коры надпочечников. Однако, неудобством обычной гормональной заместительной терапии является то, что она неспособна воспроизводить физиологический циркадный ритм секреции гормонов. Кроме того, доза и продолжительность воздействия могут приводить к нежелательным побочным эффектам. Супра-физиологические дозы применения экзогенных гормонов вызывают ряд побочных эффектов, от легкой сперессии hypothalamic-pituitary оси до угрожающих жизни инфекций. Долговременная терапия низкими и умеренными дозами могут вызывать осложнения, такие как ожирение, дермальная атрофия, устойчивость к инсулину, гипертензия и костные потери (Turcu and Auchus, 2016). Хотя, недавние успехи, сконцентрированные на разработке новых систем доставки глюкокортикоидов, которые смогут лучше воспроизводить свои физиологические уровни или на non-glucocorticoid терапевтических альтернативах (Turcu and Auchus, 2016), ведение надпочечниковой недостаточности остается проблемой.

Базирующаяся на генах и клетках терапия нацелена на создание волны новых потенциально революционных способов воздействия при многих болезнях, при этом проводятся сотни современных клинических испытаний по тестированию пригодности и клинической эффективности таких подходов. На данный момент нет клинических испытаний с использованием базирующихся на генах или клетках протоколов при болезных надпочечников, однако, разрабатываются инструменты для их осуществления и систем доставки для генотерапии или репрогаммирования по генерации функциональных адренокортикальных клеток ведутся постоянно.

Нарушения надпочечников, вызываемые дефектами одиночных генов являются наиболее подходящими для осуществления генотерапии. Сюда входят CAH, а также редкие Familial Glucocorticoid Deficiency (FDG), чья генетическая причина известна приблизительно для 67% случаев и включает мутации в Melanocortin Receptor Type 2 (MC2R), взаимодействующий с ним партнер Melanocortin Receptor Associated Protein (MRAP1), Nicotinamide Nucleotide Transhydrogenase (NNT), Steroidogenic Acute Regulatory Protein (StAR) и др. (Fig. 1B) (Maharaj et al., 2019). Доступны животные модели, аккуратно фенокопирующие болезни человека, которые позволяют исследователям тестировать подходы по генной доставке и соотв. измерять восстановление стероидогенеза, Table 1. В 1988, Gotoh et. идентифицировали линию мышей (обозначенную H-2W18) с делецией приблизительно в 80 kilobases в H-2 class III регионе хромосомы 17 и соответствующему Cyp21a1 и complement 4 component генам (Gotoh et al., 1988; Riepe et al., 2005). Эти мыши гомозиготны по мутации и у них отсутствует активность 21-OH и поэтому они неспособны катализировать превращение progesterone в deoxycorticosterone, в результате у них возникает неспособность секретировать corticosterone, главный биоактивный глюкокортикоид у мышей. Интересно, что гистологический анализ надпочечниковых желез таких мышей выявляет разрушение адренокортикальной структуры (zonation), при этом надпочечники обнаруживают неправильные очертания, полную дегенерацию всех слоёв и слитое расположение каждого типа клеток с клетками ZF, с увеличенными клетками и повышенным из числом. Более того, гомозиготность прямо коррелирует с перинатальной гибелью, при этом мыши умирают в первые 15 дней (Gotoh et al., 1988). Позднее та же самая группа оказалась способной генерировать трансгенных мышей путем введения фрагмента ДНК в 6.6-kb, содержащего ген Cyp21 в пронуклеус эмбриона. Впоследствии трансген вносили в геном мутантных мышей путем спаривания; трансген оказался способен восстанавливать H-2W18 гомозиготы, при этом мыши, оставались живыми более одного года. Важно, что zonation коры надпочечников восстанавливалась и была сходна с таковой у мышей дикого типа, а в сыворотке progesterone падал до нормального уровня, делая эту линию прекрасной моделью для тестирования вмешательств с целью лечения CAH (Gotoh et al., 1994). Последующие попытки восстановить дефицит ферментов в надпочечниках в основном базировались на использовании обеспечиваемого вирусами переноса генов (Fig. 2). В 1999, Tajima et al. инъецировали аденовирусный вектор, кодирующий человеческий CYP21A2 в надпочечниках 21-OH-дефицитных мышей. Результаты показали, что экспрессия человеческой CYP21A2 мРНК в коре надпочечников и medulla обнаруживает наивысшую экспрессию в первую неделю и всё ещё обнаруживается после 14 дней. Progesterone превращался в deoxycorticosterone и в corticosterone спустя 2-7 дня после инъекции до уровней, сходных с таковыми в надпочечниках мышей дикого типа и это продолжалось в течение 40 дней. Кроме того, достоверное улучшение наблюдалось в ультраструктуре надпочечников, на это указывали нормальные размеры митохондрий и гистологически нормальные glomerulosa и fasciculata клетки (Tajima et al., 1999). Хотя эффект длился ограниченное количество дней, это исследование показало, что рекомбинантны аденовирусные векторы могут быть использованы в качестве векторов доставки, чтобы корректировать дефицит стероидогенных энзимов путем введения непосредственно в надпочечники.

Table 1.

Gene-therapy approaches in animal models of 21-OH deficiency.

Fig. 2. Schematic representation of tested (A) and potentially more effective (B) strategies for gene or genome editing tools delivery into the adrenal cortex. In vivo genome editing has not yet been attempted in the adrenal. A: When mature steroidogenic cells are efficiently transduced by a delivery vector, restoration of adrenal function is likely to be transient: as adrenocortical self-renewal proceeds, transgene-free cells will eventually replace previously transduced cells, resulting in the restoration of the clinical phenotype (i.e. see (Markmann et al., 2018). B: A more long-lasting curative option would involve correction of the genetic defect in adrenocortical stem progenitor cells. The percentage of transduced cells needed to achieve clinically relevant results will need to be determined empirically.

Первичные фибробласты, трансдуцирующие мышиный ген Cyp21a1, были использованы с ретровирусным вектором, их вносили в подкожные ткани 21-OH-дефицитных мышей: эта процедура приводила к снижению соотношения сывороточного progesterone к deoxycorticosterone у 4-х из 6 животных спустя 4 недели после аутотрансплантации. Согласно авт. потенциал лечения был также ограничен протоколом воздействия, возможно из-за недостаточного количества инфицированных фибробластов или титра вирусного вектора. В параллельной попытке, Cyp21a1-содержащий serotype-2 adeno-associated virus (AAV) вектор инъецировался непосредственно в бедренную мышцу, снова в результате наблюдали достоверное снижение соотношения сывороточного progesterone к deoxycorticosterone, в то же время у 100% обработанных мышей соотношение оставалось довольно низким спустя 7 мес. после инъекции. Несмотря на такой небольшой размер выборки, эта работа показала впервые, что введение помимо надпочечников улучшало активность при 21-OH системный стероидный метаболизм у CAH мышей и показала, что менее инвазивные методы генной индукции также возможны (Naiki et al., 2016). Др. выдающимся результатом стало, описанное Perdomini et al. использование AAV serotype rh10 (AAVrh10), носителя уже использовавшегося в испытаниях генотерапии у людей. Внутривенные инъекции AAVrh10, несущего человеческий ген CYP21A2, взрослым дефицитным по 21-OH мышам приводило к экспрессии 21-OH и к почти нормальной экспрессии ключевых генов (Mc2r, Prkar2a, Sf-1, Star, Cyp17a1 и Cyp11b2) в коре надпочечников. Важно, что результаты также показали почти полную нормализацию ранее повышенной продукции progesterone, указывая на крупное и устойчивое восстановление 21-hydroxylation активности, которая всё ещё функционировала спустя 15 недель (Perdomini et al., 2017).

Недавно представлен более детальный анализ наблюдаемой кратковременной эффективности доставки CYP21A2 в адренокортикальные клетки. Одиночное внутривенное введение AAV-rh10, несущего человеческий ген CYP21A2, у 21-OH-дефицитных мышей оказалось способным нормализовать уровни как progesterone , так и ACTH между 2 и 8 неделями после инъекции, но они оба снова оказались повышенными до исходного уровня спустя 32 недели. Интересно, что иммуногистохим. анализ гемагглютининовых меток, связанных с C-концом 21-OH, выявил строгую экспрессию трансгена в ZF и X-зоне, но не выявил экспрессии в ZG и капсулярных клетках. Более того, когда авт. анализировали трансдуцированные клетки спустя определенное время, то они обнаружили, что снижение экспрессии трансгена активно происходит между 6 и 16 неделями после применения, при этом наблюдается почти полное отсутствие трансдуцированных клеток к 32 неделям (Markmann et al., 2018). Авт. полагают, что, скорее всего, причина заключается в преходящей эффективности такого подхода, связанной с биологией коры надпочечников и в продолжающемся самообновлении. Было подтверждено, что при внесении трансгена капсула и ZG содержат, по крайней мере, две взаимопроникающие популяции адренокортикальных стволовых клеток и клеток предшественников и если эти клетки трансдуцированы не эффективно, то со временем они будут генерировать новые зрелые и не трансдуцированные стероидогенные клетки (лишенные трансгена), которые будут замещать за счет centripetal миграции устаревшие функциональные клетки (трансдуцированные) ZF клетки, приводя к восстановлению CAH фенотипа (Fig. 2A). Авт. полагают, что поскольку эти специфические AAV серотипа векторы были эффективны в течение короткого времени, то они будут пригодны и для продолжительной генетической модификации коры надпочечников. Следовательно, необходимы подтипы AAV, способные в большей степени трансдуцировать адренокортикальные стволовые клетки и клетки предшественники (Fig. 2B); однако, существование AAVs, обладающих подобным тропизмом пока не обнаружено экспериментально и могут быть необходимы др. методы доставки (Al-Dosari and Gao, 2009).

Альтернативной стратегией доставки полной длины открытой рамки считывания станет использование инструментов редактирования генов в адренокортикальных стволовых клетках, это позволит осуществлять целенаправленную коррекцию дефектов генов как стволовых клеток , так и их стероидогенного потомства (Fig. 2). Подход с редактирование генов был успешно применен на мышиных моделях мышечной дистрофии (Long et al., 2016; Nelson et al., 2016; Tabebordbar et al., 2016). Кроме того, использование двойной системы, при которой AAV серотипа 8 вектор, экспрессирующий Cas9 нуклеазу, и второй, экспрессирующий guide RNA и донорскую репаративную ДНК матрицу, Yang et al. оказались способны корректировать точечные мутации в гене ornithine transcarbamylase в печени новорожденных модельных мышей с метаболическими нарушениями печени. Эта работа показала, что коррекция генов может быть достигнута в регенерирующей ткани (Yang et al., 2016). Вполне возможно, что эта стратегия будет работать и при CAH при точковых мутациях причинных генов, на этом пути возможны препятствия, когда современная технология будет сталкиваться с комплексом CYP21A2 гена и CYP21A1 псевдогенными геномными перестройками, которые часто вызывают CAH, и поэтому введение дикого типа CYP21A2 может оказаться предпочтительным в таком случае. Др. узким местом могут быть генотерапевтические подходы, нацеленные на разные органы; сюда входят потенциальная онкогенность, интегрирующихся в хроматин векторов (ретровирусов и лентивирусов), малая ёмкость упаковки и высокая иммунная реакция хозяина на AAVs, короткая продолжительность экспрессии аденовирусов (Thomas et al., 2003). Наконец, не вирусные базирующиеся на плазмидах системы доставки генов могут представлять собой альтернативные подходы генотерапии, т.к. они могут применяться повторно, обладают низкой токсичностью и иммуногенностью и разрабатываются новые пути улучшения ядерного переноса (Al-Dosari and Gao, 2009).

В конечном итоге коррекция гена в стволовых клетках и клетках предшественниках станет идеальным способом непрерывной продукции физиологических уровней стероидов в течение всей жизни (Fig. 2).

В последние годы базирующееся на клетках лечение обнаружило огромный терапевтический потенциал на преклинических модельных животных разных состояний, предлагающий уникальный инструмент для репарации или замещения поврежденной ткани или клеток, при этом конечной целью является регенерация или восстановление нормальной функции. В эндокринологии всего мира делались попытки проведения первых клинических испытаний с использованием Embryonic Stem Cells (ESCs) и induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs), происходящих из эндокринной части поджелудочной железы с целью лечения type-I диабета (Chen et al., 2020). Важно, что использование стратегии базирующейся на клетках терапии, чтобы генерировать функциональную аденокортикальную ткань оказалось приемлемой альтернативой для терапии недостаточности надпочечников, независимо от причины и это могло наделять ткань надпочечников способностью реагировать на стимулы физиологическим способом.

Хотя разработка стратегий клеточной терапии для надпочечников всё ещё запаздывает по сравнению с др. медицинскими областями, важно учитывать те немногие полученные достоверные результаты.

Table 2.

Cell-based approaches for adrenal insufficiency.

Fig. 3. Schematic representation of potential cell-based approached to be tested for adrenal disease. Single cells obtained from either human or animal adrenals (A) could be implanted using a semipermeable and immune-isolating encapsulation device (B). If isolation of adrenocortical stem cells is needed, then an extra step involving FAC-sorting isolation is necessary. However, in order to do so, a marker with exclusive expression in stem cells needs to be identified; the Notch atypical ligand Delta-like 1 (Dlk1) might be one candidate as it is expressed in Shh/Sf-1-positive subcapsular cells in the rat (Guasti et al., 2013) and in partially undifferentiated cells in humans (Hadjidemetriou et al., 2019). Isolated adrenocortical stem cells could also be employed to generate organoids and the latter used as transplantation material (F). Alternative sources of adrenocortical cells are represented as ES-derived (C) and somatic-derived (D) cells which undergo differentiation and/or reprogramming. A gene-repairing step (E) is necessary in case somatic cells are isolated from patients bearing the adrenal disease-causing germline mutation.

Протоколы выделения (а также ограниченной амплификации) адренокортикальных клеток перед алло- или ксено-трансплантацией известны (Fig. 3A). Использованы разные стратегии, типы клеток и животные модели (Table 2), с основным вниманием не только эффективности трансплантируемых клеток, но и также долговременной безопасности этих процедур. Thomas et al. выделили адренокортикальные клетки телят с помощью ферментативной и механической дисперсии коры надпочечника. Затем поликрбонатный цилиндр помещали позади почечной капсулы мышам с severe combined immunodeficiency (scid) и заполняли смесью телячьих аденокортикоидных клеток с не пролифелирующими 3T3 клетками, которые секретируют FGF (чтобы усилить васкуляризацию). Трансплантированные телячьи клетки развиваются в ткань, похожую на надпочечники, способную замещать важные функции надпочечников животных, на что указывает продукция стабильных уровней cortisol (Thomas et al., 1997; Thomas and Hornsby, 1999). Наконец, та же самая группа адаптировала свой протокол к аденокортикальным клеткам человека, изолированным из ZF. Клетки культивировали в течение 5-7 дней перед трансплантацией scid мышам. Спустя 50 дней после трансплантации, гистологический и иммуногистохимический анализ показали, что получаемая ткань обладает свойствами нормальной коры надпочечников и что cortisol присутствует в плазме животных, вследствии воздействия ACTH. Это показывает, что человеческие кортикальные клетки могут служить функциональным замещением функции надпочечников хозяев (Thomas et al., 2002). Приведенное выше исследование побудило к дальнейшим работам с целью оптимизации процедур трансплантации клеток надпочечников (Fig. 3B). Напр., использование поддерживающего материала, который воспроизводит внеклеточный матрикс (ECM) коры надпочечников, чтобы облегчить трансплантацию клеток и предоставить каркас трансплантируемым клеткам, всё это было тестировано разными группами. Popnikolov and Hornsby внедряли или человеческие или телячьи нормальные адренокортикальные клетки в матрикс type I коллагена, перед подкожной трансплантацией этих клеток scid мышам. Группа сообщила о формировании узелков с инвазией вновь сформированной васкулатуры и областей с характерным гистологическим видом коры надпочечников (т.e. тяже-подобных структур, типичных для ZF). Кроме того, кортизол обнаруживался в плазме трансплантированных мышей (Popnikolov and Hornsby, 1999). Dunn et al. культивировали диссоциированные клетки надпочечников от новорожденных мышей на полученном от телят коллагеновой губке перед трансплантацией в почечную капсулу взрослых мышей. Анализ мРНК имплантов показал экспрессию специфичных для надпочечников маркеров (Sf-1, Dax1, Star, Cyp11a, Cyp11b1 и Cyp21a2) вплоть до 8 недель после трансплантации (Dunn et al., 2004). Впоследствии использование этой техники позволило достичь 100% выживаемости мышей, подвергшихся двухсторонней эктомии надпочечников. Более того, уровень в плазме corticosterone у таких мышей был сходен с таковым контрольных мышей, а анализ отторгнутых имплантов показал наличие жизнеспособных клеток и экспрессию аденокортикальных генов, хотя не наблюдалось соотв. железистой формации (Zupekan and Dunn, 2011). Децеллюляризованные надпочечники свиней использовали в качестве ECM поддержки для клеток надпочечников плодов человека: анализ in vitro поведения клеток показал, что клетки были способны прикрепляться к каркасу надпочечников, пролиферировать и продуцировать кортизол до уровня, сравнимого с литературными значениями для нативной ткани (Allen et al., 2010). Более недавнее исследование использовало биологические искусственные, полученные из первичной культуры телячьих адренокортикальных клеток надпочечников, инкапсулированных в alginate матрикс для трансплантации иммунокомпетентным крысам после удаления надпочечников. Преимуществом использования alginates стало то, что они, как было установлено, снижают риск иммунологической реакции хозяина и поэтому являли собой многообещающую поддержку структуры, подходящей для трансплантации ксено-генетических клеток; также они предлагали 3D окружение, которое облегчало межклеточные взаимодействия. Трансплантаты из инкапсулированных телячьих адренокортикальных клеток не только предупреждали при двухсторонней эктомией надпочечников индуцированную гибель, но и восстанавливали уровни глюкокортикоидов с продукцией кортизола на более высоких уровнях по сравнению с трансплантацией только свободных клеток и были высоко васкуляризованы (Balyura et al., 2015).

Очищенные ZG и ZF клетки получали из надпочечников крыс с помощью разделения перемежающимся градиентом плотности и использовали стартовый материал для трансплантации под капсулу почек у adrenalectomized крыс или немедленно или после некоторого культивирования. Наблюдали, что после 30 дней трансплантированные ZG, но не ZF клетки были способны формировать тканевую структуру, гистологически напоминающую ZG и продуцирующую aldosterone и corticosterone, делая их более чувствительными к адренокортикальным трансплантациям (Teebken and Scheumann, 2000). Принимая во внимание присутствие пула клеток адренокортикальных предшественников в ZG крыс, но не в ZF (Mariniello et al., 2019), и способность ZG клеток трансдифференцироваться в ZF клетки (Freedman et al., 2013), то, скорее всего, эти субпопуляции ZG клеток и ответственны за успешную регенерацию и дифференцировку трансплантированных клеток. В др. исследовании предпринята попытка изолировать мышиные адренокортикоидные клетки предшественники из дифференцированных клеток, исходя из дифференциальной способности Nile red, который взаимодействует с цитоплазматическим хранилищем холестерина (высоким в дифференцированных и низким или нулевым в недифференцированных клетках). Идентифицированы две группы клеток, светло-окрашенные клетки (с низким сродством к Nile red), которые экспрессируют Sf-1 mRNA мРНК в сравнимых количествах с более ярко окрашенными клетками (с более сильным сродством к Nile red), но с достоверно более низкими уровнями мРНК Cyp11b1, Cyp11b2 и Cyp11a1. Будучи имплантированными мышам светло-окрашенные клетки были способны давать клетки, которые экспрессируют zonal-специфические гены коры надпочечников, в противоположность более ярко окрашенным клеткам, которые теряют экспрессию стероидогенных энзимов и потенциал своей пролиферации. Авт. полагают, что светло окрашенные клетки обогащены клетками адренокортикальных предшественников и поэтому способны давать стероидогенные клетки (Dunn et al., 2009), что подтверждается самообновлением надпочечников (Mariniello et al., 2019).

Дальнейшие эксперименты обнаружат способы усиления эффективности клеточных трансплантаций. In vitro экспансия клонов иммортализованных клеток с помощью human telomerase reverse transcriptase (hTERT), как было установлено, формирует васкуляризованные тканевые структуры, которые будучи трансплантированными под капсулу почек оказывались способными замещать функцию надпочечников у животных. Важно, что hTERT-модифицированные клетки не обнаруживают тенденции к неопластическим изменениям (Thomas et al., 2002a, Thomas et al., 2002b) (reviewed in (Huang et al., 2007).

Стволовые клетки обладают способностью к самообновлению и могут дифференцироваться в специфические типы клеток, что делает их идеальными кандидатами для регенеративной медицины и для клинического использования. Кроме того, открытие, что зрелые полностью дифференцированные клетки могут быть репрограммированы и трансформированы в разные типы клеток является замечательным прорывом и предоставляет уникальный источник клеток для аутологической клеточной заместительной терапии. В 2006, Yamanaka продемонстрировал, что клетки мыши могут быть преобразованы, чтобы возвратить их обратно в в похожее на эмбриональное плюрипотентное состояние (iPSCs) с помощью экспрессии генов, кодирующих 4 транскрипционных фактора (Takahashi and Yamanaka, 2006). При правильных условиях, iPSCs могут дифференцироваться в разные функциональные типы клеток. С того момента первого открытия Yamanaka's iPSCs были получены из широкого круга мышиных и человеческих стволовых клеток. Альтернативная стратегия, наз. 'direct lineage conversion', а именно, генерация желательного типа клеток путем прямого превращения клеточных судеб между двумя полностью дифференцированными соматическими клетками без прохождения через промежуточное плюрипотентное состояние. этот подход обычно используется или с помощью индукции эпигенетических изменений или форсированной экспрессии транскрипционных факторов, ассоциированных с данным клоном (Vierbuchen and Wernig, 2011).

Теоретически стволовые клетки и iPSCs могут представлять собой инструмент для генерации любого типа клеток и в нескольких исследованиях было продемонстрирована возможность генерации клеток со стероидогенными свойствами адренокортикоидных клеток (rev. Ruiz-Babot et al., 2015). Однако, надежный протокол получения долго живущих и функциональных адренокортикальных клеток из ESCs и IPSCs пока не разработан (Fig. 3C-E).

Устойчивая экспрессия SF-1 в мышиных ESCs оказалась достаточной для изменения морфологии в направлении стероидогенного фенотипа, при этом все SF-1-трансфицированные колонии растут в виде плоских, phase-dull слоев индивидуально распознаваемых клеток в виде противоположных двупреломляющих сфер, обычно не дифференцированных mESCs. Более того, после индукции с помощью cAMP и all-trans-retinoic acid, клетки стабильно экспрессируют SF-1, но не нативные mESCs, экспрессирующие P450Scc мРНК и продуцирующие and produce progesterone (Crawford et al., 1997). Эта линия экспериментов была улучшена в последние годы Yazawa et al. , которые оказались способны дифференцировать mESCs в клон мезенхимных клеток путем культивирования клеток на покрытых collagen IV чашках и путем пульсового воздействия ретиноевой кислоты; впоследствии форсированная экспрессия SF-1 приводила к экспрессии разных связанных со стероидогенезом, генов и секреции кортикостерона, подобно тому как это происходит в адренокортикальных клетках (Yazawa et al., 2011). Сходный подход был успешно использован для дифференцировки человеческих ESCs в мезенхимные клетки (в то время использовали ингибитор glycogen synthase kinase-3 β), и затем в клетки, продуцирующие гормоны после экспрессии SF-1 и воздействия cAMP (Sonoyama et al., 2012). Gondo et al. продемонстрировали, что первичные долговременно культивируемые стволовые клетки костного мозга мышей (BMCs), инфицированные аденовирусной конструкцией, содержащей телячьи SF-1, экспрессирующие стероидогенные гены и продуцирующие достоверные количества стероидов (хотя Cyp11b2 и aldosterone не были обнаружены). Несотря на это пройфиль стероидов обнаруживал смешанный паттерн надпочечникового и гонадного стероидогенеза. Интересно, что экспрессия стероидогенных генов и гормонов повышалась с помощью ACTH (Gondo et al., 2004). Затем с помощью сходного протокола авт. расширили свою работу на мезенхимные клетки (AMCs), происходящие из жировой ткани. Усиленная экспрессия SF-1 трансформированных AMCs в ACTH-чувствительные стероидогенные клетки, способные продуцировать надпочечниковый стероидный кортикостерон скорее, чем тестостерон, как противостоящий BMCs. Критически, воздействие all-trans ретиноевой кислоты усиливало сдвиг в направлении надпочечникового типа стероидного профиля в AMCs в противовес гонадному типу строидного профиля в BMCs, демонстрируя тем самым, что происхождение клеток и культуральные условия являются важными факторами в предопределении фенотипа репрограммируемых клеток (Gondo et al., 2008). В то же самое время, Yazawa et al. достигли положительных результатов, используя мезенхимные стволовые клетки (MSCs) человеческого происхождения; в их исследовании стабильная экспрессия SF-1 приводила к усилению активности большинства стероидогенных энзимов и к продукции как надпочечниковых, так и гонадных стероидов после воздействия cAMP (Yazawa et al., 2006). Позднее избыточная ретровирусная экспрессия liver receptor homolog-1 (LRH-1), др. члена семейства ядерных рецепторов NR5A и экспрессирующегося на высоком уровне в гонадах людей, индуцировала дифференцировку человеческих MSCs в стероидогенные клетки, предоставляя тем самым возможную альтернативу достижения стероидогенной дифференцировки (Yazawa et al., 2009). Совсем недавно, SF-1-индуцированные стероидогенные клетки, происходящие из мышиных MSCs из жировой ткани, обнаруживали повышение базового уровня в плазме corticosterone и увеличение выживаемости мышей с двухсторонним удалением надпочечников (Tanaka et al., 2020).

Репрограммирование из umbilical cord blood mesenchymal stem cells (UCB-MSCs) и из umbilical cord Wharton's jelly-derived MSC (UC-MSCs) также было успешным. В 2010, Yazawa et al. показали, что UCB-MSCs также могут быть использованы для генерации стероидогенных клеток посредством обеспечиваемой ретровирусами трансфекции SF-1, но такие клетки обладают заметно отличающимся стероидогенным профилем (т.к. паттерн секреции стероидных гормонов сходен с происходящими из granulosa luteal клетками) по сравнению с таковым, происходящим из BM-MSCs (Yazawa et al., 2010). В др. исследовании проведено сравнение аденовирусами обусловленной SF-1 стероидогенной индукции между UC-MSCs и BM-MSCs; при этом UC-MSCs, считавшиеся более чувствительными к репрограммированию, после дифференцировки обнаруживали больший пролиферативный потенциал и достоверно более высокую экспрессию всех протестированных стероидогенных мРНК (Wei et al., 2012).

Использование iPSCs для генерации стероидогенных клеток, подобных надпочечниковым, было пропущено по сравнению с использованием др. клеточных субстратов лишь с очень немногими, хотя и многообещающими, доступными исследованиями. В 2012, с помощью многошагового метода, Sonoyama et al. получили стероиды продуцирующие клетки из фибробластов кожи человека. Впервые, человеческие iPSCs клетки были получены путем внесения 4-х транскрипционных факторов (Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc) в фибробласты кожи человека. Впоследствии, iPSCs заставили дифференцироваться в клетки мезодермального клона в присутствии ингибитора 6-bromoindirubin-3'-oxime, a glycogen synthase kinase-3 β , это приводило к активации пути передачи сигналов Wnt. В конечном итоге, форсированная экспрессия SF-1 в этих мезодермальных клетках с добавлением 8-Br-cAMP привела к генерации клеток, которые экспрессировали мРНК CYP21A1, CYP11B1, StAR, CYP11A1, HSD3B и CYP17A1 и секретировали cortisol (Sonoyama et al., 2012).

Недавно мы оказались способны продемонстрировать, что клетки крови, кожи и мочи могут быть перепрограммированы в человеческие индуцированные стероидогенные клетки (hiSCs); это достигалось посредством стабильной экспрессии SF-1 (доставляемого с помощью лентивирусов), активации пути protein kinase A (PKA) и в присутствии luteinizing-hormone-releasing hormone (LHRH) (Ruiz-Babot et al., 2018). Полученные клетки экспрессируют стероидогенные энзимы и секретируют cortisol зависимым от стимулов способом; кроме того, эксперименты in vivo продемонстрировали жизнеспособность таких клеток после трансплантации в надпочечники и под капсулу почек у мышей. Др. важной находкой стало то, что профиль стероидов в hiSCs, полученные из клеток мочи от пациентов с CAH, вызванной мутациями CYP21A2 , обнаруживал накопление метаболитов, расположенных выше энзима 21-OH, и снижение этих нижестоящих метаболитов по сравнению со здоровым контролем; важно, что восстановление нормального стероидогенеза может быть достигнуто путем экспрессии версии дикого типа дефектного энзима (Ruiz-Babot et al., 2018). Этот результат особенно важен, т.к. предоставляют доказательства, что hiSCs могут представлять собой точку старта для становления новой экспериментальной модели CAH и могут проложить путь для разработки нового нацеленного на пациентов лечения.

Несмотря на успехи, представленные выше, (суммированы в Table 2), некоторые аспекты следует предусмотреть прежде, чем подобные подходы будут перенесены в клинику, такие как разработка наиболее пригодного протокола для генерации клеток, подобных адренокортикальным, с долговременной функцией до тех пор, пока поддерживается способность к самообновлению, большинство подходящих типов и источников клеток субстратов может быть репрограммировано и возможно с использованием иммуносупрессии, и использовано в случае не аутологичных клеток. Более того, одновременно не происходит генерация клеток даже с частичным гонадным фенотипом; поскольку SF-1 является ключевым транскрипционным фактором, участвующим в развитии как надпочечников, так и гонад, то пошаговое приближение к получению адренокортикальных клеток без усиления экспрессии какого-либо транскрипционного фактора, станет очень ценным прорывом в этой области.