Алкаптонурия (AKU) редкое генетическое нарушение с высоким уровнем циркуляции Homogentisic Acid (HGA) (Masoud et al., 2017; Hakim et al., 2018; and Nickavar and Azar, 2018), в моче (Griffin et al., 2018), крови и тканях (Gupta et al., 2017). Наследование AKU следует аутосомно рецессивному правилу. Однако, аутосомно доминантные способ наблюдается в семьях с AKU в редких случаях (Rana et al., 2015). AKU является первой болезнью, которая соответствовала правилу расхождения. Мутации в гене HGD вызывают это нарушение ((Genetics Home Reference, 2019a; and Nelwan, 2013). AKU затрагивает приблизительно одного на 100,000 - 250,000 (Masoud et al., 2017) одного на 200,000 - 1,000,000 живорожденных (Couto et al., 2018). Др. названиями AKU являются alcaptonuria, HGA oxidase deficiency и homogentisic aciduria (Genetics Home Reference, 2019b). Martin L. Nelwan / Afr.J.Bio.Sc. 3(1) (2021) 19-33 Page 20 из 33 симптомов AKU включают артропатию крупных суставов, кальцификацию хрящевой ткани с темной окраской, испорченность сердечных клапанов (Gupta et al., 2017; Karaoрlu et al., 2016; and Nelwan, 2013), и пигментация ушей,склер (Rana et al., 2015), глаз и кожи (Atalay et al., 2015). Не существует определённого лечения AKU (Gupta et al., 2017; Karaoglu et al., 2016; and Nelwan, 2013). Может быть использован витамин C. Однако, было установлено, что витамин C не эффективен по ряду причин и рисковано его применение при AKU (AKU Society, 2019). Rana et al. полагают, что процедуры, такие как хирургия суставов и трансплантации органов могут быть рекомендованы пациентам с AKU (Rana et al., 2015). Хирургические вмешательства на суставах облегчают симптомы AKU. Трансплантации органов, особенно трансплантации печени, как известно, успешны. Современные тенденции, такие как генетическое консультирование, nitisinone, и техники генетических манипуляций обладают потенциалом устранения AKU. Генетические консультации важны советами пациентам и их семьям и снижают частоту возникновения AKU среди людей. Если два носителя с отсутствием болезни AKU в анамнезе вступают в брак, то у низ могут появиться дети с AKU. Частота их появления ниже, чем в семьях с болезнью в анамнезе. Nitisinone может быть пригоден для лечения этого нарушения (Alajoulin et al., 2015; Hakim et al., 2018; Nickavar et al., 2018; and Rathore et al., 2016). Польза от nitisinone для AKU пациентов пока оценивается. Имеются исследования относительно лечения AKU nitisinone у людей. Nitisinone подавляет 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, a triketone (Phornphutkulet al., 2002). Он может быть полезным для лечения AKU. Nitisinone снижает циркуляцию в крови HGA (Milan et al., 2019; and Nelwan, 2013). Однако, nitisinone пока не лицензирован для использования у AKU пациентов. Техники генетических манипуляций могут быть потенциальными инструментами для лечения AKU в будущем (India AKU Society). Идея техник генетических манипуляций и использования End-Joining Homology Techniques (EJHTs), FokI-dCas9, induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs), и доставка с помощью вирусов, таких как Adeno-Associated Viruses (AAV) и HSV-1 для лечения AKU. Напр., Pan et al. полагают, что FokI-dCas9 может корректировать основной вариант гена при PAH. Предполагается. что этот инструмент может быть пригоден для коррекции неправильной последовательности при др. наследственных метаболических нарушениях (Pan et al., 2016) такие как AKU. Это означает, что техники генетических манипуляций могут быть пригодными инструментами для лечения и AKU. Техники генетических манипуляций могут вызывать риск онкогенетических трансформаций в геноме хозяина. Напр., реактивация c-Myc ретровирусов усиливает туморогенность у химер. По этим причинам был исследован широкий спектр методов доставки; безопасности интегрирующихся AAV векторов в не интегрирующиеся векторы, такие как вирус Sendai. Кроме того, были разработаны не вирусные и эписомные репрограммирующие подходы. Напр., Kamath et al разработали iPSCs, лишенные вирусов, лишенные Myc и лишенные Lin28 (Nelwan, 2017b). Было предположено, что техники генетических манипуляций являются безопасными инструментами для лечения метаболических нарушений, таких как AKU. В этом исследовании авт. описывают прогресс в исследованиях AKU, фокусируясь на генетических аспектах и лечении AKU. Генетические аспекты выключают ген HGD, мутации в HGD и лечение.

3.1. Genes in alkaptonuria HGD is the gene formal symbol. Other names of the HGD gene consists of AKU, HGD_HUMAN, HGO, homogentisate 1,2-dioxygenase (homogentisate oxidase), HGA oxidase, and homogentisicase (Genetics Home Reference, 2019a). Ген HGD состоит из 14 экзонов и кодирует полипептид длиной в 445 аминокислот с высокой гомологией с Aspergillus hmgA (OMIM #60747) (Fernandez et al., 1996). Это ген располагается в хромосоме 3q и картируется, 3q13.33 (OMIM #60747) (Groz, 2014). Ген HGD содержит 120,628,168 - 120,682,571 пар оснований (Genetics Home Reference, 2019a; and NCBI Gene). Ген предоставляет инструкции для продукции HGD фермента. Фермент участвует в катаболизме фенилаланина и тирозина. HGD фермент превращает HGA в maleyacetoacetic кислоту во время катаболизма фенилаланина и тирозина (Genetics Home Reference, 2019b; Hakim et al., 2018; and Rana et al., 2015). Гены служат в качестве инструкций по конструкции молекул белков и составляют ДНК. Мутации могут возникать в гене; в виде устойчивого изменения ДНК. Генные мутации приводщят к повреждениям белка. Генетическое нарушение является состоянием, вызываемым мутациями, по крайней мере, в одном гене (Nelwan, 2017a) как при Friedreich ataxia и AKU. Selvakumar et al. сообщили, что существует более 80 мутаций в гене HGD у пациентов с AKU (Selvakumar et al., 2018). Большинство из этих мутаций изменяют одиночную аминокислоту, используемую для создания HGD фермента. Замена аминокислоты valine на Met368Val в Table 1: Martin L. Nelwan / Afr.J.Bio.Sc. 3(1) (2021) 19-33 Page

<

23 из 33 наиболее распространенных генных мутаций HGD присутствуют в Европейских популяциях (Genetics Home Reference, 2019a). Мутации в гене HGD могут включать дупликации (NCBI ClinVar), missense (Beltran-Valero de Bernabe, 1998; and NCBI ClinVar) и мутации в 54,363 пн гена (Rana et al., 2015), сдвиг рамки считывания (Beltran-Valero de Bernabe, 1998; and NCBI ClinVar), интронные (Beltran-Valero de Bernabe, 1998), nonsense (NCBI ClinVar) и мутации слайс-сайтов (Beltran-Valero de Bernabe, 1998; and NCBI ClinVar) (Table 1). Эти мутационные повреждения HGD фермента играют роль в повреждении аминокислот фенилаланина и тирозина (Genetics Home Reference, 2019b).

Table 2: Alkaptonuria in humans Martin L. Nelwan / Afr.J.Bio.Sc. 3(1) (2021) Page 19-33

24 из 33

3.2. Alkaptonuria в мире описывается как AKU и встречается с частотой один на 250,000 - 1,000,000 родов (Genetics Home Reference, 2019b). Однако, AKU обнаруживает высокую распространенность в Китае (Bhattar et al., 2015), Доминиканской республике, Иордании и частично на юге Индии (Nelwan, 2013), Сингапуре (Bhattar et al., 2015), Slovakia (Nelwan, 2013), and Thailand (Bhattar et al., 2015). В Словакии, распространенность составляет один на 19,000 (Genetics Home Reference, 2019b; and Nelwan, 2013). Причина широкого распространения в China, Jordan, the Dominican Republic, India, Singapore и Thailand неизвестна. И мужчины и женщины имеют одинаковые шансы унаследовать AKU (Table 2). В этом систематическом обзоре, из 30 описанных случаев, 15 (50%) были взрослыми мужчинами, 13 (43.33%) были взрослыми женщинами, 1 (3.33%) мальчик и 1 (3.33%) девочка. Из этих 30 описанных случаев AKU, 16 (53.33%) были мужчинами и 14 (46.67%) женщинами. По возрасту они отличались недостоверно (Table 2). Авт. не нашел каких-либо ссылок на распространенность AKU с аутосомно доминантным наследованием. Phornphutkul et al. описали 58 пациентов с AKU 4-х в возрасте 80 лет (MIM #203500) (Phornphutkul, 2002). Авт. установили, что замена суставов производилась в среднем в возрасте 55 лет , а формирование почечных камней в 64 года. Кроме того, участие сердечных клапанов отмечалось в 54 года, а кальцификация коронарных сосудов в 59 лет. Анализ линейной регрессии показал, что радиографический показатель тяжести AKU обнаруживает возрастание после 30 лет. У мужчин увеличение более быстрое, чем у женщин. Phornphutkul et al. установили, что камни в почках появились у 13 мужчин и трех женщин. Из 27 мужчин в возрасте 31 - 36 лет, 8 имели камни в простате. Образование камней в простате не было связано с появлением камней в почках (NCBI ClinVar; Nelwan, 2013; and Phornphutkul, 2002). Камни почек появляются в 64 года у 50% индивидов с AKU (Introne and Gahl, 2019). Три пациента, каждый старше 50 лет, прошли замещение аортальных клапанов (NCBI ClinVar; Nelwan 2013; and Phornphutkul, 2002). Стеноз аортальных клапанов возникает с высокой частотой на 6-м и 7-м десятке лет жизни (Introne and Gahl, 2019). AKU заставляет мочу становиться черной (Hakim et al., 2018; Genetics Home Reference, 2019a; and Masoud et al., 2017) в ответ на подщелачивание или воздействие воздуха (Hakim et al., 2018; Genetics Home Reference, 2019a; Introne and Gahl, 2019; and Li et al., 2016). У детей отсутствуют симптомы AKU помимо превращения мочи в черную. Боли, связанные с AKU начинаются примерно во второй декаде жизни, возникает в результате (Nelwan, 2013). Охроноз создает черновато-синий пигмент в хрящах, соединительных тканях и коже. (Genetics Home Reference, 2019b). Охроноз возникает после 30 лет (Genetics Home Reference, 2019; and Introne and Gahl, 2019b). Пациенты с AKU обычно имеют артриты, особенно в позвоночнике и крупных суставах, начиная с раннего взрослого возраста (Nelwan, 2013). Артриты начинаются в третьей декаде. Суставные симптомы затрагивающие позвоночник появляются в то же время. В одной крупной серии, боль в пояснице возникла в возрасте до 30 лет у 49% и до 40 лет у 94%. (Introne and Gahl, 2019). Selvakumar et al. описали пациента с артритом, достигшим 72 лет, при этом не было известно, что он болен AKU. Ochronosis возникает в 5-й декаде, при этом пигмент накапливается в тканях клапанов (Selvakumar et al., 2018). HGA и продукты её окисления накапливаются в артериях и поджелудочной железе, сердечных клапанах, гиалиновых хрящах, связках, эпителиальных клетках почечных канальцев, коже, сухожилиях, в хрящах ушей и носа и склерах (Karaoglu, 2016).

3.3. Diagnosis tools for alkaptonuria

Диагностика AKU возможна в любом возрасте. В раннем детстве, моча темнее после соприкосновения с воздухом. Диагностика в поздний период жизни может также включать боли в пояснице и боли в суставах (Nelwan, 2013). Доступны несколько методов для диагностики AKU. Сюда входит компьютерная томография (CT), gas chromatography-mass spectrometry (GCMS), liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/ MS), magnetic resonance imaging (MRI), radiographic examinations (X-rays) и генетические тесты (Table 3). Li et al. использовали сканирование с помощью CT и MRI у 62-летней женщины, чтобы доказать AKU. С помощью этого метода авт. установили многоуровневую дегенеративную болезнь дисков в поясничной части позвоночника, включая кальцификацию, osteophytosis и vacuum phenomenon. MRI показала сдавливание спинного мозга на многих уровнях. Это произошло в основном из-за ненужной ligamentum flavum сзади. Моча пациентов темнела после соприкосновения с воздухом (Li et al., 2016). Mazoochy and Razi изучали радиографически 57-летнюю женщину, чтобы обнаружить ochronosis. Рентгенограмма правого бедра у пациента показала прогрессирование хронотической (ochronotic) артропатии (Mazoochy and Razi, 2018). Hakim et al. (2018), используя радиографическую оценку для обнаружения дегенеративного артрита в обеих бедренных костях и колене с левой стороны у 65-летнего мужчины. Для подтверждения авт. использовали секвенирование ДНК. Была обнаружена редкая делеция в геноме в 69 пн в экзоне 2 и окружающих ДНК последовательностях по флангам интронов (Hakim et al., 2018). Базой для диагностики AKU может стать обнаружение значительных количеств HGA в моче с помощью GCMS анализа (Introne and Gahl, 2019; and Nickavar et al., 2018) (Table 3). The Martin L. Nelwan / Afr.J.Bio.Sc. 3(1) (2021) 19-33 Page

Количество экскретируемой HGA в день составляло 1- 8 грамм (Introne and Gahl, 2019). Однако, GCMS не является рутинным подходом для диагностики AKU. Используется в основном LC-MS/MS. Davison et al. использовали LC-MS/MS подтверждения повышенного уровня HGA у пациентов с AKU (Davison et al., 2019). Introne and Gahl полагают, что идентификация биаллельных патогенных вариантов в гене HGD при молекулярном генетическом тестировании подтверждает диагностику и делает возможным изучение семей. Метод MRI может выявлять аномалии в сухожилиях пациентов с AKU (Introne and Gahl, 2019).

Table 3: Diagnosis tools for alkaptonuria

Использование nitisinone требует пищевых ограничений, т.к. его побочным эффектом является hypertyrosinemia. Чтобы задержать начало и прогрессирование AKU, необходимо ограничение в диете белка, витамина C и nitisinone. Витамин C in doses of 1 гр. в день представляет собой разумное воздействие у старших детей и взрослых. Однако, польза от vitamin C у AKU пациентов сомнительна. Vitamin C служит в качестве кофактора для 4-hydroxyphenylpyruvat dioxygenase (HPPD). HPPD приводит к увеличению продукции HGA (Alajoulin et al., 2015). Использование витамина С не рекомендуется (India AKU Society). Долговременная безопасность и эффективность воздействия nitisinone неизвестны (Cieszynkiet al., 2016). Introne and Gahl сообщили, что nitisinone снизил экскрецию с мочой HGA , по крайней мере, на 69% у двух индивидов. Однако, повышенные концентрации в плазме тирозина, вызывают фотобоязнь. Др. побочным эффектом являются кристаллы в роговице. Теоретически, могут развиваться нейрологические осложнения, ассоциированные с tyrosinemia type III. Кроме того, низкие дозы nitisinone снизили содержание HGA в моче на 95% у 9 индивидов с AKU. В том же исследовании авт. информировали о использовании nitisinone у 7 индивидов в течение 15 недель. Эти пациенты имели нормальное потребление белка. Все имели повышенные концентрации тирозина в плазме. Не наблюдались ни офтальмологические, ни нейрологические или тяжелые дерматологические осложнения. Два индивида обнаруживали временные повышения в печени уровней transaminase. Уровни печеночной transaminase возвращаются к норме после прекращения действия nitisinone. Introne предлагает идею, что трехлетнее терапевтическое испытание, 2 mg nitisinone снижает в моче и плазме HGA на 95%. Плазменный tyrosine усредняется до 800 µM в отсутствие пищевых ограничений. Побочные эффекты были минимальными. У одного из затронутых индивидов обнаруживались кристаллы в роговице, что привело к отказу от nitisinone (Hakim et al., 2018; and Phornphutkul et al., 2002). Мышиная модель для изучения AKU доступна (MIM #203500) (Montagutelli, 1994). Davison et al. пришли к заключению, что nitisinone не оказывает воздействия на метаболизм monoamine нейротрансмиттера у мышей в ЦНС. Nitisinone вряд ли приводит к изменению настроения или познавательной деятельности у пациентов с AKU (Davison et al., 2019). Доступны многие стратегии по лечению AKU; техники генетических манипуляций. Сюда входят AAV, FokI-dCas9, iPSCs, EJHTs. EJHTs может включать MMEJ-обеспечиваемую технику и HMEJ-обеспечиваемую технику. Техники генетических манипуляций могут быть очень эффективными для лечения как аутосомно рецессивных AKU, так и AKU с аутосомно доминантным наследованием. У животных моделей, способные к репрограммированию nucleases и EJHTs могут быть пригодны в качестве инструментов для лечения рецесмсиных нарушений, таких как hemophilia A и AKU. Nelwan полагает, что система CRISPR/Cas9 в комбинации с HMEJ-обеспечиваемой или iPSCs техникой может оказаться полезной для лечения моногенных рецессивных нарушений, таких как hemophilia A, antagonistic disorder, и Friedreich атаксия. Авт. полагает, что CRISPR/Cas9 система может корректировать мутантный ген, конструируя DSBs и EJHTs (HMEJ), может откорректировать разрезы. Она может корректировать мутантные сегменты или удаленные копии в строке. Антагонистическим нарушением является X-сцепленный рецессивный паттерн наследования (Nelwan, 2018a). CRISPR/Cas9 система в комбинации с HMEJ-обусловленными или iPSCs может оказаться пригодной для лечения AKU и с аутосомно доминантным наследованием. Использование AAV-опосредованной RNA interference (RNAi) для терапии может оказаться благоприятным для лечения как рецессивных генетических нарушений, так и доминантных генетических нарушений. Malerba et al. использовали эту стратегию, чтобы вызвать нокдаун эндогенной дикого типа и мутантной форм аллеля PAPBN1. Авт. также использовали добавление генов, чтобы заместить транскрипт компенсаторной нормальной человеческой кодон-оптимизированной мРНК, резистентной к RNAi-индуцируемым разрезам. Сходная пре-клиническая стратегия была использована для восстановления функциональной способности родопсина в фоторецепторах модельных животных с Retinitis pigmentosa. Те же исследователи использовали эту стратегию для воздействия на oculopharyngeal и Retinitis pigmentosa, соотв. Oculopharyngeal аномалия является аутосомно-доминантным генетическим нарушением (Malerba et al., 2017). Аномалия родопсина является аутосомно рецессивным или доминантным генетическим нарушением (MIM #180380) (Kartasasmita et al., 2011; and Vaithinathan et al., 1994). Показано, что эта стратегия может быть эффективной для лечения AKU как с аутосоно рецессивным, так и доминантным наследованием, если таковое имеется. Pan et al разработали модифицированную CRISPR систему: FokI-dCas9. FokI-dCas9 корректирует p.Arg408Trp в гене PAH. p.Arg408Trp является наиболее распространенным вариантом при фенилкетонурии (PKU). PKU , как и AKU является редким аутосомно рецессивным нарушением, наследуемым в соответствии с правилом расхождения. Pan et al полагают, что FokI-dCas9 система может быть использована для прецизионной медицины и при др. метаболических болезнях (Pan et al., 2016), таких как AKU. 5.

Итак, AKU наследуется по аутосомно рецессивному типу. Однако, и аутосомно доминантный паттерн появляется, но довольно редко и необыкновенно редко в семьях с AKU. Чтобы контролировать AKU, диагностика играет важную роль. Техники диагностики включают CT, генетические тесты, GCMS, LC-MS/MS и X-rays. Генетические тесты включают тестирование одиночных генов Martin L. Nelwan / Afr.J.Bio.Sc. 3(1) (2021) 19-33 и секвенирование генома. Отсутствуют эффективные лекарства в настоящее время . Использование витамина C не оказывает позитивного эффекта у пациентов с AKU. Его прием не рекомендуется пациентами с AKU. Генетическое консультирование может помочь в контроле за пациентами с AKU и их семьям о том, как справиться с этим заболеванием или замедлить его развитие. Лекарственным кандидатом по контролю AKU является nitisinone. Nitisinone, как было установлено, обнаруживает удивительные благоприятные эффекты в качестве лекарства у AKU пациентов. Nitisinone не запускает депрессию у пациентов с AKU. Техники генетических манипуляций являются потенциальными инструментами и будут пригодны для контроля AKU в будущем. Эти инструменты могут включать AAV-обусловленное RNAi, FokI-dCas9, EJHTs и iPSCs.