Естественно возникший major histocompatibility complex (MHC) class I - ограничен T cell receptors (TCRs), нацеленными на tumor-associated antigens (TAAs), часто зависит от присутствия CD8αβ ко-рецептора, чтобы стабилизировать их ограниченную функциональную алчность (avidity). Чтобы сделать возможным рекрутирование благотворных CD4+ T клеток с class I с помощью базирующейся на TCR adoptive T клеточной терапии, необходимо оценить совместную экспрессию трансгенных CD8αβ и TCR (TCR8) в качестве стратегии перенаправления CD4+ T клеток на опухоль (1-6). Хотя усиление биофизических свойств во время TCR-MHC (peptide-MHC) распознавания и ранней передачи сигналов TCR были подтверждены в качестве потенциального механизма для усиления функциональности, остается неизвестным, действительно ли принудительная экспрессия TCR8 индуцирует более фундаментальные транскрипционные последствия в CD4+ или CD8+ T клетках.

Функция CD8αβ ко-рецептора активно исследовалась в последнее время. Выявлены множественные критические роли во время TCR-pMHC распознавания и процесса активации T клеток (7, 8), сюда входят стабилизация TCR-pMHC комплекса путем соединения с молекулами MHC class I (9-11), доставка ключевых сигнальных компонентов на цитоплазматическую сторону комплекса TCR/CD3 (12, 13), и разбиение TCR в оптимальные мембранные компартменты для сигнальной трансдукции (13-15). Зависимость TCR от CD8αβ ко-рецептора коррелирует с TCR сродством и тем самым CD8αβ обладает способностью модулировать чувствительность к антигенам TCR T клеток с низким сродством в несколько раз (16-18). Все эти функции обладают потенциалом существенно влиять на результаты adoptive T клеточной терапии с TCR-преобразованными T клетками (1-6). Кроме того, присутствие функциональных CD4+ T клеток обязательно для управления эффективной иммунной реакцией, т.к. они вносят многосторонние вклады в антиген-специфический иммунитет к вирусным инфекциям и являются обязательными для инициации и поддержания долговременного контроля над опухолью (19). Напр., антиген-специфические CD4+ T клетки необходимы для продолжительного успеха у пациентов, получивших вирус-специфические T клетки, инфильтрирующие опухоль лимфоциты или chimeric antigen receptor (CAR) T клетки (20-22).

Целю данного исследования было глубокое проникновение в функциональные и транскрипционные эффекты от усиленной экспрессии трансгена CD8αβ вместе с ранее идентифицированными CD8-зависимыми TCR, которые целенаправленно воздействуют на survivin (TCR8) в CD4+ и CD8+ T клетках (23). Мы полагали, что (i) TCR8-перенаправленные CD4+ и CD8+ T клетки будут функционально и транскрипционно отличными, даже если оба цитотоксичны против целевого class I эпитопа, (ii) транскриптомика одиночных клеток сможет идентифицировать используемый путь и статус дифференцировки T клеток и (iii) комбинация экспрессии трансгена CD8αβ с TCR модифицирует функцию и транскриптом трансгенных CD8+ T клеток, а не только CD4+ T клеток. Поэтому мы исследовали транскриптомику одиночных T клеток из искусственно преобразованных CD4+ и CD8+ T клеток и сопоставили наши находки с функциональными оценками in vitro и in vivo.

Мы установили, что переориентированные CD4+ T клетки убивают killed соответствующие клетки мишени, если трансдуцируются с TCR8, но не TCR сами по себе, а их цитотоксичность, продукция цитокинов и биофизические свойства сравнимы с таковыми клеток TCR+CD8+ или TCR8+CD8+ T клеток. Single-cell RNA sequencing (scRNAseq) анализ идентифицировал транскрипционные эффекты, связанные с Т клеточными клонами (CD4+ или CD8+), состоянием клеток (fresh, expanded или cocultured), или типом трансгенов (TCR или TCR8). С клональным или клеточным состоянием связанные эффекты оказались наиболее выраженными. Совместное культивирование TCR8+CD4+ T клеток характеризовалось устойчивой активацией множественных транскрипционных программ, которые ассоциировали с устойчивыми противоопухолевыми реакциями преобразованных Т клеток , такими как антиген-зависимая цитотоксичность и репликация без терминальной дифференцировки и истощения Т клеток, совместной стимуляции и метаболических преимуществ. Модельные лейкемии мышиные ксенотрансплантаты in vivo, TCR8+ трансгенные T клетки обеспечивали лучший контроль лейкемии, чем TCR+ трансгенные T клетки (как CD4+ , так и CD8+), и TCR8+CD4+ T клетки превосходящие по быстродействию TCR8+CD8+ T клетки.

Т клетки были переориентированы в class I-ограниченный TAA эпитоп только с survivin-специфическим TCR (TCR) (23) или в комбинации с CD8αβ ко-рецептором (TCR8). Мы оценили нашу экспериментальную систему, показав, что CD4+ T клетки успешно переориентируются в результате целенаправленной действующей трансдукции в survivin эпитоп TCR8 и что эти переориентированные TCR8+CD4+ T клетки убивают HLA-A*0201+survivin+ BV173 лейкемичные клетки мишени зависимым от class I способом, подтверждая ранние исследования др. использованных TCRs (1-6). На массивном уровне, переориентированные TCR8+CD4+ T клетки были функционально сравнимы с TCR+ или TCR8+CD8+ T клетками in vitro. Однако, методы определения убийства одиночных клеток in vitro, также как и модельные мышиные ксенострансплантаты in vivo выявили достоверный успех TCR8 трансгена по сравнению с только TCR в CD8+ T клетках, опосредованный усилением способности sequential убийства in vitro и лучшим контролем лейкемии in vivo. Скорее всего, дисбаланс между доступными эндогенными CD8αβ и трансгенными TCR молекулами в TCR+CD8+ T клетках представляет собой ограничивающий фактор эффективного формирования иммунологических синапсов и противоопухолевого действия, т.к. трансдукция с помощью ретро-вирусов приводит к экспрессии supraphysiologic количеств копий вставленного гена(ов) (36, 37). Сходный эффект был описан ранее в отношении экспрессии трансгенов 4-х CD3 цепочек в TCR трансгенных T клетках (38). Эти находки показали, что принудительная экспрессия TCR8 является не только стратегией переориентировать CD4+ T клетки против class I эпитопов, но и также достоверно увеличивает функцию трансгенных CD8+ T клеток.

Используя scRNAseq, мы идентифицировали разные отличающиеся транскрипционно определенные субпопуляции T клеток. Источник происхождения клона T клеток (CD4+ или CD8+) и клеточное состояние (fresh, expanded, or cocultured) оказывают очень сильные эффекты на пространственное распределение клеток при t-SNE анализе. Мы сконцентрировали наши исследования на изменениях , возникающих при expanded и cocultured состояниях, поскольку мы имели целью идентифицировать DE гены и пути в преобразованных T клетках, которые ассоциированы с усилением работы Т клеток (sequential убийство опухолевых клеток, устойчивая экспансия T клеток и усиление цитотоксичности in vivo). Мы установили, что большинство заметных транскрипционных изменений происходит в TCR8+CD4+ T клетках после совмесного культивирования. Устойчивая активация некоторых путей, как известно, является критической для долговременного функционирования перенацеленных на опухоль преобразованных T клеток, она проявляется в виде цитотоксичности, совместного стимулирования, OXPHOS, клеточного цикла и пролиферации, а также в огромном разнообразии экспрессирующихся транскрипционных факторов. В частности, эти пути были первоначально активированы в CD4+ и CD8+ T клетках, но только при совместном культивировании TCR8+CD4+ T клеток их экспрессия оказывалась устойчивой. Кроме того, истощение ассоциированных генов было более низким в CD4+ по сравнению с CD8+ T клетками.

Некоторые ассоциации между некоторыми этими путями хорошо описаны для T клеток. Напр., ко-стимуляция посредством CD28 , как было установлено, является ключевым драйвером для усиления метаболизма глюкозы и митохондриальной активности в T клетках, приводящих к формированию пула функциональных memory T клеток (39, 40). Мы установили высокий уровень экспрессии CD28 мРНК и CD28 белка в CD4+ T клетках, вместе с сопутствующей высокой экспрессией связанных с гликолизом генов и митохондриальной массой, которая сохраняется во время совместного культивирования. Избыток митохондрий, присутствующий в CD4+ T клетках человека, ранее был ассоциирован с резистентностью к клеточному старению по сравнению с CD8+ T клетками и он может поэтому вносить вклад в усиление убийства лейкемических клеток и пролиферацию TCR8+CD4+ T клеток (41). Кроме того, OXPHOS, главный метаболический путь в долговременном сохранении memory T клеток (42), был высоко активен в TCR8+CD4+ T клетках, это также сохраняло многие клетки с TCM фенотипом за счет экспрессии генов и уровней белков в CD8+ T клетках. В предыдущем сообщении было показано, что передача сигналов в CAR T клетках посредством 41BB costimulatory эндо-домена преимущественно использует OXPHOS по сравнению с гликолизом и характеризуется с помощью усиленной пролиферации и персистенции T клеток (34). Кроме того, TCR8+CD4+ T клетки образуют более крупную реплицирующуюся популяцию клеток, чем CD8+ T клетки и обеспечивают устойчивую экспрессию генов клеточного цикла, что согласуется с наблюдением, что TCR8+CD4+ T клетки лучше распространяются во время sequential опухолевых проблем. Поскольку все эти преимущества могут быть объяснены связанными с CD4 клонами эффектами, то прямая передача сигналов CD4 ко-рецептора должна также учитываться. Оба CD4 и CD8 ко-рецептора ассоциируют с LCK и обеспечивают активацию ранней передачи сигналов TCR. Количество ассоциированных LCK с CD4 ко-рецептором примерно в 10-20 раз выше, чем LCK, связанных с CD8 ко-рецептором (43). Т.о., TCR8+CD4+ T клетки могут иметь преимущества благодаря этой более высокой полезности LCK во время ранней передачи сигналов TCR а большей степени, чем в преобразованных CD8+ T клетках. Мы также наблюдали, что TCR8+CD4+ клетки продуцируют более низкие уровни interleukin-4 (IL-4) и IL-10 после совместного культивирования, указывая на TH1/TH2 гибридный фенотип. Эти находки согласуются с недавней оценкой транскриптомов отдельных клеток и с профилем продукции цитокинов CD4+ и CD8+ T клетками человека, преобразованных с помощью третьего поколения CD19 CAR (44). В нашей TCR системе, фенотип и функция TH1 преобладают, при этом минорная популяция TH2 не снижает противоопухолевой функции in vitro и in vivo. Высокая экспрессия совместно стимулируемых молекул (CD28, SLAMF1 и CD70) комбинируется с усилением передачи сигналов pLCK после распознавания мишени и способна преодолевать потенциальные ингибирующие эффекты IL-10. Эти находки подтверждают, что TCR8+CD4+ T клетки характеризуются несколькими клон-специфическими преимуществами, включая высокую экспрессию ко-стимулируемых молекул, высокое содержание митохондрий и общую усиленную метаболическую конкурентоспособность во время совместного культивирования, что улучшает пролиферацию и функциональную способность в микроокружении опухоли.

Тип трансгена (TCR или TCR8) единственный сегрегирующий в популяции CD8+ T клеток после совместного культивирования. Наиболее заметным общим признаком в совместной культуре TCR8+CD4+ и TCR8+CD8+ по сравнению с TCR+CD8+ T клетками является сохранение менее дифференцированного фенотипа за счет экспрессии TN- и TCM-ассоциированных генов, что было подтверждено с помощью FACS. Значительно более высокая пропорция TCM клеток обнаружена при совместном культивировании TCR8+CD4+ и TCR8+CD8+ по сравнению с TCR+CD8+ T клетками. Ранее было показано. что TN- или TCM-производные CD8+ T клетки продуцируют более дифференцированные эффекторные Т клетки после adoptive переноса (45-47) и этот фенотип является желательным для adoptive T клеточной терапии (48). Более крупная популяция менее дифференцированных Т клеток в условиях TCR8+CD4+ или TCR8+CD8+ может вносить в наблюдаемое усиление противоопухолевой функции in vitro и in vivo. Устойчивая экспрессия CXCR4 в преобразованных Т клетках может быть особенно интересной, когда осуществляется целенаправленное воздействие на гематологические злокачественные раки, поскольку CXCR4 обеспечивает возвращение домой T клеток в микроусловия костного мозга (49). Экспрессия TCR8 в CD8+ T клетках также приводит к повышению экспрессии SLAMF1 и к более высокой массе митохондрий по сравнению с TCR+CD8+ T клетками. Т.о., дополнительная передача сигналов CD8αβ ко-рецептора может поддерживать сохранение некоторых costimulatory молекул и митохондриальный гомеостаз во время совместного культивирования.

CD4+ T клетки обладают огромным разнообразием функций по контролю эффективных иммунных реакций против инфекции и рака, а их взаимодействие с CD8+ T клетками имеет критическое значение (19, 50), на что указывает и adoptive перенос CD4+ TH1 tumor-infiltrating лимфоцитов, целенаправленно воздействующих на опухолевые неоантигены или введение CD19-CAR T клеток в определенном соотношении с CD4:CD8 T клетками (22, 51, 52). В преклинических исследованиях оценка противоопухолевой функции IL-13Rα2 CAR T клеток против глиобластомы, CD4+ CAR T клетки сами по себе были более мощными, чем CD8+ CAR T клетки в отдельной или смешанных популяциях с определенным соотношением CD4:CD8 ratios (53). Т.о., функциональная способность CD4+ T клеток должна, скорее всего, быть инкорпорирована в продукты трансгенных по TCR T клеток для adoptive переноса, т.к. CD4+ T клетки м. вносить существенный вклад в контроль над опухолями, и в сохранение CD8+ T клеток после adoptive переноса. Необходимо оценить, действительно ли очищенные CD4+ T клетки или продукт со специфическим соотношением CD4:CD8 являются предпочтительными для TCR T клеточной терапии. Накапливаются данные, что опухолевая гистология возможно также играет роль в детерминации наилучшим образом созданного infusion продукта.

В целом совместная экспрессия трансгенного CD8αβ ко-рецептора оказывает благоприятные эффекты на функцию TCR8+CD8+ и TCR8+CD4+ T клеток it и in vivo. TCR8+CD4+ T клетки являются полифункциональными гибридными T клетками с одновременными цитотоксическими эффекторными функциями и сохраняющими нативные функции CD4+ T клеток на уровне одиночных клеток. Мы открыли ранее неизвестное выраженное транскрипционное изменение, происходящее в TCR8+CD4+ T клетках после возникновения опухоли. Идентифицированные пути, как известно, выполняют критические роли в долговременной персистенции и противоопухолевой функции преобразованных T клеток в микроокружении опухоли, но это прежде не было увязано с функцией CD8 ко-рецептора. Мы предлагаем работающую модель для объяснения того, как TCR8+-преобразованные CD4+ и CD8+ T клетки осуществляют свою повышенную противоопухолевую функцию (Fig. 7). TCR8+CD4+ T клетки в целом ведут себя наилучшим образом. С помощью scRNAseq и экспериментальной оценки, мы предполагаем, что такая повышенная работоспособность обусловлена изменениями транскрипции несколькими известными способами, критическими для долговременной противоопухолевой активности adoptively перенесенных T клеток, включая цитотоксичность, совместную стимуляцию, метаболические программы, клеточную дифференцировку, истощение и пролиферацию.

Fig. 7 TCR8+CD4+ T cell performance is characterized by sustained expression of diverse transcriptional programs. (A) Summary of the main findings identified by scRNAseq in cocultured cytotoxic engineered CD4+ and CD8+ T cells. (B) Summary of main findings from in vitro and in vivo functional assays and overall engineered T cell performance. Low to high intensity of red indicates low to high T cell function.