Посещений:
МОНОГЕННЫЕ БОЛЕЗНИ КРОВИ



Генотерапия

Advances in the gene therapy of monogenic blood cell diseases
Juan A. Bueren, Oscar Quintana-Bustamante, Elena Almarza et al.
Cin.Gen. https://doi.org/10.1111/cge.13593

В то время как трансплантации аллогенных hematopoietic stem cells (HSCs) от здоровых доноров составляют стандартную терапию пациентов с наследственными гематопоэтическими болезнями, пропорция пациентов с HLA совместимыми донорами ограничена. Кроме того, существенные побочные эффекты главным образом связанные с graft vs host disease (GVHD), инфекциями и неспособностью к приживлению трансплантатов связаны с подобным вмешательством. Благодаря этим ограничениям, и благодаря успехам разработки генотерапии, генетическая коррекция аутологичных HSCs становится альтернативным терапевтическим вмешательством в противовес аллогенным трансплантациям при наследственных гематологических болезнях.
Базируясь на самообновлении и мультипотентных свойствах примитивных HSCs, эти редкие клетки костного мозга (BM) рассматриваются как идеальная мишень для коррекции генетических дефектов, характерных для наследственных гематопоэтических болезней. HSCs ответственны за долговременную генерацию в периферической крови (PB) T- и B-лимфоцитов, клеток натуральных киллеров, моноцитов, гранулоцитов, эозинофилов, базофилов, макрофагов, эритроцитов и тромбоцитов.1 Поэтому любая моногенная болезнь, ассоциированная с дефектами клеток крови, может лечиться путем генетической коррекции HSCs.
Поскольку трансдукция in vivo HSCs является очень неэффективным процессом, то современная гематопоэтическая генотерапия базируется на сборе и трансдукции ex vivo аутологических HSCs с помощью терапевтических векторов. Откорректированные клетки затем снова вводятся пациенту, в большинстве случаев после sub-myeloablative или myeloablative культивирования (conditioning), чтобы облегчить приживление откорректированных клеток. Новые подходы к генотерапии использую более точные стратегии, базирующиеся на редактировании генов (see Figure 1).

Figure 1 Gene therapy approaches for the treatment of monogenic blood cell diseases. Ex vivo gene therapy approaches are based on the collection patient's hematopoietic stem cells, followed by their genetic correction (either targeted or untargeted) and reinfusion of corrected cells in the patient. In vivo gene therapy approaches are based on the direct inoculation of viral or non?viral vectors in the patient, aiming the in situ genetic correction of affected cells [Colour figure can be viewed at wileyonlinelibrary.com]
Несмотря на клинические эффекты первых испытаний генотерапии, проведенных на пациентах с X-сцепленным severe common immunodeficiency (SCID-X1)2-4 и ADA-SCID,5, 6 и позднее на болезни хронического грануломатоза (CGD)7 и Wiscott-Aldrich (WAS) пациентах,8 обнаруживались ассоциированные риски использования gamma-retroviral vectors (RVs) у некоторых пациентов, чьи HSCs трансдуцировали с помощью этих векторов.7-13 Несмотря на это генерация само-инактивирующихся лентивирусных (SIN-LV) и gamma-retroviral vectors (SIN-RVs) оказала огромное влияние на клиническое развитие генотерапии, поскольку помимо их клинической эффективности, не было обнаружено серьезных побочных событий (SAEs) у пациентов, леченых новыми веторами.

2 GENE THERAPY IN PRIMARY IMMUNODEFICIENCIES


Первичные иммунодефициты (PIDs) являются гетерогенной группой редких болезней, ассоциированных с дефектами или количества или функции клеток иммунной системы. PIDs представляют собой группу из более 300 генетических дефектов, затрагивающих наиболее важные системы, ответственные за защиту от инфекции и рака.14, 15 В зависимости от специфичности PID, их показатель варьирует чрезвычайно.16 Кроме того, поскольку соотв. функционирование иммунной системы необходимо с первых недель жизни, то PIDs часто становятся угрожающими жизни болезнями, которые возникают в раннем детстве. Клинические симптомы разнообразны и в целом ассоциируют с высоким показателем инфекции и даже смертности. Единственным лечением при PIDs, помимо ADA-SCID, для которой замещение энзимов оказывается частично эффективным,17 являются трансплантации гематопоэтических стволовых клеток (HSCT).18 Результаты HSCT для PIDs заметно улучшились после первых трансплантаций, осуществленных при WAS19 и SCID20. Тем не менее вероятность обнаружения совпадающего донора для пациентов с тяжёлыми PID ограничена, во многих случаях это обусловлено необходимостью осуществления трансплантации во время первых месяцев жизни. Поэтому генотерапия является хорошей альтернативой для многих пациентов PID.15
Клинические испытания на пациентах с SCID-X12-14, 21 и ADA-SCID5, 6 четко показывают преимущества генотерапии при PIDs. В обоих случаях, использованы RVs, чтобы облегчить инсерцию терапевтического гена в HSCs пациента. К сожалению, спустя 2 года после инициации испытаний с SCID-X1, были обнаружены у двух пациентов SAEs в виде лимфоцитарной лейкемии из-за инсерционного онкогенеза. В обоих случаях происходили интеграции RV вблизи LMO2 протоонкогена, способствуя трансактивации этого гена посредством LTR (long terminal repeat) энхансера RV провируса.9, 10 Сходные SAEs затем были обнаружены у др. X1-SCID пациентов3, 4, 11, 12, а также у X-CGD7, 13 и WAS пациентов22 (Table 1).

Table 1. Summary of gene therapy trials carried out with gamma?retroviral vectors (RV) and with self?inactivated lentiviral (SIN?LV) and gamma retroviral vectors (SIN?RV) trials in patients with primary immunodeficiencies 
Disease        Vector    Vector                                    Number of               Clinical
                                      promoter        Conditioning        treated patients         efficacy        SAEs        Alive§        Reported
                                                                                                                                          follow-up (months)        References
X1?SCID        RV        LTR (MLV)        No        10        9        4        9        60-99        2, 9-11, 21

        RV        LTR (MLV)        No        10        9        1        10        54-107        3, 4, 12

        SIN?RV        EF1?        No        9        7        0        8        12-39        23

        SIN?LV        EF1?        RIC        5        5        0        5        6-30        24

ADA?SCID        RV        LTR (MLV)        RIC        18        15        0        18        28-161        5, 6, 25

        RV        RV LTR (MLV)        RIC        10        9        0        10        33-84        26

        RV        RV LTR (MLV)        RIC        6        4        0        6        24-84        27

        SIN?LV        EF1?        RIC        20        18        0        20        17-54        28

WAS        RV        RV LTR (MLV)        FC        10        9        7        8        25-81        8, 22

        SIN?LV        WAS        FC        3        3        0        3        20-33        29

        SIN?LV        WAS        FC        7        6        0        6        9-42        30

CGD        RV        RV LTR (SFFV)        FC        2        0        2        1        26-45        7, 13

        RV        RV LTR (MLV)        FC        2        0        0        2        36        31

SIN-LV        Chimeric myeloid promoter     FC        7        7        0        7        ND        32, 33


В противоположность первым испытаниям с ADA-SCID, при которых не использовали conditioning и когда PEG-ADA не были остановлены во время вливания трансдуцируемых CD34+ клеток,34 то в последующих испытаниях использовали умеренное conditioning , а PEG-ADA переводили в суспензию перед генотерапией. 6, 25, 27 Эти модификации заметно повысили эффективность терапевтического подхода. Более того, в противоположность наблюдениям при др. PIDs, ни один из подвергшихся лечению ADA-SCID пациентов не имел SAEs (Table 1), хотя обнаружены горячие точки интеграции в разных прото-онкогенах. 5, 6, 25, 27, 34, 35 Благодаря сходству остова RV, используемого в испытаниях ADA-SCID и др. испытаниях, возникали события инсерционного онкогенеза, различия или в терапевтическом трансгене или, скорее всего, в природе болезни могут объяснить безопасность, связанную с генотерапией ADA-SCID. После обнаружения первых SAEs у ряда PID пациентов, область генотерапии быстро прогрессировала благодаря развитию надежных терапевтических векторов. Генерация само-инактивирующихся лентивирусных векторов(SIN-LV)36, 37 и SIN-RV38, 39 вскоре продемонстрировала важность этих новых вирусных векторов. Надежность SIN-LVs, как было установлено, является следствием инактивация активности энхансера HIV-1 LTRs - это драматически снижает потенциал трансакивации провируса - а также свойства интеграции LVs, что контрастирует с RVs, которые преимущественно не воздействуют целенаправлено на точки старта транскрипции . Возможность использования внутренних промоторов облегчает избирательную экспрессию трансгена в специфических гематопоэтических клонах, это предоставляет дополнительные преимущества этим новым векторам по сравнению с первыми RVs.40-43
SIN векторы, главным образом SIN-LVs, быстро становятся предпочтительными векторами для лечения PIDs. В случае ADA-SCID и X1-SCID, промотор EF1α был выбран для управления экспрессией терапевтических трансгенов.24, 44-46 В случае X-CGD, химерный промотор, состоящий из слитой регуляторной последовательности c-fes и Cathepsin G генов был использован, чтобы способствовать предпочтительной экспрессии gp91 в миелоидных клетках.47 При испытании WAS,29 избранный промотор включает регуляторный регион промотора WAS с целью управления физиологической экспрессией WASP в PB клетках48, 49 (see Table 1).
Благодаря созданию SIN-LV и SIN-RV, более 100 пациентов с PIDs подверглись действию этих новых векторов. Поразительно, отсутствовали SAEs и достигались великолепные клинические исходы у таких пациентов, подтверждая, что генотерапия вскоре составит альтернативу HSCT у пациентов с PIDs.50
Успехи гематопоэтической генотерапии важны и для др. PIDs. Напр., в случае leukocyte adhesion deficiency (LAD), группы синдромов, затрагивающих поставку лейкоцитов. LAD type I (LAD-I) наиболее распространен, затрагивает 1/1000000 родов.51 LAD-I является аутосомно-рецессивным PID, характеризующимся дефицитом экспрессии β2 интегринов.52 Эти мембранные гликопротеины являются αβ гетеродимерами у которых 4 разных α субъединиц (CD11A, B, C и D белки) димеризуются с общей β субъединицей (CD18, кодируемой геном ITGB2). Экспрессия CD18 необходима для нормальной поставки лейкоцитов к месту инфекции. Следовательно, клиническими проявлениями у LAD-I пациентов является увеличение инфекций, которые не могут соотв. разрешиться. Описаны два основных фенотипа при LAD-I. Тяжелый фенотип с менее чем с 2% CD18+ лейкоцитов в PB, ассоциирует с угрожающей жизни инфекциями с первых дней жизни.52-55 Пациенты с 2% - 30% лейкоцитов CD18+ имеют менее тяжелые клинические симптомы, включая более низкую частоту инфекций и боле продолжительную жизнь.51-54 При др. PIDs, единственным лечением являются HSCT от совместимых доноров. Для тяжелых случаев LAD-I необходимо безотлагательное лечение в ранней жизни. Первые попытки лечения LAD-I пациентов с помощью генотерапии использовали вирусом лейкоза гибонов (GALV)-псевдотипированные RVs. Наблюдалось очень низкое и преходящее приживление откорректированных клеток при этом испытании, вероятно из-за отсутствия conditioning у пациентов56 и того факта, что откорректированные LAD-I клетки предшественники не обладают пролиферативными преимуществами. Недавние экспериментальные данные 57 подарили надежду на генотерапию таких пациентов. Наши исследования показали эффективность и надежность генотерапевтического подхода у мышей, моделирующих LAD-I, с использованием SIN-LV, у которого имеется химерный внутренний промотор47 - уже использовавшийся при генотерапии пациентов с X-CGD 58 - управляющий экспрессией CD18. Chim.hCD18-LV обусловливает фенотипическую коррекцию в лейкоцитах мышей LAD-I, которые затем экспрессируют гетеродимер на своей мембране и мигрируют к месту воспаления.57 Базируясь на этих экспериментальных результатах, ожидается, что LAD-I будет добавлен к списку PIDs, успешно излечиваемых генотерапией.

3 GENE THERAPY IN RED BLOOD CELL DISORDERS


Наследуемые red blood cell (RBC) нарушения составляют вторую важную группу наследуемых гематопоэтических расстройств, при которых используется генотерапия. Эта группа включает гемоглобинопатии, такие как β-талассемия (β-thal) и серповидно клеточная болезнь (SCD), эритроидные метаболические болезни, подобные glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and pyruvate kinase deficiency (PKD) и нарушения мембраны эритроцитов, подобные congenital dyserythropoietic anemia (CDA). Общими симптомами при этом являются анемия и сопутствующие осложнения, включая желтуху, избыточность железа, экстра-медуллярный гематопоэз и и желчные камни, среди прочего.
Гемоглобинопатии составляют наиболее превалирующие RBC нарушения. Приблизительно 5% мировой популяции несет альтерации гемоглобина (Hb).59 Этот показатель гемоглобинопатий даже более частый в областях, где присутствует малярия поскольку эти патологии вместе с др. RBC нарушениями, такими как PKD, обеспечивают устойчивость к паразитарной инфекции.60, 61
RBC нарушения вызываются мутациями в специфических генах, большинство из которых уже идентифицировано и клонировано. Эти болезни могут лечиться аллогенными HSCT, подтверждая, что они являются хорошими кандидатами для гематопоэтической генотерапии. Т.к. гены, откорректированные в HSPCs от пациентов с RBC нарушениями, не дают преимуществ перед болезнью, то необходимо полное гематопоэтическое conditioning, чтобы элиминировать эндогенные HSCs и облегчить приживление генетически откорректированных клеток.62, 63
А случае гемоглобинопатий, уровни белка в 10% - 30% необходимы, чтобы компенсировать болезненный фенотип, вызванный в RBCs.64 Кроме того, экспрессия глобиновых белков тонко регулируется и ограничивается эритроидным клоном. Следовательно, клон-специфические промоторы необходимы в LVs, предназначенных для лечения гемоглобинопатий. Примером таких специфичных для эритроидов векторов являются BGI,65 TNS9,66 HPV569,67 GLOBE,68 и BB30569 векторы.
После ранних попыток генотерапии лечить β-thal пациентов с помощью RVs, были разработаны более безопасные SIN-LV с эритроид-специфичными промоторами, базирующимися в контрольных регионах локуса глобина. Эти векторы демонстрировали свою эффективность и надежность на мышиных моделях. Затем было предпринято клиническое испытание во Франции с BGI LV, показавшее клиническую эффективность у β-thal пациентов.65 Экспансия доброкачественного клона наблюдалась временно благодаря интеграции вирусного вектора в регуляторный регион гена HGMA2. После этого пропорция этого клона в циркулирующих ядерных клетках снижалась до менее, чем 10%,65 затем у пациента сохранялись стабильные уровни терапевтического гемоглобина и требовались лишь случайные трансфузии.70 Два др. клинических испытания проведены в СШАЮ Австралии, Франции и Тайланде с использованием вектора BB305. Большинство (92%) из non-β0β0 пациентов оставались независимыми от трансфузии после в среднем 26 мес. Наблюдалась долговременная, хорошая, хотя и варьирующая по уровню коррекция гена.69 Более тяжелые β0β0 и тяжелые β+β+ фенотипы обнаруживали 73% снижение потребности в ежегодных трансфузиях. Важно, что исследования интеграции вектора обнаружили поликлональное восстановление в отсутствии специфического клонального доминирования, которое могло отражать лейкемический процесс, обусловленный инсерционным мутагенезом, указывая тем самым на безопасность этого генотерапевтического подхода69 (Table 2).

Table 2. Active gene therapy trials in patients with RBC syndromes

Недавнее клиническое испытание было разработано в Италии с использованием GLOBE LV. В этом исследовании HSPCs были получены из PB после мобилизации с помощью with G-CSF и plerixafor (ингибитор сигнального хемокина CXCR4/SDF1 ) и были введены внутрь кости пациентов, обработанных с помощью миелоабляционного кондиционирования с треосульфаном плюс тиотепа. Это исследование продемонстрировало быстрое гематопоэтическое восстановление с поликлональным мультиклональным приживлением откорректированных клеток, и достоверным снижением и даже прекращение потребности в трансфузиях.72
SCD вызывается sickle мутацией в β-globin гене, которая вызывает полимеризацию гемоглобиновых тетрамеров после deoxygenation. Эти полимеры генерируют характерную серповидную форму эритроцитов, индуцируя SCD симптомы, такие как гемолитическая анемия и инсульты.80 Как наблюдалось при β-thal, преклинических исследованиях, показавших, что базирующаяся на LV генотерапия оказаться терапевтической опцией для SCD. Векторы, использованные при SCD, были сходны с таковыми, использованными при β-thal, хотя экспрессировали anti-sickling глобины, такие как плодный γ-globin,81 βT87Q82 или βAS383 мутантов, которые ингибировали deoxy-hemoglobin S (deoxy-HbS) полимеризацию. Клинические исследования у пациентов с SCD показали, что вливание HSCs, предварительно откорректированных с помощью BB305 вектора, экспрессирующего βT87Q anti-sickling глобин, приводящего к независимости от дальнейших трансфузий до 2-х лет.74 Исследования во многих центрах обнаружили крупные затруднения в развитии эффективной генотерапии у SCD пациентов, возможно из-за низкой эффективности трансдукции и плохого приживления трансдуцированных предшественников. Предприняты попытки повысить экспрессию плодного гена γ-globin, или за счет избыточной экспрессии γ-globin cDNA70 или за счет подавления экспрессии BCL11A, , следовательно, активации экспрессии плодного γ-globin84 (Table 2).
Второе семейство RBC нарушений, при которых используется генотерапия на преклинических моделях, включая эритроидные метаболические нарушения, такие как PKD (при которых затрагивается путь энергетического гликолиза) - и erythropoietic protoporphyria (EPP), которая затрагивает метаболизм гема.85
Pyruvate kinase (PK) является ферментом метаболизма, который катализирует последнюю ступень гликолиза. Дефектная активность PK т.о. нарушает клеточный метаболизм в RBCs. Мутации в PKLR86, 87 вызывают дефицит pyruvate kinase deficiency (PKD), который представляет наиболее частую гликолитическую ферментопатию. Распространенность PKD была подсчитана 1 - 9 случаев на 100000 белых людей (https://www.orpha.net/consor/cgi-bin/OC_Exp.php?Expert=766). Как и при др. RBC нарушениях, основным клиническим симптомом PKD является гемолитическая анемия разной степени тяжести. Желтуха, холестаз, спленомегалия, разные степени избыточности железа и ретикулоцитоз являются дополнительными осложнениями, вызываемые болезнью. Главная опора лечения заключается в переливаниях крови и терапии по хелации железа. В некоторых случаях может быть необходима спленэктомия. Однако, все эти лечения лишь паллиативны.88
В нашей лаб. показано, что эффективны RVs по коррекции болезни у PKD модельных мышей, и показано, что экспрессия RPK у людей способны полностью исправлять PKD фенотип, когда трансплантировали более 25% генетически откорректированных клеток.89 Сходный терапевтический порог откорректированных клеток описан у PKD Basenji собак вливаемых с помощью foamy vector-откорректированных HSCs.90 Недавно, A терапевтический и клинически пригодный LV, который оказался столь же эффективным, что и RV в лечении болезни у PKD мышей, которые были сгенерированы с нашей лаб., и показали безопасный профиль интеграции вируса в гематопоэзе мышей.91
Erythropoietic protoporphyria (EPP) является аутосомно рецессивным нарушением метаболизма porphyrin, вызываемым снижением активности ferrochelatase. Этот дефект приводит к накоплению токсических PP в эритроцитах и печени, вызывая тяжелую фоточувствительность кожи. Возможность лечения EPP с помощью клеточной терапии описана на мышах, моделирующих EPP (Fech m1pas/+).92-94 Эти авт. сообщили, что успешная генотерапия EPP осуществляется с использованием эритроид-специфических SIN-LV, несущих кДНК ferrochelatase под контролем ankyrin-1 промотора, сцепленного с мутантной формой NF-E2/AP1 последовательности HS40 элемента,95 хотя клинических испытаний не проводилось при этой болезни.

4 GENE THERAPY IN INHERITED BONE MARROW FAILURE SYNDROMES


Inherited bone marrow failure syndromes (IBMFS) представлен широким кругом болезней, при которых описаны мутации более 80 разных генов. IBMFS включает Fanconi anemia (FA), dyskeratosis congenita (DC), Diamond-Blackfan anemia (DBA), Shwachman-Diamond (SD), severe congenital neutropenia (SCN) и congenital amegakaryocytic thrombocytopenia (CAT), все они ассоциированы с дефицитом продукции клеток крови.96
IBMFS - это комплекс болезней с перекрывающимися клиническими проявлениями, при этом BMF является общим признаком и главной причиной смертности. IBMFS возникают как следствие мутаций в генах, участвующих в важных биологических функциях, таких как репарация ДНК, биогенез рибосом или поддержание длины теломер. Как и в случае с PIDs, HSCT имеют единственное лечение BMF, характерное для этих нарушений.97 Трудности нахождения HLA-совместимых доноров, вместе с рисками, ассоциированными с режимами conditioning пред трансплантациями и GVHD составляют основные ограничения HSCT при IBMFS.
Fanconi anemia (FA) наиболее частый IBMFS, мутации в любом из 22 FA генов обусловливают болезнь, при этом FANCA является наиболее частым мутантным FA геном (около 65% FA пациентов во всем мире имеют мутации в этом гене).98
Все FA белки кооперируются в общем пути, участвующим в детекции и репарации поперечных сшивок между нитями ДНК. Разрушение этого ключевого пути приводит к врожденным аномалиям, BMF и предрасположенности к раку.99 Включение fludarabine (мощного иммунодепрессантного лекарства, которое не вызывает поперечных сшивок ДНК) при conditioning режимах у FA пациентов заметно улучшает исходы у трансплантируемых пациентов.100, 101 Несмотря на это, HSCT при FA всё ещё приводят к побочным эффектам, таким как повышение показателя плоскоклеточной карциномы вероятно из-за использования генотоксических режимов conditioning и GVHD102-104.
Генотерапия рассматривается как прекрасная альтернатива HSCT для FA пациентов. Однако, трудности в разработке генотерапии FA связаны с низким количеством HSCs у таких пациентов,105 это ограничивает получение клинически пригодного количества HSCs или из BM106 или G-CSF-мобилизованного PB107, 108 от этих пациентов. Несмотря на эти затруднения, наблюдения гематологического улучшения у FA мозаичных пациентов указывает на то, что коррекции небольшого количества HSCs может быть достаточным, чтобы восстановить гематопоэз у этих пациентов.109-111 Этот феномен рассматривается как естественный процесс генотерапии, который недавно был воспроизведен с помощью ex vivo генотерапии Fanconi anemia subtype A (FA-A) CD34+ клеток, трансплантированных иммунодефицитным мышам.112 Хотя первоначальные исследования показали эффективность RVs для коррекции фенотипа FA мышиных HSCs и FA гематопоэтических клеток предшественников человека (HPCs),113-117 предыдущие испытания FA генотерапии с RVs не обнаруживали приживления откорректированных HSCs.106, 118, 119 Разные аспекты имели ограниченный успех при предыдущем испытании FA генотерапии в клинике, включая низкие количества внесенных HSCs, продолжительный инкубационный период, используемый, чтобы трансдуцировать эти клетки или отсутствие patient conditioning (see review in Reference 120).
24-часовая трансдукция G-CSF/plerixafor мобилизованных FA-A CD34+ клеток в условиях, которые минимизируют оксидативные и TNFα-индуцированные повреждения, облегчает приживление откорректированных гематопоэтических клеток у иммунодефицитных мышей.112 Важно, что эти клетки обнаруживают заметные пролиферативные преимущества со временем, демонстрируя осуществимость сохранения способности к приживлению FA HSCs после генотерапии, это указывает на то, что сходные пролиферативные преимущества могут иметь место и у FA пациентов. Недавно пначаты два разных испытания с использованием сходных FANCA LVs в США и Испании (see review in Reference 121, при этом предварительные результаты обнаруживали приживление откорректированных HSCs в испытании в Испании.122
Diamond-Blackfan anemia (DBA) это др. редкий врожденный IBMFS, который клинически, а также генетически очень гетерогенный.123 Приблизительно 55% пациентов с DBA ассоциированы со спорадическими мутациями в гене DBA.124 В большинстве случаев встречаются аутосомно доминантные мутации с неполной пенетрантностью. Такие мутации были найдены в 20 из 80 генов, кодирующих рибосомные белки (RP) человека. Мутации в RPS19125 обнаруживаются у 25% DBA пациентов. Данные EuroDBA consortium показывают, что более 90% DBA пациентов ассоциированы с мутациями, возникающими в 6 DBA генах (RPS19, RPL5, RPS26, RPL11, RPL35A и RPS24).126 В дополнение к мутациям в RP генах, два не-RP гена недавно были описаны у DBA пациентов: GATA1 и TSR2.127-130 В то время как GATA1 принадлежит семейству транскрипционных факторов с важной ролью в развитии RBCs и тромбоцитов, TSR2 кодирует белок, участвующий в процессинге 20S pre-rRNA .
Аллогенные HSCT представляют единственное лечение для пациентов с DBA. Тем не менее побочные эффекты, такие как неспособность транспланироваться и GVHD ограничивают эффективность HSCT у этих пациентов. Как сообщается при FA, наблюдения мозаичных DBA пациентов подтверждают пролиферативные преимущества восстановленных HSCs,131, 132, это подкрепляет идею, что генотерапия д. составлять подходящую терапевтическую стратегию при DBA.
Предыдущие экспериментальные исследования показали, что RVs и LVs могут корректировать характерный фенотип DBA клеток. В этом отношении, Hamaguchi et al выявили пролиферативные дефекты у эритроидных предшественников от пациентов с DBA , а также, что эти дефекты могут ослабляться после комплементации с помощью RPS19-LVs.133 После та же самая группа показала, что RV-обеспечиваемая коррекция клеток CD34+ от DBA пациентов способствует дифференцировке такх клеток в эритроциты и сообщила об их способности повторно восполняться (repopulating) у иммунодефицитных мышей.134
Исследования генотерапии, проведенные у conditional RPS19 нокдаун модельных мышей с SIN-LVs показало, что эктопическая экспрессия RPS19 предупреждает летальную BMF, характерную для этих животных.135 Поскольку эти исследования с использованием LVs, обладающих строгим SFFV промотором, были проведены в дальнейшем с более клинически подходящим EFSα-RPS19 LV.136 Базируясь на проведенных исследованиях пре-клинической генотерапии, следует ожидать, что испытания генотерапии на пациентах с DBA будут осуществлены в ближайшее время.
Dyskeratosis congenita (DC) представляет др. IBMFS, ассоциированный с мутациями в любом из 15 генов, связанных с поддержанием длины теломер.137-140 Описаны три наследственные формы болезни: X-сцепленная, аутосомно доминантная и аутосомно рецессивная. Основными проявлениями болезни являются дистрофия ногтей, лейкоплакия, гиперпигментация кожи, а также BMF, которая проявляется у 80% DC пациентов до 30 лет.141, 142 Кроме того, пациенты могут обнаруживать иммунодефицит, легочный фиброз, неспособность почек или печени и предрасположенность к myelodysplastic синдрому, острой миелоидной лейкемии и плоскоклеточной карциноме.141 X- сцепленный dyskeratosis congenita (X-DC) является одним из главных вариантов DC, и вызывается мутациями в DKC1.143 Этот ген кодирует dyskerin, компонент теломеразного комплекса.144, 145 В клетках, происходящих от пациентов с X-DC, теломеразная активность изменена вследствие дефекта в dyskerin.144
Хотя аллогенная HSCT остается единственным лечением BMF у DC пациентов, величина выживаемости, ассоциированная с трансплантациями у этих пациентов, всё ещё остается скромной.146, 147 Разработка надежной и эффективной генотерапии сможет предупредить основные осложнения, связанные с аллогенными трансплантациями.
In vivo исследования генотерапии имеют целью устранение BMF у Trf- и Tert-дефицитных мышей с использованием adeno-associated viral vectors (AAV9), несущих здоровые копии Tert.148 Хотя AAVs могут сохраняться в течение длительных периодов времени в качестве эписомных concatemers в неделящихся клетках, в делящихся же клетках AAV ДНК прогрессивно разбавляется. В исследовании Bar et al, BM клетки, экспрессирующие Tert до 8 мес. поле применения AAV.148 Однако, т.к. общее количество BM клеток было использовано для оценки экспрессии Tert, то вероятность, что эта экспрессия происходит от неделящихся BM стромальных клеток, д. учитываться. В обеих моделях существенное увеличение количества клеток крови и удлинение теломер наблюдалось в PB и BM клетках. Поверка концепции с помощью этих исследований подтвердила, что AAV9 генотерапия облегчает экспрессию Tert и может обладать потенциальным терапевтическим эффектом в отношении BMF у DC пациентов. Тем не менее вопрос безопасности, связанный с нерегулируемой экспрессией TERT, д. быть тщательно учтен перед клиническим использованием.
В то время как X-DC пациенты с мутациями в DKC1 составляют приблизительно 25% от DC пациентов, комплементация этого гена является пригодным подходом к генотерапии при DC. Однако, разные исследования показали, что трансфекция X-DC клеток векторами DKC1 не корректирует фенотип этих клеток,149-151 указывая, что обычный подход к генотерапии с векторами, экспрессирующими ген DKC1, может и не являться подходящей стратегией для лечения таких пациентов. Поразительно, небольшой пептид из dyskerin - GSE24.2 пептид - как было установлено, реактивирует теломеразу в X-DC клетках.150 Усиление активности теломеразы в клетках, леченных с помощью GSE24.2, поддерживает пролиферацию этих клеток и снижает их оксидативный стресс, и также их повреждения ДНК и скорость старения.152 Сходная версия GSE24.2 - GSE4 пептид - был разработан совсем недавно, он обнаруживает сходную эффективность.153 Недавние предварительные исследования подтвердили, что экспрессия этого пептида в клетках CD34+ из пупочного канатика человека может устранять генетический эффект в X-DC HSCs.154

5 GENE EDITING: AN EMERGING GENE THERAPY APPROACH IN HSCS


Редактирование генов означает огромный прорыв в последние годы главным образом благодаря успехам в разработке нуклеаз, способных генерировать разрывы двойной нити ДНК (DSBs) и тем самым способствуя homologous directed repair (HDR) в специфических локусах генома клеток. Три основные типы нуклеаз: ZFNs, TALEN и CRISPR/Cas9 для целенаправленного воздействия на HSCs человека. Эффективность этих нуклеаз специфически воздействует на любой регион генома, вместе с тем CRISPR/Cas9 нуклеазы часто используются в подходах по редактированию генов для лечения различных патологий, которые включают коррекцию специфических мутаций 155, knoc-in терапевтических кДНК в мутантные локусы156, инсерции терапевтических кассет в безопасные локусы гавани157, или инактивация регуляторных последовательностей, ингибирующих экспрессию специфических генов, чтобы компенсировать потерю функции мутантных генов158, 159 ( Figure 2). Редактирование генов успешно продвигается в клинику для лечения гематопоэтических наследственных болезней160-162.

Figure 2 Illustration of different gene editing strategies. A, Gene correction: the mutation (red) is replaced by a wild?type sequence (blue). B, Insertion in safe harbor loci: an expression cassette is inserted in specific safe harbor loci. The therapeutic cassette includes a constitutive promoter, the therapeutic cDNA and a polyA (pA) sequence. C, Knock?in in homologous genes: the therapeutic cDNA is inserted in the mutated locus, together with a splicing acceptor (SA) and a polyA (pA) sequence. D, Non-homologous end joining (NHEJ)?based editing: generation of insertions and deletions (indels) in the targeted gene (eg, the generation of Indels in BCL11A allows the expression of fetal globins). β-globin locus is shown, where the expression of fetal globin genes (Gγ and Aγ) are regulated by BCL11A. Mutated β-globin gene is shown as a red box [Colour figure can be viewed at wileyonlinelibrary.com]

Были разработаны разные подходы для облегчения доставки нуклеаз и донорской последовательности в HSCs человека. Электропортация, на сегодня один из наиболее часто применяемых методов для доставки нуклеаз. С др. стороны, трансдукция HSCs с не интегрирующимися вирусными векторами представляет наиболее эффективный метод доставки донорской конструкции. ZFNs и integrase-defective lentiviral vectors (IDLVs) были успешно использованы для редактирования HSCs человека.163 Хотя эффективность редактирования генов была довольно низкой в примитивных HSCs по сравнению с количествами CD34+ леток, это исследование открыло возможность использования стратегии редактирования генов для лечения гематологических нарушений. В том же исследовании было показана пригодность откорректированных BM HSCs от SCID-X1 пациентов посредством инсерции экзонов 5 - 8 из IL2RG кДНК в эндогенном гене IL2RG. Недавнее исследование показало, что коррекция гена SCID-X1 в HSCs может использоваться в качестве базирующейся на CRISPR?Cas9/AAV6 стратегии для интеграции IL2RG кДНК в эндогенный стартовый кодон этого гена.164 Дополнительные исследования подтвердили возможность редактирования CD HSCs с помощью ZFNs в комбинации с IDLVs, чтобы доставлять терапевтическую кДНК в ген β-глобина.165 Наша группа также показала фенотипическую коррекцию HSPCs от пациентов с FA за счет специфической интеграции FANCA в локус AAVS1, исвользуя сходную комбинацию ZFN мРНК т терапевтического донора IDLVs.157
Недавно использование AAVs, несущего донорскую последовательность, позволило осуществить редактирование примитивных HSCs. AAVs являются не интегрирующимися векторами, которые могут переносить или однонитчатую или двухнитчатую ДНК в качестве донорской матрицы для HDR. Среди разных AAV серотипов, AAV6 оказался особенно эффективным для трансдукции HSCs.166, 167 Т.о., AAV6 обладает высокой эффективностью редактирования гена по сравнению с IDLVs, обеспечивая эффективность редактирования генов между 20% и 40% при комбинации с соотв. разработанными нуклеазами.156, 168
Важным преимуществом в области редактирования генов стало открытие CRISPR/Cas9 нуклеаз и наблюдение, что система нуклеаз может эффективно доставляться в HSPCs путем использования рибонуклеопротеиновых (RNP) комплексов.169 Эти RNPs были реализованы путем разработки gRNAs с целью увеличения их стабильности,170 достигая тем самым высокой эффективности HDR в HSPCs.155, 171 Эти новые RNPs вместе с использованием AAV6 для доставки донорской матрицы стали важными подходами в области редактирования генов для лечения пациентов с гематологическими нарушениями.156, 172, 173 Чтобы снизить сложность редактирования генов - напр., путем отказа от обработки вирусных векторов - была использована доставка нуклеаз совместно с ssODN донорами, чтобы корректировать специфические мутации, включая SCD мутации в HSCs.155, 165
Поскольку non-homologous end joining (NHEJ) является наиболее эффективным механизмом репарации DSBs, особенно в неделящихся клетках,174, 175 то эта стратегия была использована в первом разрешенном FDA испытании редактирования генов с помощью аутологических HSCs. Это испытание имело целью лечение HIV инфекции с использованием ZFNs расщепления локуса CCR5, который кодирует рецептор HIV.176 В области гемоглобинопатий нокаут гена BCL11A (Figure 2D) - репрессора плодного глобина177 - облегчает возобновление экспрессии плодного глобина в клетках взрослых.178 Эта стратегия была вскоре использована в испытаниях по редактированию гена β-thalassemia160, 161 и SCD162.
Улучшения в области редактирования генов облегчили использование генотерапии для лечения гематопоэтических наследуемых болезней. Наиболее важным вопросом технологии редактирования генов стали эффекты вне мишеней, вызываемые изготовленными искусственно нуклеазами. В большинстве случаев лишь немногие предсказуемые in silico сайты вне мишени были проанализированы, хотя глубокий анализ последовательностей вне мишеней был необходим при клинических испытаниях редактирования генов. Разные подходы, такие как GUIDE-seq179 или CIRCLE-seq180 были разработаны для облегчения идентификации сайтов вне мишени в геноме человека. Более того, разнообразные улучшения в стратегиях редактирования генов были разработаны, чтобы снизить генерацию эффектов не мишени, включая парные Cas9 nickases,181 или высокоточные Cas9 нуклеазы.172

6 PERSPECTIVES OF HEMATOPOIETIC GENE THERAPY


Итак, клиническая эффективность и безопасность связаны с использованием новых векторов. Как это произошло с разрешением Strimvelis для лечения ADA-SCID пациентов, несколько новых подходов с медицинскими продуктами, базирующимися на генетической коррекции HSCs появятся в предстоящие годы. Споры теперь переходят в др. плоскость цены этой новой терапии и процедур для пациентов.182 Кроме того, должны быть разработаны практические процедуры, облегчающие эти новые терапевтические вмешательства, которые могут быть перенесены из академических институтов в фармакоцевтические и биотехнологические компании, способные производить эти мед. продукты в крупном масштабе и при высоко контролируемых условиях производства. При этом необходимо ограничить потенциальные побочные эффекты разработанных нуклеаз.