Последнее обновление: 01/26/2025 06:28:15  Меню и поиск на этом сайте   ЗДЕСЬ  Дополнительная информация   ЗДЕСЬ!!
WMZ: Z191701361450
WMR: R209318204033


Без рекламы только Браузер Uran (скачать )
   Visits:
ГЕНОТЕРАПИЯ РАКА



CRISPR/Cas9, нацеленная на теломеры

Cancer gene therapy by NF-κB-activated cancer cell-specific expression of CRISPR/Cas9 targeting telomeres
Wei Dai,Jian Wu, Danyang Wang & Jinke Wang
Gene Therapy (2020)

Nuclear factor-kappa B (NF-κB) является сиквенс-специфическим ДНК-связывающим транскрипционным фактором (TF) [1], который является индуцибельным TF и играет ключевую роль в иммунной реакции [2-4]. Его 5 членов могут формировать гетеро- и гомодимеры, чтобы связывать вариант последовательности ДНК, наз. κB в геноме [5]. NF-κB действует путем регуляции экспрессии своих генов мишеней путем связывания их κB сайтов [6-9]. NF-κB постоянно активирован при воспалении и раке [10-14]. Активированный NF-κB участвует в канцерогенезе, способствуя пролиферации клеток [15], ангиогенезу [16], инвазии/метастазированию [17, 18] и предохраняя клетки от апоптоза [19]. NF-κB также играет ключевую роль в поддержании стволовости раковых клеток [20].
Многие исследования продемонстрировали фундаментальную роль устойчивой избыточной активации NF-κB при хроническом воспалении и его финальном следствии раке [10, 12, 21-23]. Увеличиваются доказательства силы NF-κB как привлекательной мишени для терапии воспаления и рака [11]. Т.о., многие ингибиторы NF-κB были разработаны в последнюю декаду [9, 24, 25]; однако, они редко становятся лекарствами для клиники из-за их побочных эффектов. Эти результаты указывают на то, что терапевтическая стратегия, прямо или косвенно подавляющая активность NF-κB , непрактична. Лежащая в основе причина заключается в том, что NF-κB является обоюдоострым мечом [26, 27]. Несмотря на его вредные роли при болезнях, таких как воспаление и рак, базовая активность NF-κB обязательна для нормального функционирования клеточных функций, таких как тканевой гомеостаз и иммунитет. др. словами, современные стратегии целенаправленного воздействия на NF-κB лишены специфичности к раковым клеткам. Неконтролируемое подавление часто приводит избыточному подавлению активности NF-κB. Чтобы преодолеть это затруднение, в некоторых исследованиях изменили стратегию, сконцентрировавшись на подавлении генов мишеней для NF-κB скорее, чем самого NF-κB. Напр., D-tripeptide ингибитор DTP3 (Ac-D-Tyr-D-Arg-D-Phe-NH2), был разработан, чтобы подавлять NF-κB ген мишень GADD45β, регулируемый с помощью NF-κB анти-апоптический фактор [28, 29]. Этот GADD45β ингибитор может разрушать взаимодействие GADD45β с JNK kinase MKK7, приводя к восстановлению активности киназы MKK7 и, в конечном итоге, к JNK-обеспечиваемому пути клеточной гибели. Как результат DTP3 вызывает мощный апоптоз клеток множественной миеломы in vitro и in vivo.
Чтобы разработать новую стратегию лечения с помощью NF-κB, мы недавно предложили новый тип регулятора активности NF-κB путем комбинирования нацеленной на NF-κB ловушки и microRNA, которая может оценивать внутриклеточную активность NF-κB и экспрессировать искусственно разработанную microRNA, нацеленную на NF-κB, RelA [30]. В данной стратегии заманивающая в ловушку последовательность NF-κB слита с минимальным промотором и была использована в качестве чувствительного к NF-κB промотора (наз. DMP), чтобы контролировать экспрессию микроРНК, нацеленной на RelA. Мы установили, что этот регулятор может подавлять активность NF-κB способом самоконтроля NF-κB путем петли обратной связи. Эта стратегия позволяет преодолеть ключевую проблему традиционных ингибиторов NF-κB: использование in vivo оставалось неконтролируемым. Путем подавления активности NF-κB этот регулятор может индуцировать апоптоз раковых клеток HepG2, но не нормальных клеток печени HL7702 [30]. Кроме того, предварительное воздействие на клетки NF-κB химическим ингибитором (BAY11-7082) существенно снижается экспрессия контролируемого с помощью DMP репортерного гена, демонстрируя прежде всего специфичность к NF-κB DMP как чувствительного к NF-κB промотора [30]. Следовательно, DMP является потенциальным специфическим к NF-κB промотором, который может быть использован для разработки специфичной к раковым клеткам техники экспрессии генов. ,
Базируясь на наших предыдущих исследованиях NF-κB [31-38], мы полагаем, что постоянная активность NF-κB в воспалительных и раковых клетках может быть использована для лечения этих болезней. Эта стратегия противоречит традиционному подавлению активности NF-κB. Мы разработали вектор (Nage) для специфической для раковых клеток экспрессии генов, активируемых NF-κB. Когда вектор Nage был трансфицирован в раковые клетки, то избыточно активированный NF-κB мог соединяться с DMP и активировать экспрессию нижестоящего эффекторного гена CRISPR/Cas9. С помощью ассоциированной с нацеленной на теломеру sgRNA (TsgRNA), ко-экспрессируемой в клетках, Cas9 может расщеплять теломерную ДНК. Поврежденные теломеры индуцируют гибель раковых клеток. Путем упаковки Nage вектора в adeno-associated virus (AAV) и внутривенного введения рекомбинантного AAV (rAAV) мышам с опухолью, рост опухоли эффективно подавлялся.
Итак, NF-κB-activated gene expression (Nage), которая индуцирует гибель раковых клеток за счет использования избыточной активности NF-κB в раковых клетоках, но не в нормальных клетках. Nage состоит из NF-κB-специфического промотора, сформированного путем слияния NF-κB decoy последовательности с минимальным промотором, которые может соединяться с внутриклеточным избыточно активированным NF-κB и тем самым активировать экспрессию нижестоящих эффекторных генов зависимым от NF-κB специфическим способом. Мы впервые подтвердили специфичную для раковых клеток избыточную активацию NF-κB и протестировали специфичность к раковым клеткам вектора Nage с помощью экспрессии репортерного гена ZsGreen в разных культивируемых in vitro клетках. Затем мы продемонстрировали, что вектор Nage может быть использован, чтобы экспрессировать CRISPR/Cas9 белок только в раковых клетках. Белок Cas9 затем наводится с помощью sgRNA целенаправленно на теломерную ДНК и вызывает гибель раковых клеток. Вектор Nage, экспрессирующий Cas9/sgRNA может быть упакован в AAV и внутривенно введен, чтобы подавлять опухолевый рост у мышей без видимых побочных явлений и токсичности.