Color vision deficiency (CVD) является широким кругом сложный аномалий, затрагивающих восприятие цвета колбочками сетчатки. У людей цветное зрение является трехцветным; оно базируется на трех разных фотопигментах колбочек: L-колбочек, M-колбочек и S-колбочках [1]. Эти фотопигменты отличаются своей чувствительностью к интенсивности света: колбочки для длинных волн света (557 nm; красного), колбочки средних длин волн (530 nm; зеленых), и колбочки коротких длин волн (426 nm; голубых), соотв. [1]. Врожденные дефекты цветного зрания затрагивают 0.5-8% общей популяции и встречаются разных типов [1, 2]. Когда L-колбочки оказываются дефектными, то возникает protanopia; deutanopia возникает при потере M-колбочек, а tritanopia возникает при потере S-колбочек [2]. L-колбочки и M-колбочки кодируются двумя opsin генами: ген long-wave-sensitive opsin-1 (OPN1LW) и medium-wave-sensitive opsin-1 gene (OPN1MW), соотв., которые расположены в длинном плече Х хромосомы, тогда как гены, кодирующие S-колбочки являются аутосомными [1, 2].

Red-green цветовая слепота это наиболее распространенный дефицита светового зрения. Он обусловлен protanopia и deutanopia [2]. Это X-сцепленное рецессивное нарушение, затрагивающее 0.35% новорожденных девочек и 5% новорожденных мальчиков [2]. Yellow-blue цветовая слепота, с др. стороны, вызывается tritanopia. Это нарушение, как полагают, скорее благо-приобретенное, чем врожденное, появляется поздно в жизни с ассоциации с др. зрительными нарушениями, которые, по-видимому, затрагивают S-колбочки, такие как глаукома [1, 2]. Achromatopsia является аутосомно рецессивной аномалией всех трех типов колбочек, затрагивает одного на 30000 живых новорожденных в генеральной популяции [3, 4]. Пациенты обычно обнаруживают признаки и симптомы пониженной остроты зрения, фотобоязни, нистагм и что более важно потерю восприятия цвета.⁴ Затронутые индивиды зависят в основном от фоторецепторов палочек во время ночного и дневного зрения [5, 6]. Палочки являются чувствительными к свету фоторецепторами; в условиях яркого света палочки не очень эффективны, это приводит к развитию симптомов achromatopsia [4, 7]. Существует два типа achromatopsia: полная, также известная как палочковая монохроматия, и неполная [4, 6]. Полная achromatopsia характеризуется полным отсутствием функции трех типов колбочек (blue, red и green), приводя к тяжелым симптомам наразличимости цветов, фотофобии и к ошибкам в результите неадекватной рефрации между близорукостью и сильной дальнозоркостью, последняя превалирует [6]. С др. стороны, оставшиеся функциональными колбочки любого типа вместе с присутствием палочек приводит к неполной achromatopsia, при этом пациенты страдают от умеренных одинаковых симптомов [4, 6]. Острота зрения может быть низкой 20/200 при полной achromatopsia, тогда как при неполной achromatopsia, потеря зрения более слабая и близка к 20/80 [3, 4]. Achromatopsia является аутосомно рецессивной болезнью [3,4,5]. Кстати, мутации в одном из следующих 6 генов задействованы: activating transcription factor 6 (ATF6), cyclic nucleotide gated channel subunit alpha 3 (CNGA3), cyclic nucleotide gated channel subunit Beta 3 (CNGB3), guanine nucleotide-binding protein G(t) subunit alpha-2 (GNAT2), phosphodiesterase 6H (PDE6H) и phosphodiesterase 6C (PDE6C) [4]. Недавно открытый, ATF6 ассоциирует с функцией эндоплазматического ретикулума, более специфически с регуляцией пути реакции на неупакованные белки вместе с serine/threonine-protein kinase/endoribonuclease (IRE1) и PKR-like ER kinase (PERK), др. эндоплазматического ретикулума трансмембранные белки [8,9,10]. Остальные 5 генов известны как кодирующие компоненты каскада фототрансдукции колбочек [3, 4, 6]. Большинство achromatopsia (70-80%) обусловлены мутациями в генах CNGA3 и CNGB3, кодирующих соотв. α и β субъединиыцы фоторецепторов колбочек cGMP-gated катионовых каналов[11,12,13]. Мутации GNAT2 обясняют 2% случаев, кодируя специфичные для колбочек α субъединицы transducin, который связан со зрительным пигментом [6]. PDE6H и PDE6C , которые кодируют α' субъединицу photodiesterase колбочек, участвуют в путях фототрансдукции; мутации в этих генах менее распространены (менее 2% каждая) [14, 15]. Ранние исследования были неспособны показать существование связи между мутациями и типом achromatopsia [4]. Более поздние исследования устанавливали корреляцию между генами и специфическими формам achromatopsia. Missense мутации в GNAT2, CNGA3, PDE6H и PDE6C , как было установлено, ассоциируют с неполной achromatopsia, тогда как мутации в CNGB3 наблюдаются при полной achromatopsia [16,17,18]. (Table 1).

Table 1 Summary of the genes associated with color vision deficiencies

Хотя врожденный дефицит цветового зрения был описан как устойчивое, не прогрессирующее, пока неизлечимое нарушение, но офтальмологи предлагают несколько моделей потенциальной терапии [3, 4, 15]. Симптоматическое лечение зрения и фотофобии могут частично регулировать нарушения, используя большой мощности увеличители и специальные фильтры для очков [19]. Проводятся исследования и клинические испытания по целенаправленной терапии стволовых клеток, фармакологической терапии и генотерапии [20-25].

Целью генотерапии является изменение экспрессии генома человека для лечения наследственных болезней, рака и инфекционных болезней. Генотерапия может быть применена посредством многих процессов: замалчивания неправильно функционирующих генов, добавления новых или модифицированных генов для лечения болезней и преодоления вредных эффектов коррекцией генов, и добавления здоровых копий генов [26]. Это осуществляется с использованием технологии редактирования генов, плазмидной ДНК, вирусных векторов, бактериальных векторов или продуктов, получаемых от пациентов для клеточной генотерапии [26]. Доставка векторами является основным типом доставки продуктов, используемых в офтальмологии, особенно в генотерапии сетчатки. Это может осуществляться с помощью инъекций вирусного вектора в субретинальную полость, где векторы доставляются в клетки мишени [27]. Вирусы инфицируют пигментные эпителиальные клетки сетчатки (RPE cells), где с них транслируются соотв. белковые продукты [27]. Кроме того, вектор может быть ввдеден внутрь стекловидного тела. Однако, доставка вирусного вектора в ткань мишень не столь эффективна как субретинальное введение, хотя это и легче для применения и меньше побочных событий [27]. Adeno-associated viral (AAV) векторы наиболее распространены для продуктов ретинальной генотерапии, поскольку они не инвазивные для нейронов сетчатки, если же вводится в пространство под сетчаткой или стекловидное тело. С 5 kb материала ДНК, AAV векторы могут мешать генам получить пространство для регуляции. Перед лицом этих проблем и продукции крупных белков, protein trans-splicing (PTS) вместе с split-inteins могут спонтанно связывать полипептиды вместе с помощью пост-трансляционных процессов [28]. Split-inteins также как транс-сплайсинг белка, происходящие от одноклеточных организмов, могут запускать иммунную реакцию, если вводятся в тело человека, единственное неудобство этой стратегии [28]. Однако, исследования подтвердили, что это более эффективно, чем двойные AAV; в последнем случае два AAV генома могут формировать одну полную кассету генов [29]. Эта кассета разделена на два AAV, которые вступают в рекомбинацию, чтобы восстановить целый ген. Одной из основных проблем является длительность процесса. Более того, стратегия раздельных AAV может давать в результате укороченный белок, произведенный с помощью изолированных, не соединившихся векторов [28].

Потеря цветного зрения (CVDs) это врожденные нарушения, вызываемые мутациями виновных генов, выявленных и изученных на не-человекообразных обезьянах [30]. Пациенты, страдающие от achromatopsia не лишены клеток колбочек, хотя и лишены функции. Т.о., они всё ещё могут служить мишенями для вирусных векторов, вводимых под сетчатку, когда эти векторы могут непосредственно контактировать с фоторецепторами колбочек в макуле [27]. По этим причинам, а также благодаря беспрецедентному развитию генотерапии, проводимые испытание генотерапии предсказывают оптимистические результаты и подтверждают огромные надежды на лечение CVDs [27]. Table 2 представлены вкратце исследования, посвященные генотерапии разных дефицитов цветного зрения.

Table 2 Summary of the gene therapy studies in color vision deficiencies

Мутации CNGA3 я. наиболее распространенной причиной achromatopsia на Среднем Востоке и Китае, приходится на них около 60% случаев [31]. Некоторые животные модели были созданы для изучения характеристик этого гена. Первая из описанных моделей - это нокаутные по Cnga3 мыши, которые показали, что мутации в CNGA3 приводят к прогрессирующей гибели колбочек и последующей потере обеспечиваемой колбочками восприятия света [31, 32]. Гомозиготные мутации в гене CNGA3 у модельных овец характеризовались снижением физиологической функции кобочек [33].

Ген CNGA3 подвергался целенаправленному воздействию в нескольких испытаниях генотерапии. Модифицированные AAV векторы серотипа 5 и 8, содержащие капсиды человеческой CNGA3 ДНК, были медицински преобразованы, так что последние приобрели лучшую способность к трансдукции фоторецепторов, чем первые [34-36]. Некоторые экспериментальные исследования на выборках животных были осуществлены, чтобы оценить скорость проникновения в сетчатку векторов и успешность этой предлагаемой генотерапии. Модельные мыши, подвергались субретинальным [25, 37-40] и intravitreal инъекциям [25] вирусных векторов. Кроме того, AAV5 векторы доставлялись в субретинальное пространство глаз овец Banin et al. и Gootwine et al. [41, 42]. результатом этих исследований на животных моделях были в основном обнадеживающими. Описано восстановление функциональных и физиологических характеристик системы колбочек, что было подтверждено photopic electroretinograms (ERGs), после субретинальных инъекций [38, 40]. Подтверждено, что эти положительные результаты долговременны, т.к. сохранялись спустя 5 мес. после лечения [38, 40, 41]. Mьhlfriedel et al. осуществляли субретинальные инъекции 5х10⁹ геномов векторов в каждый глаз CNGA3-мутантных мышей с использованием двух серотипов AAV: AAV5 и AAV8 [37]. Функциональное восстановление колбочек наблюдали посредством записи вспышек ERG и наблюдалось, по крайней мере, 12 мес. после инъекции. Не обнаружено статистически достоверных отличий между двумя типами векторов (p = 0.75) [37]. Однако, более молодой возраст во время первой инъекции ассоциировал с лучшими результатами. Pang et al. и Michalakis et al. также экспериментировали с CNGA3-мутантными мышами с помощью субретинальных инъекций AAV5 [38, 39]. Сообщалось, что предупреждалась дегенерация колбочек инъекциями AAV5-CBA-Cnga3 и сохранялась экспрессия нормальных M- и S-opsin у леченых мышей , по крайней мере, в течение 5 мес. [38, 39]. Dai et al. сравнивали эффективность субретинальных инъекций AAV2 andи AAV8 у CNGA мутантных мышей [40]. Инъекции осуществляли в ранний период жизни мышей, примерно на 14 день рождения, и они содержали 10¹³ векторных геномов на mL. Отслеживаемые электроретинограммы были сняты спустя 1, 3 и 9 мес. после инъекции [40]. Наблюдалось достоверное увеличение амплитуды с помощью photopic и scotopic ERGs в обеих группах: инъекции AAV2 и AAV8 (p менее 0.01) [40]. Однако, обработанные AAV8 глаза обнаруживали более длительное сохранение желательных результатов. Кроме того, флуоресцентная микроскопия обработанной сетчатки демонстрировала сохранение M-opsin белка, по сравнению с очень небольшими количествами и неправильно расположенными M-opsin белками у не леченных [40]. 20 овец с диагностированными CNGA3 мутациями подверглись воздействию субретинальных инъекций AAV5 рекомбинантных векторов Banin et al. [41]. Оценки поведения были осуществлены несколько раз вплоть до 3 лет после инъекции. Обработанные глаза оказались способны осуществлять передвижения по лабиринту при дневном освещении, при этом время перемещения и частота столкновений были сходны с таковыми у контрольных овец (дикого типа) (p менее 0.05) [41]. Кроме того, ERG обнаруживала достоверное увеличение ответных амплитуд трехкратным увеличением интенсивности стимулов (2.5, 5 and 10 cdos/m2) (p?=?0.03). Чтобы оценить успех субретинальных инъекций у овец , Banin et al. осуществляли иммуноокрашивание и показали, что воздействие на сетчатку вызывает высокий уровень экспрессии CNGA3 белка, по сравнению с контрольными глазами и мутантными нелеченными глазами [41]. Овцы были также использованы Gootwine et al., при этом CNGA3 поврежденные животные лечились AAV5, содержащими нормальные человеческие CNGA3 гены [42]. Односторонние субретинальные инъекции 4.5 -5х10¹¹ векторных геномов на mL. Исследования реакций после инъекций с помощью ERGs выявили, что дневное зрение восстанавливалось у двух из 4-х овец [42].

К сожалению субретинальные инъекции оказались ассоциированы с некоторыми побочными эффектами, хотя этот способ доставки вирусных векторов наиболее эффективен для клеток сетчатки [25]. Чаще всего наблюдается отслойка сетчатки [25, 38]. Du et al. сравнивали эффективность и безопасность субретинальных и в стекловидное тело инъекций AAV5 и AAV8 векторов [25]. Они сообщили, что AAV8 векторы, нагруженные дикого типа CNGA3 человеческой ДНК, восстанавливают функцию колбочек, когда инъецируются в стекловидно тело и субретинальное пространство у мышей, как показывают исследования ERG спустя длительный период, до 6 мес. С др. стороны, AAV5 векторы были эффективны только, если вводились в субретинальное пространство, вообще-то это сопровождалось их низкой эффективностью трансдукции фоторецепторов, по сравнению с AAV8. [25, 34-36] Следовательно, только из стекловидного тела AAV8 , но неl AAV5 векторы могут мигрировать и проникать в сетчатку, приводя к терапевтическому результату. Не обнаружено побочных эффектов после инъекций в стекловидное тело [25].

Одним из наиболее недавних исследований стало тестирование безопасности субретинальной генотерапии у achromat пациентов [43]. 9 взрослых (8 мужчин; 1 женщина) с CNGA3-сцепленной achromatopsia, у мужчин средний возраст составлял 39.6 ± 11.9 лет, были внесены в список open-label, не рандомизированного испытания Fischer et al. Пре-клиническая безопасность, протестированная на мышах (nonhuman приматах) показала, что AAV8.CNGA3 может быть использован для введения в субретинальное пространство без особого вреда [43]. 9 пациентов согласно протоколу были подразделены на 3 группы с восходящими дозами (1х10¹⁰ векторных геномов (vg), 5х10¹⁰ vg, 1х10¹¹ vg). Безопасность AAV8.CNGA3 и переносимость пациентами были ожидаемы: анализы крови (включая иммунную реакцию), параметры витальности и обычные клинические химические тесты [43]. Получены данные об остроте зрения и протестирована чувствительность к контрастам (contrast sensitivity) и др. тесты, оценивающие разрешение, хроматичность и сигналы яркости по сравнению с базовым уровнем спустя год. Наилучшая коррекция остроты зрения (BCVA) распознавания букв перед генотерапией находилась в пределах между 34 и 50, Snellen показатель 20/200 и 20/100 и contrast sensitivity log показатель 0.1-0.9 [43]. Год спустя после односторонней субретинальной инъекции дозы AAV8.CNGA3 (each patient according to his assigned group), результаты показали среднее улучшение в 2.9 букв (95% CI, 1.65-4.13 букв, p = 0.006), и 0.33 log score of contrast sensitivity (95% CI, 0.14-0.51 log, p = 0.003). Это подразумевает лучшую остроту зрения и contrast sensitivity, включая активацию фоторецепторов колбочек у взрослых achromats, не было отмечено осложнений после инъекций [43]. Хотя это испытание проведено на небольшом количестве испытуемых, которые были проверены спустя год, авт. полагают, что лечение achromatopsia с помощью генотерапии безопасно и многообещающее для взрослых [43]. Будущие исследования смогут оценить связь ранней инициации лечения с величиной успеха.

Сегодня не рандомизированное phase 1/2 клиническое испытание для CNGA3 генотерапии на людях производится Feinsod et al. в нескольких мед. центрах (NCT02935517) [44]. Испытание всё ещё в фазе набора и будет оно завершено к сент. 2025 [44]. Планируется в 24 глаза человека с мутациями CNGA3 ввести вектор AAV2 в субретинальное пространство.

Мутации CNGB3 встречаются более часто в Европе и США, с превалированием в 50% случаев achromatopsia [31]. Животные модели с нокаутом гена CNGB3 получены на мышах и собаках; колбочки скорее редуцированы, чем полностью отсутствуют, и наблюдается прогрессирование дегенерации колбочек [31]. Многочисленные исследования по генотерапии нацелены на этот ген. Используются два основных серотипа AAV2 и AAV5. AAV5, рекомбинированный с человеческим геном CNGB3 был инъецирован в субретинальное пространство глаз 33 собак [45]. Функция колбочек в глазах CNGB3 мутантов восстанавливается после субретинальной инъекции, как показывают измерения в колбочках flicker ERGs. Эти результаты оказываются устойчивыми в течение 2.5 лет, со средним периодом наблюдения после воздействия в 1 год [45]. Глаза мышей с мутациями CNGB3 также были использованы в качестве модели для лечения векторами AAV2 [46, 47]. Функция колбочек восстанавливалась в глазах после субретинальных инъекций. Однако, побочные эффекты включают chorioretinitis и uveitis, отслойку сетчатки и образование рубцов на сетчатки в месте инъекции [45-47].

Зарегистрированы два клинических испытания на мутантных CNGB3 глазах людей: 28 участников были приглашены Dolgin et al. в нескольких мед. центрах в CША и подверглись воздействию AAV2 - CNGB3 с помощью субретинальных инъекций (NCT02599922) [47]. Кроме того, Brainbridge et al. завершили non-randomized, open-label, Phase 1/2 исследование в Moorfields Eye Hospital, which included с 23 участниками (NCT03001310) [49]. Recruitment was closed in July 2020; результаты всё ещё ожидаются [49].

Открыты многие типы , ответственных за обусловленную Gnat2 achromatopsia: одна nonsense мутация, одна крупная делеция из 2019 bp, 4 мутации сдвига рамки считывания (deletion and/or insertion) и missense мутация [50, 51]. На уровне молекулярного фенотипа, все они блокируют формирование функционального G белка, передающего сигналы или взаимодействующего со зрительными пигментами [52]. Однако, специфическая последовательность для GNAT2 achromatopsia пока не идентифицирована. В 2007, проведено успешное исследование по генотерапии, нацеленной на восстановление фоторецепторов колбочек при achromatopsia у мышей [50]. Замещение мутации (D200N), вызывающей missense мутацию проводили на мышах GNAT2cpfl3; у них не выявлено модификации реакции dark-adapted ERG , незначительное или отсутствие адаптированной к свету ERG реакции по сравнению с диким типом. Т.о., фокус был изменен на изменение адаптированной к свету ERG реакции при тестировании эффективности обработанных глаз [50]. A red-green opsin promoter of 2.1 kb (PR2.1) был выбран для создания AAV векторного генома. Мышам вводили 4х10¹⁰ vg в субретинальное пространство. Вплоть до 7 мес. возраста обработанные глаза давали ответ, при этом обусловленная колбочками ERG функция оказывалась восстановленной [50]. Более того, optometric измерения показали улучшение в обработанных глазах, которые по остроте зрения приближаются к норме. Планируются дальнейшие исследования с более общим промтором, чтобы целенаправленно воздействовать на все три типа колбочек [50].

Mancuso et al. осуществили исследование, которое включало squirrel обезьян, имевших мутации в гене L-opsin, кодирующего колбочки с длинной длиной волны[53]. 2.7х10¹³ rAAV2/5 вместе с PR2.1 и фрагментом рекомбинантной человеческой L-opsin кДНК , введенной субретинально. Обработанные обезьяны исследовались спустя 20 недель после инъекции и отмечалось восстановление трехцветного зрения, обнаруживалась blue-green и red-violet спектральная чувствительность с помощью компьютерного теста на цветное зрение [53]. Mancuso et al. посчитали, что добавление третьего типа колбочек необходимо для приобретения почти совершенного зрения [53]. Реакция на лечение сохраняется более двух лет to the treatment lasted for over two [53].

Zhang et al. исследовали генотерапию у 30 мутантных по М-колбочкам крыс [54]. Крысы обычно лишены L-колбочек; поэтому они служат модельными животными для Blue Cone Monochromacy (когда отсутствуют L и M колбочки в сетчатке человека). Крысам вводили субретинально два серотипа AAV: AAV5 и AAV8, содержащими человеческую кДНК генов L-opsin и M-opsin, соотв. [54]. Электроретинограммы снимали после инъекции, чтобы отслеживать реакцию. Авт. сообщили, что сетчатка, в которую инъецировали гены M-opsin, и не инъецировали ген L-opsin, обнаруживала достоверное усиленное восстановление функции колбочек спустя 2 мес. после инъекции [54]. Эти результаты объясняются тем фактом , что ген человеческого L-opsin оказались несовместимы с системой фото-трасдукции у крыс [54].

Сходное исследование было осуществлено Deng et al., при этом M-cone мутантные мыши подвергались субретинальным инъекциям AAV5 векторов, нагруженных человеческими генами L-opsin и M-opsin [55]. ERGs были сняты спустя 6 недель после инъекции и продемонстрировали, что была восстановлена реакция M-колбочек [52].

Gene therapy is a promising novel therapeutic modality in color vision deficiencies. Several experimental studies have been performed in animal models for the three most prevalent genes of achromatopsia: CNGB3, CNGA3 and GNAT2, along with few phase I/II clinical trials. L-opsin and M-opsin genes have also been targeted. They all showed a prolongedly maintained improvement in cone cell functionality as demonstrated by ERGs and visually elicited behavior. It has been also documented that delivering the genes in the therapy via intravitreal rather than subretinal injections could be safer. Few studies have reported a significant association between early intervention and better outcomes. The research to date is promising and is considered a great achievement in Genetic Ophthalmology. Yet, more research and time is needed before gene therapy is launched as an approved and safe method of treatment.