Глухота, одна из наиболее распространенных форм сенсорного дефицита, затрагивающая 466 миллионов человек (~6% от мировой популяции), including 34 million children (http://www.who.int/en/). Генетическая потеря слуха возникает с частотой 1 на 500 детей, объясняя ~70% врожденной нейросенсорной потери слуха [1]. В последние годы достигнут огромный прогресс в идентификации генов, участвующих во врожденной потере слуха. Кстати, 119 связанных с глухотой генов было идентифицировано (http://hereditaryhearingloss.org/), тогда как отсутствует медикаментозное лечение тяжелой потери слуха помимо трансплантации имплантов улитки. Имеется несколько терапевтических стратегий для лечения глухоты, включая добавление отсутствующих генов, коррекция генных мутаций и лекарственное лечение.

Генотерапия становится платформой для лечение генетической потери слуха [2,3,4]. Базирующаяся на вирусах генотерапия наиболее распространённая стратегия по добавлению нормальной копии гена, чья функция нарушена. Для внутреннего уха изучены разные вирусные вектора для доставки генов in vivo, включая аденовирусы [5, 6], adeno-associated virus (AAV) [7-17], helper-зависимые аденовирусы [18], телячьи AAV [10] и herpes simplex virus [19]. Среди них AAV-обеспечиваемая генотерапия обнаруживает способность восстановления функции слуха у мышей, моделирующих глухоту, с хорошей эффективностью, безопасностью и долговременными эффектами, в частности в отношении воздействия на волосковые клетки (HCs)-слуховые сенсорные клетки [12, 13, 20, 21].

Разные серотипы AAV успешно доставляются во внутреннее ухо новорожденных мышей, нацеленные на широкий крух типов клеток, включая HCs, поддерживающие клетки (SCs), stria vascularis и слуховые нейроны [20-23], предоставляя возможность лечение генетической потери слуха разного клеточного происхождения. Растет число AAVs с высокой инфекционной эффективностью, созданных для облегчения генотерапии во внутреннем ухе, в частности AAV/Anc80L65 [21].

У новорожденных мышей используются два наиболее распространенных подхода для доставки генов в улитку через мембрану круглого окошка (RW) и посредством cochleostomy. Исследования показали, что cochleostomy, которая обеспечивает доставку вирусного вектора в scala media, является наиболее эффективной для доставки вирусов во внутреннее ухо [24, 25]. Но cochleostomy у взрослых мышей демонстрирует повреждения клеток внутреннего уха, особенно наружных волосковых клеток (OHCs), приводящие к потере слуха [20]. Наше предыдущее исследование продемонстрировало, что AAV доставка посредством заднего полукружного канала (PSCC) является безопасной и эффективной для доставки во внутреннее ухо взрослых мышей [26], следовательно, PSCC могут использоваться для доставки разных AAV векторов взрослым мышам.

Базирующиеся на CRISPR-associated protein 9 (Cas9) агенты геномного редактирования обеспечивают целенаправленное разрушение или репарацию in vivo и устранение генами обусловленной болезни у модельных мышей [27-29]. Наше предыдущее исследование показало, что in vivo доставка Cas9-single-guide RNA (sgRNA) ribonucleotide protein комплексов улучшает потерянный слух у мышей, моделирующих генетическую глухоту людей [30]. CRISPR/Cas9 стало мощным инструментом для манипуляций с генами во внутреннем ухе. Посредством cation protein-обеспечиваемое редактирование генов становится безопасным из-за высокой скорости деградации белка Cas9, эффективность cationic lipid-обеспечиваемого редактирования генов не столь высока по сравнению с редактированием, обеспечиваемым с помощью вирусных векторов [31].

Наиболее широко используемая Cas9 нуклеазой является Cas9 белок от Streptococcus pyogenes (SpCas9). SpCas9 широко используется в разных экспериментах in vitro; однако, использование Cas9 в соматических тканях всё ещё ограничено из-за крупных размеров трансгенов. Поскольку размер SpCas9 больше, чем способность к упаковке AAVs, то невозможно доставлять Cas9 и sgRNA вместе с необходимыми генетическими элементами в одиночном AAV. Недавно было показано, что AAV/Anc80L65 капсиды, упаковывающие Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9)-KKH и gRNA 4.2 могут быть использованы для предупреждения аутосомно доминантной глухоты-36 (DFNA36), вызываемой гетерозиготной мутацией в TMC1 (transmembrane cochlear-expressed gene-1), моделирующей доминантную прогрессивную потерю слуха [32]. Соотв. количеством трансфекция HCs с помощью AAV/Anc80L65 приводила к избирательному и эффективному редактированию генома только мутантного аллеля, но не влияла на аллель Tmc1/TMC1 дикого типа, как у Beethoven новорожденных мышей, так и в линии клеток от глухих DFNA36 людей. нет публикаций о редактировании генов во внутреннем ухе взрослых мышей с использованием вирусной доставки. Чтобы преодолеть это затруднение мы предприняли попытку получения Cre-dependent Cas9 knockin (KI) модельных мышей. Cas9-KI мыши несут копию гена tdTomato в качестве репортера об активности Cre, контролируемого локусом Rosa26. Экспрессия гена Cas9 активируется с помощью Cre-управляемого удаления stop кассеты, обрамляемой loxP сайтами. Безопасность и успешность редактирования генома у Cas9-KI мышей была четко продемонстрирована в предыдущем исследовании [33]. При доступности Cas9-KI мышей сегодня возможно осуществлять эффективные манипуляции с генами для терапии путем простой добавки Cre и sgRNA. Cre и sgRNA могут быть упакованы в AAV, и затем инъецированы во внутреннее ухо Cas9-KI мышей, избегая тем самым системных рисков, связанных с редактированием генов [33]. Теперь мы можем точно редактировать гены в клетках мишенях, испольуя специфические серотипы вирусов.

Здесь мы исследовали пригодность AAV векторов для внутреннего уха новорожденных и взрослых мышей. После изучения 4-х AAV серотипов, мы идентифицировали AAV8-CMV-GFP в качестве эффективного и надежного вектора для трансдукции генов во внутреннее ухо мышей. AAV8-CMV-GFP обеспечиваемая высокая эффективность трансдукции в HCs, особенно в внутренние волосковые клетки (IHCs). Далее мы продемонстрировали, что AAV8-CMV-Cre могут инфицировать IHCs новорожденных и взрослых Cas9-KI мышей, приводя к активации экспрессии Cas9 и инициации редактирования гена во внутреннем ухе. Важно, что эта стратегия не повреждает HCs и не повреждает нормальный слух. Следовательно, вектора AAV8 могут активировать экспрессию Cas9 во внутреннем ухе взрослых Cas9-KI мышей безопасно и эффективно, сохраняя нормальный слух.

Итак, мы протестировали способность Cre-экспрессирующих AAV8 активировать Cas9 у floxed-Cas9 knockin мышей, и обнаружили достоверную активацию Cas9 во внутреннем ухе новорожденных и взрослых животных. Следовательно, локальное воздействие инъекции AAV8-Cre может вызвать активацию Cas9, чтобы осуществить надежное и эффективное редактирование генов во внутреннем ухе, инициируя регенерацию HCs, или развивая технику генотерапии.