В клетках эукариот вследствие образования сайт-специфических разрывов двойной нити (DSB) с помощью Cas9, один из двух репаративных процессов может иметь место: non-homologous end joining (NHEJ) или homology-directed repair (HDR) ( Figure 1) ⁷. NHEJ является процессом, склонным к ошибкам, который может вызывать мутации или инсерции нуклеотидов и делеции (indels), прерывая последовательность в гене мишени. Напротив, HDR является стратегией репарации ДНК высокой точности, поэтому репарация DSB использует гомологичную ДНК в качестве матрицы. HDR облегчена одновременным использованием гомологичной донорской ДНК вместе с Cas нуклеазой. Такая донорская последовательность может быть использована в виде синтетической матрицы для репарации Cas-индуцированных DSB. HDR могут быть использованы для прямой репарации мутантного гена, хотя и с меньшей эффективностью, чем NHEJ ⁸.

Кстати, большинство стратегий геномного преобразования для кожных болезней использует ex vivo редактирование первичных клеток, полученных от пациентов ( Figure 1) ⁹. Чтобы осуществить ex vivo редактирование, клетки пациента выделяются и генетически модифицируется in vitro, в принципе для последующей аутологической трансплантации. Эта стратегия позволяет клональную селекцию, характеризацию и экспансию генетически модифицированных клеток перед использованием для трансплантации в затронутый орган или ткань. Ex vivo подходы облегчают целенаправленное воздействие и доставку CRISPR-Cas системы и позволяют умножать модифицированные клетки, снижать потребность в высоко эффективных и специфических CRISPR-Cas редактирующих конструкциях¹⁰. Однако, размножение клеток в культуре может приводить к нежелательной клеточной дифференцировке, особенно в induced pluripotent stem cells (iPSCs) ¹¹. Кроме того, базирующиеся на клетках трансплантации могут быть технологически затруднены, особенно для non-hematopoietic клеток. В противоположность ex vivo генным манипуляциям, редактирование генов in vivo использует прямые модификации соматических клеток in situ ( Figure 1). Использование конструкций CRISPR-Cas ждя in vivo редактировании генов осуществляется посредством системных или локальных введений упакованных компонентов CRISPR-Cas (protein, DNA, and/or RNA) в тело, чтобы индуцировать редактирование гена в специфических органах или клетках. In vivo редактирование нуждается в разработке эффективной стратегии целенаправленного воздействия, чтобы генерировать специфичные для клеток изменения с минимальными эффектами вне мишени и предотвращать всестороннюю характеристику всех редактированных клеток. Безопасность технологии in vivo редактирования генов может быть пригодна для широкого круга системных и локальных болезней, но имеются и некоторые затруднения.

Большинство генодерматозов являются моногенной природы и поэтому служат в качестве привлекательной модели болезни для генотерапии¹². Поскольку не существует широко доступного эффективного лечения этих нарушений, то современная терапия концентрируеся преимущественно на устранении симптомов. Ранний успех в использовании генотерапии для лечения моногенного наследуемого epidermolysis bullosa (EB) нарушения оказался особенно многообещающим для разработки лечебной генотерапии генодерматозов. В 2006, пациент, страдающий от нелетального junctional EB (JEB) подвергся успешной долговременной трансплантации кожи с помощью эпидермальных слоев, полученных из аутологичных кератиноцитов, откорректированных по гену^{13, 14}. Эти кератиноциты были откорректированы с использованием ретровирусного вектора, кодирующего beta 3 цепочку laminin-332, компенсирующего мутантную версию гена этого пациента. Такой успех заложил основу для дальнейших исследований не только в замещающей ген терапии для кожных болезней, но и терапии с редактирование генов. В отличие от классически определеляемой генотерапии, которая связана со случайной инсерцией одного или нескольких экзогенных генов в клетки, чтобы заместить функцию отсутствующего или мутантного гена, редактирование гена - это прямые, сайт-специфические манипуляции генома с использованием прицельных нуклеаз, таких как ZFNs, TALENs, и CRISPR-Cas энзимы ( Figure 1) ¹⁵. Терапевтический потенциал прямых геномных манипуляций огромен. Исследователи разрабатывают CRISPR-Cas конструкции для разных лечебных стратегий для генодерматозов, включая целенаправленное добавление гена в специфический сайт генома, коррекцию точечной мутации, вызывающей болезнь, и удаление гена, вызывающего болезнь или геномной последовательности. Такие стратегии расширяют возможности генотерапии помимо подходов с добавлением, позволяя исправлять ген редактированием и целенаправленным 'нокаутом' мутантного аллеля при доминантно негативных нарушениях. Существует надежда, что целенаправленное редактирование гена будет снижать риски, связанные со случайными инсерциями экзогенных трансгенов.

EB. Из генодерматозов EB нарушения исследовались особенно активно в качестве потенциального кандидата генотерапии³. EB нарушения являются группой из разных наследуемых вызываемых волдыри болезней, которые затрагивают кожу, при некоторых подтипах слизистые мембраны и др. органы¹⁶. Они вызываются мутациями в более чем 20 разных генах, которые кодируют разные белки, экспрессирующиеся в зоне кожной базальной мембраны¹⁷.

Два подтипа EB - EB Simplex (EBS) и dominant dystrophic EB (DDEB)-вызываются доминантно негативными мутациями, которые не могут быть откорректированы с помощью традиционной аддитивной генотерапии. Эти нарушения особенно подходят для лечения с помощью CRISPR-Cas геномного редактирования, которое позволяет прямые модификации доминантного, болезнь-вызывающего аллеля. EBS вызывается доминантно негативными mssense мутациями генов keratin 14 ( KRT14) или keratin 5 ( KRT5), кодирующих промежуточные филаменты (IFs), экспрессируемые в базальном слое эпидермиса^{18, 19}. Kocher et al. ²⁰ используя CRISPR-Cas9-индуцированную HDR , чтобы откорректировать болезнь-вызывающие мутации аллеля KRT14 в кератиноцитах EBS in vitro. Откорректированные по гену клоны обнаруживали нормальный фенотип без характерных мутантных цитоплазматических агрегатов в культуре клеток. DDEB вызывается доминантные негативными мутациями в COL7A1, кодирующем collagen 7 (C7) ^{21, 22}. Shinkuma et al. 23 успешно использовали CRISPR-Cas9, чтобы индуцировать сайт-нацеленный мутагенез на мутантный аллель COL7A1 в iPSCs, полученных от кератиноцитов DDEB пациента. Отредактированные клетки экспрессируют укороченную версию C7, которая неспособна формировать вредные тримеры с WT C7 и должна гипотетически сделать возможным нормальное закрепление формирующихся фибрилл на DEJ ²³.

В отличие от EBS и DDEB, JEB и RDEB наследуются как аутосомно рецессивные. Следовательно, CRISPR-Cas терапия для этих нарушений может быть осуществлена с помощью коррекции генов, чтобы сделать возможным продукцию новых, функциональных белков. Это может быть выполнено посредством точной коррекции нарушающей мутации (т.e., посредством CRISPR-Cas9 индуцированного HDR с откорректированной по гену донорской матрицей) или посредством методов, которые продуцируют функциональный белок без полной коррекции мутации, вызывающей болезнь. Напр., в специфических случаях, целенаправленная делеция может быть использована или для удаления преждевременного стоп-кодона или причинной мутации непосредственно или путем разрушения сигналов сплайсинга, делающих возможным терапевтический пропуск экзона. JEB вызывается аутосомно рецессивными мутация в генах, кодирующих субъединицы гетеротримерного laminin-5 (laminin-332) белка (напр., LAMA3, LAMB3 и LAMC2) ^{24, 25}, а RDEB вызывается аутосомно рецессивными мутациями в COL7A1 ^{26, 27}. При обоих состояниях CRISPR-Cas9-обеспечиваемая HDR была эффективно использована для коррекции болезнь-вызывающих мутаций ex vivo в первичных кератиноцитах, полученных от пациента^{28- 31} и в iPSCs ³². Будучи трансплантированными иммунодефицитным мышам, откорректированные по гену кератиноциты обнаруживали восстановленную функциональность WT и адгезию на DEJ ^{29- 31}. Однако, эффективность HDR при ex vivo модификациях генов остается низкой, особенно в отсутствие протокола antibiotic section или д. методов обогащающих модифицированные клетки. Подходы по пропуску экзонов были использованы для воздействия на RDEB. Экзон 80 содержит распространенную болезнь-вызывающую точечную мутацию в гене COL7A1 ³³. Путем целенаправленной индукции Cas9-обусловленных DSBs на любой из сторон от несущего мутацию экзона 80 в COL7A1, возможно осуществить полную эксцизию болезнь-вызывающей мутации. Bonafant et al. доставляли спаренные Cas9/sgRNA RNPs в кератиноциты пациента ex vivo посредством электропортации. Они оказались способны достичь эффективной величины делеций экзона 80, генерировать клетки с восстановленной экспрессией C7, которые будучи трансплантированными иммунодефицитным мышам обнаруживали долговременную адгезию между дермой и эпидермой³⁴.

Кстати, Cas9-обеспечиваемая терапия RDEB недавно была расширена и включена в подходы in vivo, при этом Wu and colleagues³⁵ восстанавливали функцию C7 у RDEB модельных мышей, используя подход пропуска экзонов. Wu et al. разработали две sgRNAs, нацеленные на 5' и 3' сторону экзона 80 и доставляли их в виде sgRNA/Cas9 рибонуклеопротеинового комплекса (RNP) посредством внутрикожных инъекций в кожу хвоса мышей. Затем они непосредственно электропортировали хвост мыши, чтобы облегчить проникновение RNPs в эпидермальные стволовые клетки. Вызывая DSBs на любой из сторон экзона 80 в COL7A1, они оказались способны вызывать полную эксцизию болезнь вызывающей мутации в эпидермальных стволовых клетках. Электропортированные мыши обнаруживали восстановление функции C7 и их область адгезии дермы-эпидермы улучшалась с 30% до 60% после лечения³⁵. Успех этого подхода продемонстрировал потенциал CRISPR-Cas9-индукции коррекции генов в эпидермальных стволовых клетках in vivo без больших затрат и технических препятствий ex vivo модификации клеток. Однако, всё ещё существуют определенные ограничения в этом методе. Только 2% эпидермальных клеток были способны поддаться целенаправленному воздействию этого нового in vivo метода доставки и не было выявлено долговременного устойчивого эффекта от воздействия. Более того, потенциальные эффекты вне мишени от Cas9/sgRNA RNPs на любой из сторон вне экзона 80 не были проанализированы.

Epidermolytic palmoplantar keratoderma (EPPK). EPPK это аутосомно доминантная болезнь кератина из группы наследственных palmoplantar keratoderma (PPK), характеризуется аномальным утолщением кожи ладоней и подошв³⁶. Болезнь вызывается доминантно негативными missense мутациями в гене KRT9, приводит к образованию мутантного кератина 9 (K9), который вмешивается в функцию дикого типа K9 ³⁷. EPPK обладает относительно локальными проявлениями, которые очень хорошо подходят для целенаправленного воздействия CRISPR терапии.

Luan and colleagues показали, что посредством локальной доставки лентивирусного вектора, несущего sgRNA и Cas9, нацеленных на мутантный аллель KRT9, они смогли нарушить образование мутантного K9 белка in vivo у мышиной модели EPPK и вызвать фенотипическую коррекцию болезни³⁷. Мыши, получавшие 9 подкожных инъекций Cas9/sgRNA-содержащих частиц LV в их правую переднюю лапу, спустя 24 дня обнаруживали восстановление эпидермальной пролиферации в передних лапах и снижение экспрессии связанного с болезнью K9. Эффекты вне мишени от системы редактирования генома были минимальными, но анализ был ограничен 10 предполагаемыми сайтами проявлений эффектов вне мишени в геноме мыши³⁷. Кроме того, долговременные эффекты лечения мышей не установлены и поэтому не анализировали потенциальные иммунные реакции на LV Cas9 вектор - возникновение которых было описано для др. LV векторных систем³⁸. Тем самым продемонстрированы мощные in vivoэффекты CRISPR-Cas9 в редактировании генов.

CRISPR-Cas энзимы обладают потенциалом целенаправленного воздействия на латентные вирусы, способные избегать уничтожения с помощью иммунного надзора и стандартной антивирусной терапии. Были проведены обширные исследования способности CRISPR-Cas систем целенаправленно воздействовать на специфические геномные последовательности вирусов, делающие возможным целенаправленное разрушение и даже полное уничтожение компонентов вирусного генома³⁹. Кроме того, исследователи выявили высокую чувствительность определенных Cas энзимов для детекции вирусных патогенов в выборках тканей человека⁴⁰. Cas12 и Cas13 - два Cas энзима, которые демонстрируют неразборчивость в транс-разрезании ssDNA, если активированы своими guide-complementary target nucleotide sequence - способные к ультра-чувствительной детекции нуклеиновых кислот вирусных biosensing систем. таких как DETECTR ⁴¹, SHERLOCK/SHERLOCKv2 ⁴² и HOLMES/HOLMESv2 ^{43, 44}.

Многие CRISPR-опосредованные антивирусные исследования были сконцентрированы на системных вирусах, лишенных участия в коже, уникальная общедоступность кожи подтверждает, что CRISPR терапия и диагностика могут быть более эффективными при использовании кожных вирусов. Современные исследования подтвердили, что CRISPR-Cas технология может быть эффективной в детекции и модификации человеческого папиломавируса (HPV), herpes simplex virus (HSV) и Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV).

HPV. HPV является dsDNA вирусом, который инфицирует базальные клетки многослойного эпителия. Здесь вирус обнаруживает потенциал интегрировать вирусную ДНК в геном хозяина. Белки HPV E6 и E7 являются линиями с определенным высоким риском, включая 16, 18, 31, 33, вызывать злокачественные трансформации эпителиальных клеток путем инактивации p53 и Rb, соотв.^{45, 46} и могут приводить к anogenital сквамозным раковым опухолям и др. новообразованиям. Экспрессия E7 из линий HPV с низким риском, особенно из линий 6 и 11, связана с неконтролируемой пролиферацией эпителиальных клеток, которые вызывают остроконечные кондиломы (genital warts)^{47, 48}.

Несколько исследователей эффективно использовали CRISPR-Cas9, чтобы нарушить гены E6 и E7 в клетках цервикального рака, как in vitro , так и in vivo на животных моделях^{44- 46, 49- 51}. Одним из первых клинических противовирусных испытаний у людей стало использование in vivo целенаправленного воздействия на E6/E7 в HPV-инфицированных неопластических клетках шейки матки⁵².

Немного исследований было осуществлено с целью использования CRISPR-Cas для лечения дерматологических проявлений HPV, исследователи начали разрабатывать CRISPR-Cas конструкции, нацеленные на вирус в HPV-ассоциированных анальных раках и остроконечных кондиломах. Hsu et al. ⁵³ были способны успешно снизить массу опухоли у мышиных моделей HPV-16-ассоцированных анальных раков. Используя adeno-associated virus (AAV) вектор, они доставляли Cas9 нуклеазу совместно с двумя gRNAs: одна gRNA, специфичная для HPV-16 E6 , а др. специфичная для HPV-16 E7. Будучи доставлена посредством трех инъекций в опухоль в течение недели мышам с полученными от пациентов ксенотрансплантатом HPV-16 клетками анального рака, CRISPR-Cas9 и dual-gRNA вызывали двухкратное снижение объема опухоли, подтвердив правильность концепции новой in vivo стратегии редактирования генов для HPV-16-ассоциированных анальных раков. Для HPV-вызываемых остроконечных кондилом CRISPR-Cas9 был использован успешно путем прицельного воздействия на ген E7 in vitro, что способствовало апоптозу HPV-6 и -11-инфицированных линий клеток кератиноцитов⁵⁴. Однако, Cas9 и gRNAs обнаруживали временную трансфекцию в линиях клеток кератиноцитов и приводили лишь к неполной деактивации E7. Кроме того, эффективность конструкции геномного редактирования не была подтверждена in vivo.

CRISPR-Cas системы обладают потенциалом не только терапии HPV, но и HPV диагностики. DETECTR является системой biosensing нуклеиновых кислот, которая использует энзим Cas12a и ssDNA схему флуоресцентной маркировки для идентификации специфических последовательностей в амплифицированной dsDNA из выборок от людей⁴¹. Chen et al. ⁴¹ показали, что при использовании их DETECTR платформы, они смогли выявить человеческую ДНК papillomavirus (HPV) в выборках анальных мазков от пациента с attomolar точностью, даже оказалось возможным определять различия между разными генотипами вируса. Более того, их подход был осуществлен спустя один час и использовал только изотермальную амплификацию ДНК, подтвердив, что DETECTR может служить в качестве быстрого, дешевого, point-of-care метода детекции HPV с чувствительностью и специфичностью, сходной с обычным диагностическим PCR.

Herpesviruses. Вирусы герпеса являются крупными dsDNA вирусами, которые присутствуют в течение всей жизни у людей^{55, 56}. HSV-1 и HSV-2 классически инфицируют ротовой и генитальный слизистый эпителий, соотв.. приводя к локальной продукции язв. После прохождения частичной очистки с помощью иммунной системы хозяина, HSV обусловливают латентную инфекцию в форме эписомных ДНК в сенсорных ганглиях. KSHV или человеческий herpesvirus 8, инфицирует эндотелиальные клетки человека и является причиной Kaposi's саркомы⁵⁷. Подобно HSV и др. вирусам герпеса, KSHV остается латентным в большинстве инфицированных клеток. Латентные инфекции герпеса избегают иммунологического надзора за счет ограничения транскрипции вирусного гена⁵⁸ и поэтому её трудно лечить.

В качестве обычной терапии, нацеленной на репликацию вирусов, терапия неэффективна против латентных вирусов, CRISPR-обеспечиваемое целенаправленное воздействие на вирусную ДНК выступает в качестве альтернативного подхода при HSV, KSHV и др. вирусах герпеса. Roehm с колл.⁵⁹ оказались способны полностью устранить репликацию HSV-1 в фибробластах человека in vitro с помощью разрушения двух существенных генов вирусов, используя CRISPR-Cas9. Др. исследователи достигли сходного успеха против HSV-1, подавляя репликацию вирусов in vitro в клетках олигодендроглиомы и эпителиальных клетках с использованием Cas9/gRNA редактирующих комплексов без доказательств эффектов вне мишени^{59, 60}. При KSHV, исследователи продемонстрировали способность снижать массу KSHV в латентно инфицированных эпителиальных и эндотелиальных клеточных линиях с помощью AAV-CRISPR-Cas9-обусловленного нарушения KSHV с помощью latency-associated nuclear antigen (LANA) ⁶¹.

Пока проблемы всё ещё остаются в использовании CRISPR-Cas против вирусов герпеса. Во-первых, несмотря на продемонстрированную способность устранять активную репликацию вируса HSV-1, необходимо удостовериться, что CRISPR-Cas действительно может эффективно использоваться для искоренения латентного HSV-1 в нейронах ⁶². Oh et al. оказались способны разрушать молчащие HSV-1 геномы, но в значительно меньшем количестве по сравнению с HSV-1 вирионами в литическом цикле⁶³. Поскольку др. целевые нуклеазы, таки как MNs,, как было установлено, успешно целенаправленно воздействуют на латентную инфекцию HSV-1⁶⁴, то подозревается, что современная неспособность элиминировать латентный HSV-1, используя CRISPR-Cas9, может быть обусловлена эпигенетическими модификациями латентного генома HSV-1, которые блокируют активность Cas9^{62, 65}. Более того, дальнейшая демонстрация эффективности anti-HSV и anti-KSHV CRISPR-Cas систем in vivo также будет очень важной. Для HSV-1 и -2, доставка in vivo может быть проще, чем для др. систем, поскольку латентные HSV-1 и 2 обладают очень специфическим тропизмом для тройничного и крестцового ганглиев, соотв. и возможно стратегии доставки будут разработаны специфически для содержания именно в этих ганглиях.

Помимо вирусных инфекций, CRISPR-Cas технология также обнаруживает обещающие перспективы против резистентных бактериальных инфекций^{66, 67}. Бактериальные инфекции, резистентные к обычным антибиотикам, представляют растущую проблему здравоохранения^{68, 69}. Все же, несмотря на этот риск, продолжают предписывать антибиотики⁷⁰, тогда как разработка новых противомикробных средств для новых патогенов задерживается⁷¹. Недавно, CRISPR-Cas противомикробные средства появились в качестве новой стратегии лечения против бактериальных инфекций^{66, 67}. В частности, CRISPR-Cas9 была использована избирательно для удаления генов антимикробной резистентности из популяции бактерий, повторной сенсибилизации бактерий к обычным противомикробным средствам^{72, 73}. Однако, системы доставки, базирующихся на CRISPR антимикробных средств, составляют проблему, доступность кожи позволяет доставлять конструкции CRISPR посредством обычных лекарственных форм для наружного применения⁶⁶ и помещает кожные бактериальные инфекции на передний фронт CRISPR антимикробных исследований.

Staphylococcus aureus. Staphylococcus aureus, ширроко распространенный кожный бактериальный патоген, известный своей устойчивостью к антимикробным средствам, он ответственен за 76% от всех инфекций кожи и мягких тканей⁷⁴ и связан с высокой заболеваемостью и смертностью⁷⁵. Устойчивость к антимикробным средствам S. aureus продолжает обнаруживать и как патогеном начиненные плазмиды и др. мобильные генетические элементы, которые наделены генами антимикробной устойчивости и вирулентности⁷⁶. Более того, вспышки остаются широко распространенными, т.к. патоген сохраняет высокое преобладание в популяции, бессимптомно колонизируя ноздри 20-30% здоровых взрослых людей⁷⁷.

Bikard с колл.⁷² разработали новый подход к целенаправленному воздействию на вирулентные линии S. Aureus, используя CRISPR-Cas9. Они разработали gRNAs, нацеленную на специфический ген устойчивости к антимикробным S. Aureus , включая ген резистентности к methicillin, mecA. Когда Cas9 доставляется посредством фаговой капсиды в смешанную популяцию бактерий in vitro, то эта конструкция gRNA/Cas9 способна искоренять резистентные линии S. Aureus и полностью удалять специфические плазмиды, несущие ген резистентности к антимикробным средством. Более того, когда доставляется локально мышиным моделям колонизации на коже S. Aureus in vivo, то эти конструкции gRNA/Cas9 оказываются способными существенно снизить колонизацию резистентных бактерий. Эти результаты демонстрируют возможность локального использования CRISPR против устойчивости к антимикробным средствам in vivo и закладывают основы для будущих multiplexed CRISPR антимикробных разработок для одновременного целенаправленного воздействия на несколько бактериальных видов или множественные генные последовательности внутри одной и той же бактерии.

Некоторые первые CRISPR-Cas клинические испытания у людей касались иммунотерапии рака, включая меланому и non-small-cell рак лёгких (NSCLC)⁴. Многие из этих исследований были сконцентрированы на использовании редактирования генов, чтобы инактивировать ключевые иммунные checkpoint ингибиторы, такие как белок-1 запрограммированной клеточной гибели (PD-1) и cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4 (CTLA-4) - два белка, которые обычно подавляют противо-опухолевые цитотоксические эффекты эндогенных и экзогенных T клеток⁷⁸.

Меланома хорошо известна как обладающая исключительным иммуногенным потенциалом, благодаря в основном высокому количеству мутаций генов, которые управляют формированием стимулирующих иммунитет нео-антигенов⁷⁹. Т.о., при оптимальных условиях клетки меланомы особенно чувствительны к деструкции с помощью иммунной системы человека⁸⁰. Пока клинически микроокружение опухоли при меланоме обладает очень высокой иммуносупрессией⁸¹, а продвинутая болезнь обладает исключительно плохой реакцией на лечение⁸². Поэтому меланома выступает в качестве идеальной мишени для иммунотерапии, нацеленной на уменьшение иммуносупрессии со стороны опухли.

Первое испытание на людях, нацеленное на тестирование CRISPR-Cas при меланоме, основывалось на продемонстрированном успехе предыдущих иммунотерапий, включая PD-1 ингибиторы⁸³ и T клетки, трансдуцированные по NY-ESO-1 T-клеточному рецептору (TCR)⁸⁴. В частности, исследователи намеревались амплифицировать терапевтические эффекты уже подобных существующих подходов с использованием CRISPR-Cas9 нокаута гена PD-1 в аутологических NY-ESO-1 TCR-трансдуцированных Т клетках. Аутологические T клетки впервые были взяты от пациента и трансдуцированы с помощью LV вектора, экспрессирующего NY-ESO-1 TCR, подготовив из для распознавания высоко иммунногенного NY-ESO-1 антигена, экспрессирующегося в клетках меланомы⁸⁵. Они затем были электропортированы с RNA-guided CRISPR-Cas9 нуклеазой, подготовленной для нарушения экспрессии как PD-1, так и эндогенных субъединиц TCR, TCRα и TCRβ⁴. Разрушение PD-1 предупреждает передачу иммунитет супрессирующих сигналов и блокирует эндогенные субъединицы TCR, подавляя аберрантные иммунные реакции, что может быть результатом TCR-обусловленного целенаправленного воздействия на неизвестные антигены. При повторном внесении этих нацеленных на меланому, immune-avid T клеток, исследователи надеялись получить более мощную опухоль-специфическую иммунную реакцию - реакции, которую трудно было получить при предыдущей Т-клеточной терапии солидных опухолей8⁶. Более того, помимо усиления противо-опухолевого эффекта, предполагалось, что такой подход будет также минимизировать нежелательные побочные эффекты. Используя такую модель воздействия, оказалось, что блокада PD-1 ограничена специфическими TCR-трансдуцированными T клетками, которые предназначены для to home to и атаки на экспрессирущие NY-ESO-1 клетки меланомы. Это выступает контрастом к традиционным антителам к anti-PD1 рецептору, которые если применяются системно, то обнаруживает потенциал затрагивать Т клетки более широко и вызывать широко распространенные иммуногенные побочные эффекты⁸⁷.

Существует множество др. моногенных кожных заболеваний и кожных инфекций, которые могли бы подвергнуться CRISPR-Cas терапии. Pachyonychia congenita и xeroderma pigmentosum были подвергнуты целенаправленной базирующейся на RNAi, терапии⁸⁸ и designer nuclease ⁸⁹, соотв. Более того, с появлением гипоиммунногенного универсального донора iPSCs-iPSCs, который был генетически модифицирован с помощью CRISPR-Cas9, чтобы избегать реакции со стороны иммунитета хозяина^{90, 91} - существующая ex vivo стратегия генных модификаций генодерматозов может быть использована более широк среди пациентов.

Существует множество кожных вирусов, которые могут стать многообещающими мишенями для технологий по редактированию генов, включая онковирусы, Merkel-cell polyomavirus (MCPyV) и человееский T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1). MCPyV вызывает до 80% Merkel cell carcinomas (MCC) и случайно интегрируется в разные места опухолевого генома MCC⁹². Удаление MCV из MCC опухолевых клеток может представлять собой потенциальную рерапевтическую стратегию для агрессивных MCCs, которые часто устойчивы ко многим современным терапевтическим воздействиям^{92- 94}. Предварительные исследования раковых клеток дтгтт клеток Merkel продемонстрировали, что CRISPR-Cas9- обусловленные нарушения MCPyV опухолевых антигенов приводят к уменьшению клеточного роста⁹⁵. HTLV-1, ретровирус, который вызывает HTLV-1-ассоциированную, тропическую спастическую миелопатию и взрослых Т клеток лейкемию и лимфому, теперь используется в качестве мишени для CRISPR-Cas терапии. Исследования в основном сфокусированы на HIV ^{96- 99} - сходным образом структуированном ретровирусе -которые позволяют предположить, что HTLV-1 может сходным образом быть полностью удален из инфицированных клеток, используя CRISPR-Cas9. Относительная генетическая консервация HTLV-1 относительно HIV-1 ¹⁰⁰ позволит сделать его даже более привлекательным кандидатом для целенаправленного воздействия с помощью RNA-наводимых нуклеаз.

Наконец, CRISPR-Cas технология будет, скорее всего, разрабатывать клинические возможности для диагностики дерматологических болезней. Диагностическая платформа CRISPR-Cas , использующая Cas9 ¹⁰¹, Cas12 ^{41, 43, 102}, Cas13 ⁴² и Cas14 ¹⁰³ обладает потенциалом революционизировать детекцию последовательностей нуклеиновых кислот, делая подходы более чувствительными, более дешевыми и портативными для детекции кожных вирусов и одноточечных мутаций в кожных опухолях ^{103, 104}.

Остаются некоторые проблемы для широкого использования CRISPR терапии. Проведенные исследования в основном демонстрируют способность CRISPR-Cas системы лечить болезни людей как на моделях клеточных культур, так и посредством ex vivo модификаций первичных клеточных линий от пациентов. Поскольку такие методы сегодня предоставляются безопасными подходами к редактированию генов у людей, но такие техники являются технологически проблемными и ограниченными в использовании в обычной клинической практике. Возможности лечения in vivo были бы идеальными, но лишь некоторые исследования используют эту возможность. Исследования не кожных нарушений in vivo, включая мышечную атрофию Дюшена^{105- 107}, наследственные болезни печени ^{108- 110,} врожденные глазные болезни¹¹¹ и болезнь Хантингтона¹¹² демонстрируют огромные возможности на модельных животных. Однако, исследования в дематологии сконцентрированы на in vivo доставке CRISPR-терапии, все они ограничены локальными эффектами на мышиных моделях и ни одна не продемонстрировала высокой эффективности или успешности в смысле долговременных эффектов^{35, 37, 53}.

При редактировании генома in vivoс помощью CRISPR-Cas технологии важен перенос в клинику, имеется этому несколько крупных препятствий. CRISPR-Cas guide RNAs и нуклеазы должны 1) быть оптимизированы для специфических воздействий на мишень с минимальными эффектами вне мишени, 2) эффективно доставляться к специфическим клеткам человека и 3) обладать минимальными антигенными свойствами, чтобы воспринимались иммунной системой человек¹¹³. Новые CRISPR-Cas энзимы и системы доставки разрабатываются для преодоления этих препятствий. Чтобы улучшить специфичность CRISPR-Cas9, иследователи модифицируют конструкцию Cas9¹¹⁴, оптимизируют дизайн sgRNA¹¹⁵, и разрабатывают подходы с двойными CRISPR-Cas9 никазами¹¹⁶ , которые вызывают только один разрыв одиночной нити в сайте мишени. Кроме того, исследователи разрабатывают чувствительные методы сканирования всего генома для выявления непреднамеренных вне мишени геномных эффектов, включая GUIDE-Seq ¹¹⁷, Digenome-seq ¹¹⁸, SITE-seq ¹¹⁹, CIRCLE-Seq ¹²⁰, и сосвсем недавно VIVO¹²¹. Эти методы д. позволить скрининг эффектов вне мишени для данной Cas/gRNA конструкции до использования терапии.

Новые методы доставки также исследуются, чтобы расширить традиционные AAV- и LV-ассоциированные системы доставки. Методы доставки генов вирусными векторами обладают потенциалом вызывать интеграционный мутагенез и экспрессию в течение все жизни Cas9 в клетках. Поэтому доставка Cas9 нуклеазы с помощью временно экспрессирующегося Cas9/sgRNA RNP может быть предпочтительной. Ученые разрабатывают липидные наночастицы, которые могут переносить CRISPR-Cas нуклеотидные последовательности или RNP комплексы, которые нацелена на специфические органы^{122- 124}. Пока всё ещё затруднительно осуществить системную доставку таких терапевтических средств, особенно при врожденных нарушениях крови, которые нуждаются в доставке CRISPR-Cas конструкций в каждую циркулирующую B или T клетку³⁹.

Наконец, чтобы ограничить возможные иммунологические реакции на Cas9 за счет предварительно сформированных антител в сыворотке человека¹²⁵, исследователи открывают новые Cas энзимы, такие как структурно отличающиеся Cas12e и Cas12d из почвенных бактерий¹²⁶. Для них не должен пред-существовать иммунитет.

Though significant work remains to be done prior to its widespread therapeutic use in humans, preliminary research suggests great potential for CRISPR-Cas technology in the treatment of dermatological pathologies. As researchers continue to optimize delivery methods and off-target screening approaches, more human trials for the treatment of dermatologic diseases with CRISPR-based gene editing therapeutics will likely be initiated.