В последнее время совместно используются последние техники редактирования генов и технологии, способные индуцировать плюрипотентность стволовых клеток за счет механизмов репрограммирования. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) обладают огромным потенциалом, включая возможность преодоления этических проблем и проблем безопасности, связанных с использованием эмбриональных стволовых клеток [1]. Кстати, это шанс получения линий клеток человека за счет минимально инвазивной техники, такой как пункционная биопсия кожи, волосы, выборки мочи или крови, а также сбора ворсинок хориона и выборок амниотической жидкости, что облегчает получение человеческих iPSCs (hiPSCs) [2-5]. Следовательно, сегодня эти клетки используются, для обширных исследований, касающихся как здоровых, происходящих от донора, так и болезненных линий клеток. Фактически, hiPSCs могут обладать фенотипами, близкими к человеческой патологии , так что они могут представлять подходящую модель клинической болезни и в некоторых случаях, более предсказуемую, чем доступные на сегодня клетки, происходящие от животных или опухолей [6]. hiPSCs способны отражать физиологию, патофизиологию и фармакологическую чувствительность пациента, имитируя человеческие органы и их микроокружение, особенно культивирование осуществляется при условиях, воспроизводящих тканевую архитектуру в мультиклеточных сфероидах или органоидах [7]. Итак, эти свойства вместе с сопутствующими недавними доказательствами паракринных эффектов hiPSCs [8], делают эти клетки идеальным кандидатом, способствующим эндогенной регенеративной репарации или замещению поврежденной ткани после клеточной трансплантации, поддерживая генетический фон пациента и ограничивая иммунное отторжение, с целью лечения болезни более персонализованным способом [8, 9].

Недавно использование hiPSCs часто оказывалось ассоциированным с использованием редактирования генов, с целенаправленным воздействием на ген, вызывающий болезнь, чтобы изучить патофизиологию более глубоко, производить скрининг по поиску лекарств и увеличивать терапевтический потенциал [10].

Действительно наиболее мощный инструмен редактирования генов связан с clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR) и CRISPR-ассоциированным белком (CRISPR/Cas9). Его можно рассматривать как наиболее мощная и многосторонняя технология как для редактирования генов, так и транскрипционного контроля, но и также для эпигенетической модуляции. Её соединение с hiPSCs имеет огромное значение для научных исследований [11].

Fig. 1 Workflow of the research involving hiPSCs and CRISPR/Cas9 gene editing for the investigation of new drugs and therapeutic alternatives

Вскоре после распространения технологии репрограммирования, стали получать модели болезней за счет использования hiPSCs для тестирования нескольких лекарств кандидатов для разных патологий. Это ускорило процесс перехода к клиническому использованию определенных компонентов, особенно, если они ранее были использованы для лечения др. болезней, к улучшению идентификации возможных мишеней и лекарств, а также к оптимизации отбора и стратификации участников испытаний [11]. Однако, hiPSCs представляют собой успешный метод когда они воспроизводят моногенные болезни, хотя они всё ещё имеют ограничения в случае спорадических нарушений, при которых внешне-средовые факторы могут вносить вклад в возникновение мутаций de novo [9, 12]. Др. проблема возникла при воспроизведении нарушений с поздним началом, поскольку дифференцированные клетки из hiPSCs имели свойства плодных клеток, так что оказалось необходимым внесение клеточного старения [13, 14].Кроме того, эпигенетический статус индивидуальных клонов hiPSCs может испытывать влияние со стороны факторов условий культивирования во время процесса репрограммирования [12].

Шансы получения hiPSCs изогенных клеточных линий гарантируют становление генетически определенных условий, преодолевающих генетические вариации фона между пациентами и контрольными hiPSCs, а также любые др. переменные, обусловленные возрастом и полом. В этом случае доступны все границы контроля, чтобы обеспечивать (дикого типа (WT)-hiPSCs, hiPSCs от пациентов и откорректированные hiPSCs от пациентов) оценку результатов скрининга лекарств [9, 10].

Первый hiPSCs крупномасштабный скрининг лекарств был осуществлен в 2009, когда специфические для пациентов hiPSCs были использованы для моделирования familial dysautonomia (FD, OMIM #223900), периферической нейропатии, связанной с дегенерацией аутосомных и сенсорных нейронов, вызываемой точечной мутацией в IkB kinase complex-associated protein (IKBKAP8), приводя в тканях к специфическим дефектам сплайсинга. Lee с колл. [15] обнаружили три важных параметра FD посредством моделирования болезни с помощью hiPSCsl. Затем они тестировали некоторые из кандидатов лекарств и пришли к открытию, что kinetin растительный гормон может уменьшать патологические проявления [15].

Этот клеточный подход позволил оценить несколько соединений для разных болезней и были проведены многочисленные тесты скрининга на hiPSCs, для тестирования как эффективности, так и токсичности разных соединений. Некоторые из самых последних скринингов лекарств на hiPSCs суммированы в Table 1.

Table 1 Latest hiPSCs drug screening

Недавно были начаты испытания с целью тестирования клинической эффективности Bosutinib, a Src/c-Abl ингибитора [26], идентифицированного как молекулы кандидата для целенаправленной терапии amyotrophic lateral sclerosis (ALS, OMIM #105400). Src и Abl являются тирозин киназами, связанными с пролиферацией, апоптозом и ангиогенезом; они рассматриваются как мишени для целенаправленной терапии рака [23]. Разные исследования продемонстрировали, что некоторые проникающие в головной мозг тирозин киназные ингибиторы могут ослаблять проявления нейродегенеративных болезней, ассоциированных с агрегацией белков [27, 28]. Перед началом клинических испытаний осуществили скрининг лекарственных фенотипов существующих Src/c-Abl ингибиторов, используя двигательные нейроны, генерируемые из hiPSCs пациентами с ALS [23]. Это исследование привело к переориентированию базирующихся на hiPSC лекарств, т.к. Bosutinib уже был одобрен Food and Drug Administration (FDA) для лечения chronic myelogenous leukemia (CML, OMIM #608232) [26]. Кстати, упомянутое испытание было проведено для оценки эффективности, безопасности и переносимости Bosutinib в комбинации с физическим состоянием ALS пациентов, т.к. это лекарство может вызывать некоторые побочные эффекты [26, 29].

Были предприняты многие попытки снизить цену разработки лекарств и ускорить процесс поиска новых инструментов, которые бы позволили предсказывать побочные эффекты лекарств, а также тестировать новые лекарства, гарантирующие пригодность и воспроизводимость результатов лечения этими лекарствами [30]. Идеальное устройство д. обладать всеми этими свойствами, не пренебрегая генетическими и эпигенетическими вариациями, а также внешне-средовыми факторами и др. ситуациями, которые в принципе могут способствовать увеличению уровня сложности фармакоцевтического тестирования, такого как межлекарственные взаимодействия [6].

Внимание сегодня сфокусировано на Organ-On-a-Chip (OOC) технологии. Это двумерное или трехмерное микрожидкостное (microfluidic) устройство из преобразованных биоматериалов с внеклеточным матриксом, позволяющее воспроизводить и наблюдать поведение клеток человека, от адгезии до миграции и от репликации до дифференцировки [6]. OOC состоит из ряда microfluidic канальцев, через которые периодически пропускают биологические жидкости, содержащие питательные вещества, биологические факторы и лекарства контролируемым способом [6]. Кроме того, эта технология может комбинироваться с автоматизированным компонентом мониторинга микроустройства, это делает возможным повторные измерения физиологических параметров для оценки эффектов и токсичности лекарств. OOC может быть сконструировано с использованием hiPSCs, это повышает шансы построения персонализованной платформы для тестирования лекарств, обеспечивая эффективную оценку человеческой патофизиологии, специфически приспособленной к каждому пациенту [6]. Во всяком случае OOC технология характеризуется некоторыми ограничениями, включая технические проблемы по изготовлению этих устройств, а также цену и неполноценность получаемых человеческих материалов. Более того, устройство д. предоставлять возможность репликации фунционального органа, т.е. обеспечение адекватного роста и дифференцировки тканей человека. Это может представлять определенный риск, поскольку использование определенных факторов роста и реагентов для дифференцировки, необходимо для определенного типа клеток и могут оказывать неблагоприятные эффекты на др. типы клеток [6].

Одной из сильных сторон hiPSCs является их использование не только для target-based скрининга, но и для фенотипического скрининга. В последние годы фенотипические скрининги подверглись переоценке, какие же hiPSCs вносят вклад, больше всего, т.к. они обладают легким доступом ко многим типам клеток, связанных с болезнью, особенно с теми, которые трудно заполучить [31, 32]. Напр., фенотипический скрининг при исследованиях боли всегда тормозится невозможностью получения достаточного числа типов нейрональных клеток [33]. Сегодня сенсорные нейроны могут быть получены из hiPSCs, и они могут быть использованы для разработки функционального метода нейрональной возбудимости, чтобы потом использовать для оценки фенотипических эффектов субнабора small-targeted validation compound [33]. Позднее, hiPSCs стали фундаментом для разработки 3D платформы из человеческих стволовых клеток, чтобы осуществлять скрининг кортикальных органоидов с помощью высоко-производительного скрининга (HTS) [34]. Путем сборки репрограммирующей технологии с использованием отображения высокого разрешения (high content imaging) оказалось возможны получать Serum-Free Embryoid Bodies (SFEBs) и затем определять выросты нейритов и клеточный состав. Таким способом, были проведены детекция морфологии нейритов и анализ мульти-электродного массива [34]. Этот подход оказался способным оценить идею подсчета экспериментальной изменчивости, распространенную в 3D культурах; это исследование обеспечило связь SFEBs и базисной линии HTS для фенотипического скрининга лекарств [34].

Редактирование генов в качестве инструмента модификации генома, позволяет корректировать, записывать или удалять генетическую информацию в специфической последовательности ДНК. Сегодня доступные устройства для редактирования ДНК предоставляют беспрецедентную возможность легкости и точности [35]. Оно предоставляет возможность репарировать предполагаемое причинное повреждение в клетках, получаемых от пациента или для внесения им клеток, происходящих от здоровых индивидов, идентифицируя тем самым мутации, участвующие в предопределении болезненного фенотипа [36].

В 1970s - 1980s, было изучено несколько методов изменения специфических локусов ДНК, когда геномные изменения касались дрожжей и мышей, используя подход целенаправленного воздействия на гены, базирующийся на процессе гомологичной рекомбинации (HR) [37]. Недавние успехи повысили эффективность редактирования генов и навыки индукции целенаправленно вызывать разрывы двойной нити ДНК (DSB) в интересующей последовательности. Три основные процедуры способны индуцировать DSBs, это zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) и CRISPR/Cas9 [10, 37].

TALENs и ZFNs широко используются для моделирования болезней и их лечения, но их аккуратность и специфичность ниже, чем у CRISPR/Cas9. Более того, всё ещё существуют трудности в преобразовании, синтезе и оценке белка, которые не позволяют их рутинное использование [10, 37]. Если предоставляется гомологичная донорская ДНК, то репарация может осуществляться с помощью HR. В ином случае разрывы могут репарироваться с помощью non homologous end joining (NHEJ) при этом существует возможность внесения случайных ошибок, подобных малым инсерциям и делециям (indels) [37, 39].

Известны три типа CRISPR/Cas9 [40]. Среди них тип II наиболее известен и используется в преобразованиях генома, поскольку он нуждается только в одном белке для RNA-guided распознавании и расщеплении ДНК. Тип II является двухкомпонентной РНК--программируемой системой, базирующейся на эндонуклеазе Cas9, которая использует RNA guide последовательности, чтобы сформировать пары оснований с последовательностью ДНК мишени [40]. Это распознавание позволяет Cas9 вызывать сайт-специфические разрывы двойной нити ДНК. Последовательность гид РНК (RNA-guide) является РНК-дуплексом из tracrRNA (transactivating crRNA) и crRNA (CRISPR RNA). Они были преобразованы в одиночную гид РНК (sgRNA) с двумя критическими свойствами: последовательность 5' конца, которая предопределяет место ДНК мишени с помощью спаривания оснований и структура дуплексной РНК, которая на 3' конце, которая соединяется с Cas9 [40]. Возникающий в результате аппарат прост, поскольку внесение изменений в guide последовательность sgRNA заставляет Cas9 целенаправленно воздействовать на любую интересующую последовательность ДНК [10, 40].

Целенаправленное распознавание последовательности имеет два ключевых элемента: последовательность protospacer, которая является комплементарной 5' -концу 20-nt последовательности crRNA, и присутствие важной короткой последовательности, наз. protospacer adjacent motif (PAM), которая связывается с помощью Cas9 [40]. Система CRISPR/Cas9 д. быть способна разрезать и давать DSB после выполнения этих двух условий: протоспейсер соединяется с 5' -концом 20-nt последовательности и происходит связь между Cas9 и PAM последовательностью [41]. PAM является критическим для инициального связывания ДНК, т.к. некоторые исследования показали, что Cas9 не узнает последовательность мишени, полностью комплементарную гид РНК в отсутствии PAM [41].

После действия системы аппарат репарации ДНК работает с целью фиксировать индуцированные DSB, катализирует NHEJ или HDR [41]. Механизм CRISPR/Cas9-обусловленного целенаправленного воздействия на геном включает конформационные перестройки, сначала после связывания гид РНК и затем после ассоциации с мишенью двойной нити ДНК. В самом деле, архитектура Cas9 предопределяет две доли, обладающие двумя щелями нуклеиновых кислот и вызывает индуцированную гид РНК переориентацию, чтобы сформировать центральный канал, где ДНК субстраты связываются [42, 43].

В 2013 стало ясно, что эта система может эффективно использоваться для редактирования генома клеток человека [40]. В последние годы, способная к репрограммированию РНК S. Pyogenes Cas9-обусловленное редактирование генов стало применяться к разным клеткам человека, включая эмбриональные стволовые клетки [44, 45], с разной целью: точное воспроизведение ассоциированных с опухолью транслокаций, анализ функции генов за счет генетического скрининга потери функции и, прежде всего, коррекции генетических мутаций, ответственных за наследственные нарушения [46,47,48,49].

В свете оперирующего механизма возможно предположить, что CRISPR/Cas9 наиболее легкая в использовании и подходящая по цене технология [40]. Наконец, для лучшего использования системы редактирования генов необходимо разработать правильную sgRNA, выбирая наиболее подходящим образом приготовленную sgRNA, и находя потенциальные сайты эффектов вне мишени, улучшая специфичность sgRNA [37]. Эффекты вне мишени преимущественно возникают в местах, несущих PAM и частично комплементарную гид РНК последовательность [37]. Многие попытки были сконцентрированы на усовершенствовании системы, редуцирующей побочные эффекты [50, 51]. Эти попытки были сконцентрированы на разработке nickase версии Cas9 (D10A мутант), управляемой с помощью парных guide RNAs или преобразовывая варианты Cas9 нуклеазы, усиливая её специфичность (eSpCas9). Др. усилия были направлены на разработку способности CRISPR/Cas9 осуществлять геномное редактирование в отсутствие DSBs [52].

Наиболее успешной недавней попыткой улучшить эту систему стала prime editing, разностореннее и точное редактирование генома, метод, который использует каталитически поврежденную Cas9, слитую с преобразованной обратной транскриптазой, запрограммированной с помощью Prime Editing Guide RNA (pegRNA) [53]. Специальная особенность заключается в pegRNA, где отражаются обе специфичности сайта мишени и они кодируют желательное редактирование, благодаря своему расширению, которое позволяет системе копировать генетическую информацию непосредственно [53]. Anzalone et al. описали потенциал этого новейшего инструмента по редактированию генов без DSBs или донорской ДНК, осуществив более 175 редактирований в клетках человека, при этом побочных эффектов было значительно меньше, чем от Cas9. Прайм редактирование было протестировано на мутациях, ответственных за серповидно-клеточную болезнь (OMIM #603903) и болезнь Tay Sachs (OMIM #272800). Более того, было оценено внесение защитного варианта в ген PRNP клеток HEK, инсерции трансверсии в ген DNMT1 в первичные кортикальные нейроны мыши, а также осуществлено сравнение между прайм редактированием и HDR в 4-х линиях клеток человека (HEK293T, K562, U2OS, and HeLa). Полученные результаты подчеркивают прекрасную эффективность прайм редактирования и его способность расширить цели для геномного редактирования, корректируя высокий процент известных генетических вариантов, ассоциированных с нарушениями у людей, при низкой степени эффектов вне мишени и меньшим числом побочных продуктов, чем при HDR [53].

Перепрограммирование соматических клеток и геномное редактирование представляют собой две технологии, способные радикально изменить биологические и медицинские исследования последних лет, подчеркнув роль стволовых клеток в трансляционной медицине. После создания правильной sgRNA, CRISPR/Cas9 может целенаправленно воздействовать на большое количество геномных последовательностей, благодаря нокауту или knock-in генов, генной интерференции или активации, и др. связанными с хромосомами аппликациями, сохраняя неизменной остальную часть генетического фона [54].

Начиная с базовых биологических исследований на hiPSCs, система CRISPR/Cas9 была использована разными способами в зависимости от целей исследования:

Нокаут гена в основном используется для изучения функции генов, поскольку это наиболее пригодный инструмент для определения связи между биологическим событием и вышестоящим молекулярным механизмом [55].

Knock-in (выведение из строя) гена, с помощью внесения экзогенной нуклеотидной последовательности, обычно отвечает за идентификацию специфических маркеров в исследованиях стволовых клеток [56].

Активация или репрессия транскрипции: некоторые Cas9 варианты (напр., dCas9, dead Cas9) лишаются своей эндонуклеолитической активности, но сохраняют неизменной способность генерировать gRNA/Cas9 комплекс. Эти варианты могут быть слиты с активатором или супрессором транскрипции, чтобы модулировать транскрипцию эндогенных генов [57].

Полноценный скрининг генома: библиотека gRNA предоставляет большой объем генов для анализа результатов коллекции данных по секвенированию. Тогда как в библиотеке RNA interference (RNAi) нокдауна генной экспрессии на уровне мРНК, CRISPR/Cas9 способен целенаправленно находить ген в нокауте или транскрипционные ингибиторы [58].

Эти мутации могут быть ценны как для базовых биологических исследований на стволовых клетках, так и в медицинских исследованиях по моделированию болезней и поиску лекарств [58].

Первые попытки генетической модификации hiPSCs были осуществлены с помощью инсерции floxed resistance cassette. LoxP кассета обычно вносится с помощью гомологичной рекомбинации с геном антибиотика, но её удаление может вызывать сохранение остаточных последовательностей LoxP, которые могут индуцировать появление неконтролируемых фенотипов [59].

Ещё до появления механизма, обеспечивающего изоляцию hiPSCs с геномным редактированием одиночного основания без отбора с помощью антибиотика [60], CRISPR/Cas9 уже использовали для получения линий изогенных клеток для моделирования болезней и клеточной терапии. Одним из первых исследований в этом направлении стало завершение разработки специфических gRNA для коррекции точечных мутаций в локусе HBB, ответственном за серповидно-клеточную болезнь (OMIM #603903) [61]. Был разработан компаунд с gRNA, при этом Cas9 ассоциировал с донорской матрицей ДНК, содержащей WT HBB ДНК, а отобранная кассета впоследствии удалялась. Авт. дифференцировали как откорректированные, так и родительские hiPSCs в эритроциты, демонстрируя продукцию белка HBB с откорректированного аллеля в эритроцитах, произошедших из отредактированных по гену hiPSCs [61]. Важность доступности линии изогенных клеток тесно связана с шансом выявления роли определенного гена и тем самым последствий его возможной мутации [62]. В этой работе описывается коррекция ATM мутаций в Ataxia-Telangiectasia (OMIM #208900) произошедших от пациента hiPSCs путем использования CRISPR/Cas9 подхода [62]. Откорректированные по гену hiPSCs обнаруживают улучшения, возникающие после редактирования гена: устранение повреждения ДНК и реакции на оксидативные стрессы [62]. Вместе с генерацией линий изогенных клеток, CRISPR/Cas9 технология может быть также использована применительно к WT-hiPSCs чтобы генерировать специфические мутации, ответственные за исследуемую патологию. Один из примеров был опубликован недавно, чтобы смоделировать autosomic dominant polycystic kidney disease (ADPKD, OMIM #613095) [63]. Исследование началось с hiPSCs, происходящих от здоровых индивидов, где был вызван CRISPR/Cas9-обусловленный нокаут PKD2 гена [63]. Тот же самый подход использован для внесения специфичной для пациента точечной мутации в ген MEN1 в WT линии клеток, включая донорский олигонуклеотид, несущий мутацию [64]. Здесь ассоциация между редактированием гена и hiPSCs помогла объяснить молекулярные различия гипогликемического фенотипа у двух пациентов, несущих одну и ту же мутацию [64].

Учитывая потенциал множественного применения CRISPR/Cas9 к hiPSCs, их комбинация может рассматриваться как возможность разрабатывать новые терапевтические стратегии. Основной способ сведения CRISPR/Cas9 и hiPSCs теснее для фармацевтических исследований рассмотрен ниже и представлен в Table 2.

Table 2 Summary of the applications of CRISPR/Cas9 on hiPSCs for the identifications of therapeutic strategies

Посредством генетических манипуляций с hiPSCs возможно вносить определенные генетические изменения в ранней фазе процесса открытия лекарств, это может быть пригодно для разработки определенных соединений или выбора безукоризненного лекарства кандидата. Недавно, Kawai et al. [65] опубликовали свои эксперименты по использованию CRISPR/Cas9 для индукции peptide transporter 1 (PEPT1)-нокаута в hiPSCs, дифференцируя из в кишечные epithelial-like cells (IECs). Целью этого исследования была оценка PEPT1-обусловленной абсорбции в кишечнике, чтобы создать базу для разработки пептида и peptide-mimetic лекарств в качестве возможных субстратов для PEPT1 [65]. Т.о., использовали hiPSCs, внеся их в фармакокинетическое тестирование. Они продемонстрировали, что уровни экспрессии PEPT1 в hiPSCs-IECs были сходными с теми, что у взрослых людей в тонком кишечнике и что эти клетки обнаруживают активность PEPT1. Впервые система CRISPR/Cas9 была использована для истощения определенного глютамата, присутствующего в экзоне 21, необходимого для PEPT1 способности транспортировки. Результатом стало получение PEPT1-KO-hiPSCs-IECs линии, которая может быть использована в высоко специфичном способе транспортировки для оценки PEPT1 субстратов без использования ингибиторов [65].

Др. ступень разработки лекарств заключается в идентификации специфических терапевтических мишеней с использованием hiPSCs и CRISPR/Cas9 редактирования генов. Их сборка была осуществлена в исследовании определенной нейродегенеративной болезнии под названием multiple-system atrophy (MSA, OMIM #146500) [66]. MSA характеризуется аутономной неспособностью, при этом различные классификации базируются на вовлечении паркинсонизма, мозжечковой атаксии и пирамидальной дисфункцией. Nakamoto et al. [66], с целью исследования нейронов, происходящих из hiPSCs пациентов, изучали форму MSA, связанную с функционально измененным вариантом гена COQ2, ассоциированного со снижением биосинтеза Q10. Используя коррекцию гена с помощью CRISPR/Cas9, оказалось возможным обратить возникающую функциональную недостаточность митохондриального дыхания и антиоксидативной системы, а также повышенный апоптоз. Это исследование связало дисфункции нейронов со снижением коэнзима Q10, подтвердив тем самым, что добавление Q10 может оказаться пригодной опцией для терапии MSA [66].

Отслеживание количества определенных белков является одной из главных целей исследований нарушений, характеризующихся накоплением некоторых продуктов. После этого возникают генетические альтерации, включая потерю половины, функциональные нарушения и de novo избыточная функция, ответственная за аномальную дозу белка [78, 79]. Одним из примеров является необычное накопление ключевых регуляторов при онтогенетических нарушениях, таких как FOXG1 синдром (OMIM #613454). Forkhead transcription factor1 (FOXG1) экспрессируется изменчиво на ранней ст. развития головного мозга [80]. Уже было продемонстрировано, что делеции или миссенс мутации у людей одного из аллелей FOXG1 вызывают тяжелые нарушения нейрального развития при синдроме FOXG1, при этом многие фенотипические проявления, включая нарушения спектра аутизма, эпилепсия, микроцефалия и тяжелая умственная отсталость [81-83]. Zhu et al. [67] впервые попытались контролировать дозу FOXG1 путем комбинирования трех технологий: CRISPR/Cas9, small molecule-assisted shut-off (SMASh) и hiPSCs. Эта новая комбинация позволила лучше преодолевать затруднения с контролем дозы, обычно связанных со стратегиями нокаута и нокдауна. После использования малых молекул (протеазных ингибиторов), SMASh технология способна изменять пост-трансляционные количества белков точным и обратимым способом, благодаря присутствию само-удаляющихся degrons [67]. С помощью CRISPR/Cas9, авт. метили желательный ген с помощью SMASh в происходящих из hPSCs промежуточных нейронах. Благодаря такой архитектуре, они они оказались способными отслеживать, как доза FOXG1 влияет на генерацию GABAergic промежуточных нейронов, что может объяснить вариабельность клинических проявлений синдрома FOXG1. Авт. настроили этот метод, чтобы воспроизвести модель болезни, поскольку контроль дозы белка с помощью лекарством индуцированной деградации или стабилизации облегчает изучение функции белка [67]. Однако, это может стать хорошим приложением для фармакоцевтических целей по скринингу лекарств для восстановления нормальных количеств белка, чтобы снизить или удалить тяжелые клинические проявления синдромов, возникающих из-за альтераций количеств белка.

Одним из главных подходов, базирующихся на слиянии hiPSCs с CRISPR/Cas9 является редактирование генов для клеточной терапии. Фактически, hiPSCs позволяют получать клетки пациентов, редактирование генома которых является практичным и осуществимым при использовании трансплантации аутологичных клеток. В 2015 было продемонстрировано, что коррекция гена HBB с помощью CRISPR/Cas9 при beta-талассемии (OMIM #613985) в специфичных для пациентов hiPSCs, и их производных гематопоэтических стволовых клетках, и их трансплантации стало идеальным терапевтическим решением лечения болезни [68, 69].

Прогресс был достигнут при изучении recessive dystrophic epidermolysis bullosa (RDEB, OMIM #226600), тяжелом наследственном заболевании кожи, вызываемой мутациями в гене COL7A1 [84]. Jackтw et al. [70] используя hiPSCs, происходящие от пациентов с RDBE и корректируя их с помощью CRISPR/Cas9. Трехмерные эквиваленты кожи (HSEs) были сгенерированы с помощью исправления гена в hiPSCs, дифференцировки их в кератиноциты и фибробласты и затем трансплантированных иммунодефицитным мышам [70]. Животные обнаруживали нормальную экспрессию коллагена типа VII. Это позволит использовать в будущем в клинике терапию, базирующуюся на аутологичных стволовых клетках для лечения RDBE [70].

Др. исследование было сконцентрировано на коррекции мутаций, вызывающих Duchenne muscular dystrophy (DMD) с помощью TALENs и CRISPR/Cas9 в происходящих от пациентов hiPSCs [71]. DMD (OMIM #310200) тяжелое мышечно-дегенеративное заболевание, вызываемое мутациями потери функции в гене dystrophin (DMD) , расположенном на хромосоме X [71]. Миобласты пациента ранее использовали для восстановления белка дистрофина, но для его клонального размножения необходим процесс иммортализации с помощью онкогена, такого как hTERT [71, 85]. Вместо этого можно выделять hiPSCs от пациентов, поддерживая их плюрипотентность и способность к самообновлению без использования дальнейших процедур. В этом исследовании [71], авт. попытались осуществить коррекцию dystrophin, используя три разных метода: разрушение сплайсинг акцептора, чтобы пропустить экзон, внесение небольших indels, чтобы модулировать рамку считывания белка и knock-in missing экзона 44, чтобы восстановить целиком кодирующую область белка [71]. Результаты показали, что все эти подходы были благотворны, но только подход с knock-in восстанавливал полную длину белка дистрофина [71]. Исследования болезни Дюшена выявили длительный важный прогресс в снижении вероятности мутагенеза вне мишени и иммуногенности, в целом в результате пролонгированной экспрессии CRISPR/Cas9. Совсем недавно, Gee et al. [86] разработали систему доставки рибонуклеопротеина на базе внеклеточных нано-пузырьков (NanoMEDIC). Система базируется на химической димеризации и упаковке сигнала вирусной РНК, чтобы рекрутировать Cas9 белок и sgRNA в нано-пузырьки [86]. Они тестировали это устройство на разных типах клеток, среди прочего и на клетках скелетных мышц, происходящих из DMD-hiPSCs. Система достигала более 90% эффективности по пропуску экзонов. Эта инновационная техника, как и эксперименты in vivo демонстрируют многообещающую терапию DMD с помощью редактирования генома [86].

Потенциал и доступность редактирования генома и оснащение для репрограммирования наделяют исследователей ценным инструментом и для поиска лекарств, особенно когда отсутствует доступ к образцам от пациента. После редактирования гена клетки могут дифференцироваться в специфические типы клеток, целенаправленно воздействовать на болезнь и выявлять разные соединения, чтобы идентифицировать их способность ослаблять проявления болезни. Напр., скрининг лекарств приводит к лучшему способу идентификации идеального соединения, чтобы сражаться с синдромом mtDNA depletion (MTDPS3, OMIM #251880), вызываемого дефицитом DGUOK, митохондриальной киназы, ответственной за фосфорилирование purine deoxyribonucleosides [87]. Печень является основным органом, участвующим в этой болезни [72]; поэтому авт. получали гепатоциты из WT-hiPSCs, после индукции нокаута DGUOK посредством CRISPR/Cas9. Такие клетки воспроизводили митохондриальную дисфункцию, ассоциированную с печенью у пациентов с MTDPS3 и конечном итоге использовали их в качестве платформы для идентификации лекарств, которые могли бы улучшить митохондриальную функцию и продукцию АТФ [87]. Авт. использовали коллекцию библиотеки SPECTRUM, которая содержи около 1300 лекарств, одобренных для лечения людей в США, Европе и Японии. Уровни АТФ были использованы для идентификации соединений, которые повышаю продукцию клеточной энергии. Среди проверенных лекарств, NAD стал одним из тех, что воспроизводимо увеличивал уровни АТФ и экспрессию всех кодируемых митохондриями генов цепи транспорта электронов [87]. Отсюда вытекает, что возможно лечение NAD. Это один из примеров того, как соединение репрограммирования и редактирования генов может предоставить систему высокопроизводительного теста для скрининга потенциальных терапевтических препаратов с разными спектрами активности.

Как уже было описано, система CRISPR/Cas9 возникла как иммунная реакция в некоторых бактериях для устранения вирусов. Эта концепция была применена к исследованиям HIV, поскольку это действительно доступная терапевтическая стратегия не может в целомy искоренять вирус в теле и поэтому многие исследования пытаются использовать редактирование генома для борьбы с этой инфекцией [74]. Относительно возможности использования hiPSCs в этой области медицинских исследований, Liao с колл. [75]. попытались вносить в hiPSCs систему противовирусной защиты, сходную с той, что у бактерий и archaea. Они преобразовывали hiPSCs, чтобы экспрессировать систему CRISPR/Cas9, нацеленную на продукты обратной транскрипции вирусного РНК генома. Результатом стала продукция hiPSCs со стабильно экспрессируемым нацеленным на HIV CRISPR/Cas9. Такие клетки могут быть дифференцированы в клетки HIV резервуара, поддерживать длительное время резистентность к вирусу. Это новаторская терапевтическая стратегия против вирусной инфекции [75].

Относительно возможности использования CRISPR/Cas9 и hiPSCs для антивирусной защиты, этот подход может пригодиться для исследований даже SARS-Cov-2. Здравой идеей является построение тест-платформы, которая будет воспроизводить легкие человека, дифференцировать WT-hiPSCs в пневмоциты типа II [88] и тестировать с их помощью псевдовирусы, способные воспроизводить инфекцию SARS-Cov-2 [89]. Затем редактирование генов может быть использовано для репрессии или усиления активности генов, участвующих в проникновении и активности вируса, а также для введения известных полиморфизмов, которые смогут защищать или предрасполагать к вирусной инфекции [90]. Также отредактированные клетки могут быть использованы для тестирования способности ряда соединений бороться с инфекцией. Совсем недавно, гибкий и эффективный подход по целенаправленному воздействию на вирусную РНК посредством действия CRISPR/Cas9 был осуществлен; он может быть использован специфически для SARS-CoV-2 РНК генома, ограничивая его способность к воспроизведению [76]. Это огромная благоприятная возможность борьбы с вирусами, обладающими потенциалом быстро вырабатывать резистентность [76].

Др. мед. подход, нуждающийся в стимуляции иммунного ответа, является онкология. CRISPR/Cas9 при исследованиях рака уже широко используется, из-за её способности идентифицировать и корректировать такие мутации, а также открывать молекулярные мишени для лечения рака [91,92,93]. Однако онкологические проекты, эксплуатирующие комбинацию между CRISPR/Cas9 и hiPSCs, немногочисленны. Интересное исследование было опубликовано в 2016 [77], когда группа исследователей попыталась улучшить NK клетками обусловленное убийство солидных опухолей, преобразуя их так, чтобы они экспрессировали более стабильную форму CD16a. Этот белок выполняет ключевую функцию по элиминации клеток, opsonized c помощью антибиотиков посредством Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity (ADCC). Активность клеток NK может быть затруднена c помощью экспрессии ADAM17, металлопротеиназы, кторая обеспечивает протеолитическое расщепление CD16a. Т. о., hiPSCs редактировали c помощью CRISPR/Cas9, чтобы репрессировать экспрессию ADAM17 и вскоре после этого также преобразовывали, чтобы продуцировать резистентные к расщеплению CD16a (S197P). Такие клетки дифференцировались в натуральные киллеры, нацеленные на опухолевые клетки, представляя собой подход для аллогенной клеточной иммунотерапии [77].