Recent advances in gene therapy for neurodevelopmental disorders with epilepsy | |
|---|---|
|
Нарушения нейрального развития могут выцзываться мутациями в нейрональных генах, фундаментальных для развития головного мозга. Такие нарушения обнауживают тяжелые симптомы от умственной отсталости, социальных и когнитивных нарушений и субнабора признаков строго связанных с эпилепсией (NDD + E). Мы свободно группируем гены, связанные с NDD + E, с разными нейронными функциями: регуляция транскрипции, прирожденная возбудимость и синаптическая передача. Все эти гены выполняют в целом жизненно важную роль в предопределении архитектуры и функции головного мозга во время раннего развития и если их функция нарушена, то симптомы могут возникать на первых ст. жизни человека. Взаимоотношения с эпилепсией сложные. При некоторых NDD + E, эпилепсия является сопутствующим заболеванием, а в других случаях судороги, по-видимому, являются основной причиной патологии, что позволяет предположить, что либо структурные изменения (NDD), либо нейронные коммуникации (E) могут привести к этим расстройствам. " ADNFLE " autosomal-dominant nocturnal frontal lobe epilepsy " AED " anti-epileptic drug " AIS " axon initial segment " AMPAR " AMPA receptor " AP " action potential " AS " angelman syndrome " ASD " autism spectrum disorder " BFN/IS " benign familial neonatal/infantile seizures " BK channels " calcium-activated potassium channels " CDD " CDKL5-deficiency disorder " CNS " central nervous system " DS " Dravet syndrome " E " epilepsy " EAS " epilepsy-aphasia spectrum " EE " epileptic encephalopathy " EIMFS " epilepsy of infancy with migrating focal seizures " FS+ " febrile seizure plus " FXS " fragile X syndrome " GEFS+ " generalized epilepsy with febrile seizure plus " GoF " gain-of-function " hCS " human cortical spheroids " hESC " human embryonic stem cell " hiPSC " human induced pluripotent stem cell " hSS " human subpallial spheroids " ID " intellectual disability " KO " knockout " LoF " loss-of-function " NDD + E " neurodevelopmental disorders with epilepsy " NDD " neurodevelopmental disorders " NMDAR " NMDA receptor " PKD " paroxysmal kinesigenic dyskinesia " PKD/IC " paroxysmal kinesigenic dyskinesia with infantile convulsions " PTV " protein truncating variant " PTZ " pentylenetetrazole " PV+ " parvalbumin positive " RTT " Rett syndrome " SCN " voltage-gated sodium channel " SEN " subependymal nodule " SST+ " somatostatin positive " SV " synaptic vesicle " TSC " tuberous sclerosis complex |
 NEURODEVELOPMENTAL DISORDERS WITH EPILEPSY AND EPILEPTIC ENCEPHALOPATHIES Нарушения нейрального развития (NDDs) являются широкой и разнообразной группой нарушений поведения, включая нарушения спектра аутизма (ASDs) и умственной отсталости (ID), это предопределяется существенными нарушениями в одном или нескольких доменах функционирования, таких как социальные взаимодействия, познавательные способности, язык и / или моторика (Ismail & Shapiro, 2019). NDDs обычно связаны с тяжелой и непокорной эпилепсией, при этом примерно у 26% пациентов обнаруживаются судороги в качестве сопутствующих заболеваний (Association, 2013).
Напротив, epileptic encephalopathies (EEs) являются широкой группой синдромов, характеризующихся ранним началом эпилепсии, которая часто сопровождается NDDs (McTague, Howell, Cross, Kurian, & Scheffer, 2016). Термин 'epileptic encephalopathy' означает процесс, с помощью которого эпилептическая активность негативно сказывается на функции головного мозга помимо основной этиологии, так что припадки могут быть прямой причиной задержки развития и когнитивных нарушений. Однако, доказательства такого процесса возникают в большинстве синдромов, определяемых сегодня как EEs по-прежнему отсутствует, и устранения эпилептической активности с помощью противоэпилептических препаратов (AED), которых часто недостаточно для предотвращения задержки развития и когнитивных нарушений (Howell, Harvey, & Archer, 2016). Это подчеркивает важность разработки новых терапевтических подходов, нацеленных на специфические генетические причины болезни. Путем раннего восстановления правильной функции белка, генотерапия открывает возможность предупреждения как задержки развития , так и эпилептической активности (Wykes & Lignani, 2018).
Здесь мы будем использовать общий термин нарушения нейрального развития с эпилепсией (NDD + E), который включает любое нарушение, затрагивающее развитие головного мозга, сопровождаемое некоторым уровнем эпилептической активности, независимо о того, является ли эпилепсия первичным патологическим процессом или сопровождающим.
Недавние успехи секвенирования следующего поколения позволили идентифицировать более 100 генов, ассоциированных с NDD + E, кодирующих белки с разными клеточными функциями (Heyne et al., 2019; Symonds & McTague, 2020). Вообще говоря, мы рассмотрим мутации, которые влияют на гены, которые косвенно изменяют активность нейронов (т. е. посредством изменения регуляции других генов), напрямую изменяют возбудимость нейронов, воздействуя на ионные каналы и изменяют синаптические свойства. (Figure 1).  Figure 1 Mutated genes in NDD + E. Gene names are drawn where their encoded proteins function in the cell body (A), axon initial segment (B), pre-synaptic (C) and post-synaptic (D) terminals. In (A), genes outside the neuron represent ubiquitous expression. In (B), gradient expression of SCN channels is indicated by different font sizes 1.1 Mutations that cause NDD + E by changing gene expression levels Во время развития экспрессия генов тонко регулируется для достижения упорядоченной последовательности событий, приводящих к правильному формированию и созреванию нервной системы (Kang et al., 2011). Мутации в генах, затрагивающих механизмы транскрипции, трансляции или пост-трансляционные механизмы могут оказывать существенные патологические эффекты на развитие и функцию головного мозга, даже если эти гены не изменяют непосредственно активность нейронов. Напр., Rett syndrome (RTT), Fragile X syndrome (FXS) и Angelman syndrome (AS), все они возникают за счет изменения общей нейрональнй функции косвенно, модифицируя экспрессию др. генов во время развития.
Было обнаружено, что RTT, основная причина ID и ASD у девочек во всем мире, вызван мутациями потери функции (LoF) в X-сцепленном гене MECP2 более 20 лет назад. (Amir et al., 1999; Singer & Naidu, 2001). MECP2 кодирует methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2), член семейства белков methyl-CPG-binding domain (MBD) , который связывает метилированные цитозин. MeCP2 является наиболее многочисленным в головном мозге, где он взаимодействует с метилированными сайтами, чтобы репрессировать транскрипцию длинных генов (Gabel et al., 2015). Дальнейшие исследования установили, что MeCP2 по-разному регулирует экспрессию генов в подавляющих и возбуждающих нейронах, указывая на контекстуальную роль MeCP2 в вызывании RTT патологии (Johnson et al., 2017). MeCP2 сегодня рассматривается как глобальный регулятор структуры хроматина, который необходим для тонкой настройки экспрессии генов (Skene et al., 2010). Потеря MeCP2 при RTT ведет к слабым, но широко распространенным изменениям экспрессии во время позднего эмбрионального и пост-натального развития, что приводит к аномалиям созревания нейронов и формирования синапсов. Это приводит к появлению симптомов RTT на первом году жизни, характеризуется остановкой или регрессией развития с нарушениями коммуникаций, социального поведения и мелкой моторики (Singer & Naidu, 2001).
FXS, наиболее распространенная причина ASD и ID (Richter, Bassell, & Klann, 2015), обусловлена экспансией повторов тринуклеотида cytosine-cytosine-guanine (CGG) в гене FMR1, это приводит к замалчиванию транскрипции локуса FMR1 и потере функции белка FMRP. Примерно половина от всех пациентов FXS обнаруживает судорожные аномалии на EEG, а 20% пациентов FXS обнаруживают эпилепсию. Приблизительно 25% пациентов устойчивы к противо-эпилептической лекарственной терапии и судороги продолжаются и у взрослых (Hagerman & Stafstrom, 2009). FMRP является важным регуляторным белком трансляции, а его разрушение приводит к нарушению регуляции сотен белков, затрагивающих пластичность и связанность синапсов в развивающемся головном мозге (Richter et al., 2015). Анализ FMRP транскриптома выявил сотни потенциальных мишеней мРНК, кодирующих пре- и пост-синаптические белки, а также ряд ионных каналов. Безусловно, FMRP, как было установлено, непосредственно взаимодействует c Kv3.1, Kv4.2, Cav2.2 и BK каналами, нарушая свойства каналов и регуляцию трафика через мембраны. Такие взаимодействия могут непосредственно нарушать возбудимость нейронов, возможно внося тем самым вклад в фенотип пациентов (Ferron, 2016).
AS является ещё одним NDD + E, которое характеризуется микроцефалией, судорогами, атаксией, мышечной гипотонией с hyperreflexia и моторной задержкой (Buiting, Williams, & Horsthemke, 2016). LoF мутации в UBE3A, приводят к тому, что E3 ubiquitin лигаза, которая конъюгирует с группами ubiquitin в белках, чтобы направить их на деградацию, что и вызывает AS (Sell & Margolis, 2015). Механизмы, с помощью которых UBE3A LoF может приводить к кортикальной избыточной возбудимости и эпилепсии долгое время оставались неясными, до тех пор пока недавно не был предположен механизм, подтвержденный открытием, что отсутствует UBE3A-обеспечиваемая деградация кальций-активированных калиевых каналов (ВК) с большой проводимостью и, как следствие, усиление активности ВК-каналов приводит к увеличению собственной клеточной возбудимости (Sun et al., 2019).
Tuberous sclerosis (TSC) является мультисистемным нарушением, вызываемым мутациями в генах TSC1 или TSC2, кодирующих hamartin и tuberin соотв. (Curatolo, Bombardieri, & Jozwiak, 2008). Tuberin и hamartin являются критическими регуляторами пути mTOR , а гетерозиготные мутации LoF достаточны для нарушения регуляции пролиферации клеток и дифференцировки, что приводит к повреждениям ЦНС, таким как subependymal узелки (SENs) и кортикальные бугорки (tubers) (Curatolo et al., 2008). Двуударные соматические мутации вызывают гомозиготность благодаря потере нейтральной копии у гетерозигот, это может возникать и обнаруживаться при некоторых, но не при всех повреждениях (Martin et al., 2017). Около 85% пациентов с TSC обнаруживают NDD + E фенотипы, включая нарушения познавательной функции, проблемы с поведением, аутизм и эпилепсия. Эпилепсия обычно начинается в первый год жизни возникает в основном из-за кортикальных бугорков (tubers) (Curatolo et al., 2018). 1.2 Disorders associated with direct changes in neuronal excitability: mutations in ion channels Ионные каналы это трансмембранные белки, регулирующие ток ионов через клеточные мембраны и играют ключевую роль в контроле электрических свойств и возбудимости нейронов (Hille, 2001). В 1990s, открыта первая болезнь, вызываемая моногенными мутациями в ионных каналах, это привело к идентификации новой группы болезней, известных как каналопатии. Генетика каналопатий является гетерогенной группой болезней благодаря их клиническими проявлениям и возрасту возникновения, она зависит не только от физиологической роли затронутого ионного канала, но и также от специфической пространственной и временной экспрессии гена (Kullmann, 2010). 1.2.1 Voltage-gated sodium channels (SCN1A, SCN2A, SCN8A) Генетические варианты SCN1A, SCN2A и SCN8A , кодирующие α-субъединицы экспрессирующихся в головном мозге контролируемые напряжением натриевые каналы (SCNs), являются наиболее частыми моногенными причинами NDD + E (Brunklaus & Lal, 2020). SCNs являются трансмембранными комплексами, которые состоят из одной α субъединицы и одной или нескольких вспомогательных β субъединиц (Catterall, 2000). Т.к. они делают возможным быстрый приток ионов Na+ за счет деполяризации мембраны, поэтому SCNs являются критическими для генерации потенциалов действия (APs) в инициальном сегменте аксона (AIS) их распространения вдоль аксона.
Мутации SCN1A, возникающие в результате Nav1.1 LoF ассоциированы со спектром тяжести фенотипических проявлений, от умеренных missense мутаций, вызывающих febrile seizures plus (FS+) до более тяжелых missense и мутаций укороченных вариантов (PTVs), приводящих к генерализованной эпилепсии с febrile seizures plus (GEFS+) и к Dravet syndrome (DS) (Catterall, Kalume, & Oakley, 2010). Nav1.1 преимущественно экспрессируется в AIS из GABAergic промежуточных нейронов, где он играет критическую роль в генерации AP (Yu et al., 2006). Nav1.1 LoF приводит к снижению плотности тока натрия и снижению возбудимости подавляющих нейронов, таким образом, баланс возбуждения-торможения меняется в сторону гипервозбудимости и вызывает тяжелую трудноизлечимую эпилепсию. Поскольку эпилепсия является результатом LoF натриевых каналов, препараты, блокирующие натриевые каналы, такие как карбамазепин и ламотриджин, усугубляют заболевание и противопоказаны.
Оба варианта gain-of-function (GoF) и LoF в SCN2A оказываются ассоциированными со спектром NDD + E, включая доброкачественную семейную эпилепсию новорожденных и детей (BFNIE), Ohtahara синдром, Lennox-Gastaut синдром и West синдром (Brunklaus et al., 2020; Wolff et al., 2017). LoF варианты в SCN2A также были идентифицированы у пациентов с эпилепсией с поздним началом и у пациентов с умственной отсталостью, ASD и шизофренией без судорог (Carroll et al., 2016; Codina-Sol? et al., 2015; Wolff et al., 2017). Вполне возможно, что мутации LoF относительно легче переносятся, чем GoF, поскольку имеется присутствует значительно больше каналов, чем абсолютно необходимо или же они могут затрагивать возбудимость других нейронов на специфических стадиях развития, это может объяснить различия в начале судорог (Brunklaus et al., 2020; Wolff et al., 2017).
Подобно SCN2A, GoF варианты в SCN8A были описаны в спектре нарушений в пределах от доброкачественных детских судорог до тяжелых NDD + E (Larsen et al., 2015). LoF варианты в SCN8A также были идентифицированы у пациентов с умственной отсталостью и миоклонами без судорог (Wagnon et al., 2017; Wagnon et al., 2018). SCN2A и SCN8A кодируют Nav1.2 и Nav1.6, соотв., две субъединицы натриевых каналов, которые преимущественно экспрессируются в AIS и узелках Ranvier возбуждающих нейронов и играют критическую роль в распространении AP во время раннего развития. Хотя они выполняют сходную функцию, SCN2A экспрессируется раньше в ходе развития, чем SCN8A, это объясняет более ранний возраст начала эпилепсии, вызываемой SCN2A (median = 13 days), по сравнению с SCN8A пациентами (median = 4 months; Brunklaus et al., 2020). 1.2.2 Voltage-gated potassium channels (KCNQ2, KCNQ3, KCNT1, KCNC1) Калиевые каналы являются самыми большими ионными каналами, экспрессирующимися в основном в ЦНС. Voltage-gated калиевые каналы состоят из 4-х гомологичных образующих пору субъединиц, каждая из которых содержит6 трансмембранных α-спиралей, из которых сегмент S4 действует как сенсор напряжения (voltage sensor) (Kullmann, 2010).
KCNQ2 и KCNQ3 кодируют Kv7.2 и Kv7.3, соотв., две субъединицы которого собираются вместе, чтобы сформировать медленно активируемый канал, обеспечивающий M ток, который особенно важен во время развития для контроля сети гипервозбудимости (Wang et al., 1998). Kv7.2 и Kv7.3 экспрессируются в AIS как в возбуждающих, так и подавляющих нейронов. В возбуждающих нейронах потеря KCNQ2 приводит к уменьшению среды после гиперполяризации и длительной деполяризации, приводящей к общей повышенной возбудимости . Интересно, что делеция KCNQ2 / 3 в подавляющих нейронах также приводит к повышенной возбудимости за счет гомеостатической потенциации возбуждающей передачи. (Soh et al., 2018). Следовательно, LoF мутации в таких каналах д. в целом приводить к гипервозбудимости нейронов и судорогам. KCNQ2 missense и укороченные варианты оказались ассоциированными с self-limited BFNIE, а также с более тяжелыми NDD + E, такими как Ohtahara синдром, который на сегодня не имеет удовлетворительного лечения (McTague et al., 2016; Shellhaas et al., 2017). Менее распространенные, KCNQ3 варианты оказались ассоциированными c BFNIE, а недавно гомозиготный LoF вариант был обнаружен у пациента с эпилепсией, начинающейся у новорожденных и с умственной отсталостью (Lauritano et al., 2019).
Одной из наиболее тяжелых NDD + E, является эпилепсия детей с мигрирующими фокальными судорогами (EIMFS), ассоциированная с de novo GoF мутациями в KCNT1, кодирующем субъединицу натрием активируемого калиевого канала KCa4.1 (Barcia et al., 2012; McTague et al., 2018). Мутации в KCNT1 оказались также ассоциированы с синдромом семейной фокальной эпилепсии, autosomal-dominant nocturnal frontal lobe epilepsy (ADNFLE), а также с синдромами Ohtahara и West (Heron et al., 2012; Ohba et al., 2015). GoF KCNT1 патогенные варианты, как известно, вызываются плейотропными эффектами, хотя генотип-фенотипические корреляции всё ещё неясны, при этом , по крайней мере, одна мутация описана в ассоциации с EIMFS и ADNFLE (Borlot et al., 2020).
Недавние мутации в KCNC1, кодирующем voltage-gated калиевый канал Kv3.1, оказались ассоциированы с NDD + E. Kv3.1 экспрессируется в подавляющих нейронах и является фундаментальным для быстрых импульсов в этих нейронах. Хотя уже сообщалось о доминантно-отрицательных мутациях в KCNC1, ведущих к прогрессирующей миоклональной эпилепсии, были выявлены новые рекуррентные мутации de novo, которые вызывают NDD с эпилептическим фенотипом и без него. (Cameron et al., 2019; Park et al., 2019). 1.3 Mutations causing NDD + E that affect synaptic transmission Синаптическая передача является фундаментальным процессом для коммуникаций между нейронам, формирования сети во время развития и для пластичности, связанной с поведением (S?dhof, 2018). Не удивительно, что мутации в белках, вовлеченных в функционирование нейронов этой нейрональной функции, приводят к NDD + E.
Мутации были найдены в белках, экспрессирующихся в pre- и post-синаптических окончаниях. Синаптические белки - чрезвычайно сложная коллекция взаимодействующих белков, позволяющая корректировать функцию наиболее многочисленных и с определенными свойствами синапсов в головном мозге человека (Bay?s et al., 2011). Протеом синапсов человека или synaptome, , как полагают, представлен не менее чем 2000 белков. Мутации в генах, кодирующих синаптом, как было установлено, вызывают 130 болезней головного мозга, сегодня объединенных термином 'synaptopathies' (Grant, 2012). Синаптопатии могут приводить к нарушениям нейрального развития и психиатрическим нарушениям, таким как ASD, ID или шизофрения, но мутации в синаптоме вызывают и NDD + E. 1.3.1 Pre-synaptic terminal STXBP1 кодирует Stxbp1/Munc18-1, белок, участвующий в пристыковке синаптических пузырьков, подкачке (priming ) и слиянии синаптических везикул посредством взаимодействия с SNARE (Rizo & Xu, 2015). De novo гетерозиготные мутации в STXBP1 м. вызывать некоторые из наиболее тяжелых форм NDD + E, такие как синдром Ohtahara (Saitsu et al., 2010), синдром West (Deprez et al., 2010), синдром Lennox-Gastaut (Allen et al., 2013), синдром Dravet (Carvill et al., 2014) и др. типы NDD + E с ранним началом (Stamberger et al., 2016). STXBP1 является одним из наиболее часто мутируемых генов при спорадической умственной отсталости и нарушениях развития. Все пациенты с STXBP1 энцефалопатией обнаруживают ID и 95% имеют эпилепсию. STXBP1 энцефалопатия чаще всего вызывает гаплонедостаточность, т.к. более 60% описанных мутаций являются или делециями, nonsense, мутациями сдвига рамки считывания или вариантами сплайс-сайта (Stamberger et al., 2016).
Synapsins это семейство синаптических пузырьков (SV) фосфопротеины, которые взаимодействуют с SVs и актиновым цитоскелетом, чтобы облегчить во время стадии пре- и пост-пристыковки высвобождение нейротрансмиттера, регулируя тем самым доставку SV и кратковременную пластичность (Cesca, Baldelli, Valtorta, & Benfenati, 2010). Missense и укороченные мутации в генах SYN1 и SYN2, кодирующих Synapsin 1 и Synapsin 2 ассоциируют с NDD с или без эпилепсии (Fassio et al., 2011; Lignani et al., 2013; Peron, Baratang, Canevini, Campeau, & Vignoli, 2018). Synapsin 1 и Synapsin 2 обеспечивают синхронное и асинхронное высвобождение GABA в ингибирующих синапсах, соотв., тем самым играют ключевую роль в контроле подавления в сети возбудимости (Forte, Binda, Contestabile, Benfenati, & Baldelli, 2020; Medrihan, Ferrea, Greco, Baldelli, & Benfenati, 2015).
Богатый пролином трансмембранный белок 2 (PRRT2) является специфичным для нейронов трансмембранным белком, который преимущественно располагается пре-синаптически, где он ассоциирует с t-SNARE белком SNAP25 и SVs (Stelzl et al., 2005). PRRT2 недавно был идентифицирован как ключевой компонент аппарата высвобождения пузырьков посредством своего взаимодействия с Ca2 + сенсорами Syt1/2, которые обеспечивают синхронное высвобождение SVs (Valente et al., 2016). На важную роль PRRT2 в синапсах указывает его участие в ключевых процессах развития, а PRRT2 LoF приводят к дефектам миграции нейронов, в генезе спинальных отростков (spinogenesis), формировании и поддержании синапсов (Liu et al., 2016; Valtorta, Benfenati, Zara, & Meldolesi, 2016). LoF мутации в PRRT2 преимущественно связаны с BFNIE в раннем детстве и paroxysmal kinesigenic dyskinesia (PKD) в ранней молодости или с обеими (PKD с конвульсиями у детей; Valtorta et al., 2016). Однако, мутации PRRT2 оказываются также ассоциированы с нарушениями нейрального развития, такими как не-синдромный ID и ASD и с NDD + E, такими как Dravet синдром (Ebrahimi-Fakhari, Saffari, Westenberger, & Klein, 2015). Всё ещё не установлены границы широкого спектра болезней, связанных с PRRT2, представленных параксизмальными судорогами и нарушениями поведения. Однако, установление четких, генотип-фенотипических корреляций затруднительно, т.к. члены семей, несущие идентичные мутации PRRT2 часто обнаруживают отличающиеся фенотипы (Brueckner et al., 2014).
Поскольку мутации в генах, обеспечивающих высвобождение SV с помощью экзоцитоза оказываются широко ассоциированными NDD + E, и мутации, затрагивающие эндоцитоз, также могут быть патогенными (Bonnycastle, Davenport, & Cousin, 2020). Dynamin 1 является GTPase, специфически экспрессирующейся в нейронах, которые участвуют в расщеплении SV во время эндоцитического процесса (Ferguson et al., 2007). Dynamin 1 был тщательно исследован в отношении его роли в clathrin-обеспечиваемом эндоцитозе, фундаментальном процессе, позволяющем осуществление рециклинга SV после высвобождений нейротрансмиттера в пре-синаптических плазматических мембранах. Т.к. clathrin образует инвагинированные эндоцитотические зачатки, dynamin медленно накапливается в шейке зачатка, сжимая её и делая возможным эндоцитотическое высвобождение (Cheung & Cousin, 2019; Ferguson & De Camilli, 2012). De novo мутации в гене DNM1, кодирующим dynamin 1, оказываются ассоциированными с NDD + E (Allen et al., 2013). Недавнее исследование по определению спектра нарушений, вызываемых мутациями в DNM1, установило, что пациенты обнаруживают удивительную гомогенность фенотипа, чаще всего обнаруживающие тяжелую до полной умственной отсталости, гипотонию и refractory эпилепсию (von Spiczak et al., 2017). Интересно, что все мутации формировали кластер в GTPase или среднем домене белка и треть пациентов имела одну и ту же recurrent c.709C>T (p.Arg237Trp) мутацию. Структурное моделирование и экспериментальные доказательства подтверждают, что мутации оказывают доминантно-негативный эффект путем предупреждения или сборки dynamin олигомеров или расщепления пузырьков, нарушая тем самым SV эндоцитоз (von Spiczak et al., 2017). 1.3.2 Post-synaptic terminal GABAA рецепторы являются лигандом управляемыми ионными каналами, которые являются первичными медиаторами быстрой передачи ингибирующих синаптических сигналов в ЦНС. GABAA рецепторы являются пентамерами, формируемыми разными субъединицами (α1- α6, β1- β3, γ1-γ3, δ, ε, π Θ и ρ-ρ3) которые собираясь образуют Cl-ионные каналы (Macdonald & Olsen, 1994). Большинство GABAA рецепторов, как полагают, содержат две α субъединицы, две β субъединицы и одну γ или одну δ субъединицу. GABAA рецепторы опосредуют как фазовое синаптическое, так и тоническое пери-синаптическое или вне-синаптическое торможение, а некоторые противоэпилептические препараты, такие как бензодиазепины и барбитураты, действуют, усиливая токи рецепторов ГАМК (Macdonald, Kang, & Gallagher, 2012). Известна критическая роль GABAA рецептора в сети подавления (inhibition), неудивительно, что LoF мутации в генах, кодирующих GABAA рецепторные субъединицы связаны с тяжелой эпилепсией. Missense мутации в GABRG2, кодирующем GABAA рецепторную γ2 субъединицу, ассоциированы с лихорадочными судорогами с или без эпилепсии и GEFS+, тогда как более сильное укорочение в результате мутации ассоциирует с GEFS+/DS фенотипом (Harkin, Bowser, & Dibbens, 2002; Kananura et al., 2002). Более того, делеции и мутации сдвига рамки считывания в GABAA рецепторе α1 ассоциированы с DS и ювенильной миоклональной эпилепсией (JME; Cossette et al., 2002; Steel, Symonds, Zuberi, & Brunklaus, 2017).
AMPA рецепторы (AMPARs) являются тетрамерными лигандом-управляемыми ионотропными glutamatergic каналами, которые обеспечивают быстрый компонент передачи возбуждения (Traynelis et al., 2010). GRIA2 кодирует субъединицу GluA2 в AMPARs, которая особенно важна, т.к. регулирует проницаемость и voltage поправки (rectification) Ca2+ (Isaac, Ashby, & McBain, 2007). LoF варианты в GRIA2 также ассоциируют с NDD + E (Salpietro et al., 2019). GRIA2 пациенты могут обладать спектром фенотипических отклонений, включая, ID, задержку развития или регрессию, ASD, нарушения речи и судороги, особенно rolandic spikes (Salpietro et al., 2019).
NMDA рецепторы являются лигандом управляемыми ионотропными glutamatergic каналами, которые обеспечиваю проницаемость Ca2+, медленный компонент синаптического тока, который играет ключевые роли в формировании и созревании возбуждающих синапсов и цепей (circuits) (Traynelis et al., 2010). Семейство генов GRIN кодирует три класса субъединиц NMDA рецепторов (NMDAR): glycine-связывающую GluN1, glutamate-связывающую GluN2 и glycine-связывающую GluN3. Большинство NMDARs являются тетрамерныцми ансамблями из двух GluN1 и двух GluN2 субъединиц. Мутации в GRIN1, GRIN2A и GRIN2B генах, кодирующих GluN1, GluN2A и GluN2B NMDAR, как было установлено, вызывают NDDs, такие как ID и ASD и NDD + E (XiangWei, Jiang, & Yuan, 2018). Недавно найдены, de novo гетерозиготные missense мутации в GRIN1, скорее всего, в результате LoF, у пациентов с тяжелой ID, нарушениями движения и судорогами (Lemke et al., 2016). Варианты в GRIN2A и GRIN2B объясняют большинство описанных вызывающих болезнь вариантов. De novo варианты в GRIN2A преимущественно ассоциированы с NDD + E и особенно с epilepsy-aphasia спектром (EAS; Carvill et al., 2013). Интересно, что они могут быть как missense вариантами, так и предположительно GoF или LoF укороченными вариантами (Myers et al., 2019). Механизмы, с помощью которых гаплонедостаточность GRIN2A может способствовать гипервозбудимости, неизвестны. С др. стороны, GRIN2B преимущественно ассоциирует с NDDs, такими как ID и ASD, но мутации также участвуют в NDD + E, таких как синдром Lennox-Gastaut и синдром West (Allen et al., 2013; Myers et al., 2019). Интересно, что недавнее функциональное исследование установило, что missense мутации, обнаруженные при синдроме Lennox-Gastaut и у ID пациентов, обнаруживают эффект LoF, тогда как те, что обнаруживаются при синдроме West обнаруживают эффект GoF (Fedele et al., 2018). Т.о., LoF в GRIN2A, по-видимому, строго ассоциированы с судорогами, взаимоотношения между GRIN2B и судорогами более сложные.
SYNGAP1 кодирует синаптический Ras-GTPase-активирующий белок SynGAP, экспрессирующийся главным образом в синапсах возбуждающих нейронов. SynGAP является ключевым медиатором RAS-сигнального каскада, активируемого NMDA рецептором в пост-синаптических уплотнениях, регулирует формирование, развитие и созревание дендритных шипов (spines) (Jeyabalan & Clement, 2016). De novo nonsense варианты SYNGAP1 приводят к гаплонедостаточности, что ведет к формированию ID с эпилепсией, наз. MRD5. SynGAP LoF, как было установлено, имеет существенные последствия для гомеостаза и развития нейронов, нарушая обучение и память (Jeyabalan & Clement, 2016).
Cyclin-dependent kinase-like 5 (CDKL5) является serine threonine киназой, которая располагается в ядрах и дендритах нейронов и выполняет плейотропные роли в пролиферации клеток, миграции нейронов, аксональных выростах, морфогенезе дендритов и формировании и поддержании синапсов (Zhu & Xiong, 2019). Безусловно, CDKL5 является важным для обеспечения стабильности возбуждающих синапсов в пост-синаптических окончаниях (Ricciardi et al., 2012). Патогенные LoF варианты в CDKL5 вызывают CDKL5-deficiency нарушение (CDD), X-сцепленное нарушение, преимущественно затрагивающее женщин и характеризующееся refractory эпилепсией с ранним началом, гипотонией, задержкой развития, умственной задержкой и нарушениями зрения (Olson et al., 2019). По многим аспектам фенотипический спектр CDD напоминает Rett синдром (RTT) и обычно рассматривается как 'early seizure variant' синдрома RTT (Mari et al., 2005). Однако, поскольку он связан с CDKL5, принадлежащему к тому же самому молекулярному пути, что и MECP2, то болезнь-вызывающий ген при RTT, CDD сегодня считается отдельной клинической формой (Fehr et al., 2013). 1.4 Pre-clinical models of NDD + E Генетически значимые модели болезней, которые в точности воспроизводят фундаментальные аспекты патофизиологии NDD + E и фенотип, являются важными для разработки и тестирования пре-клинически новых генотерапий. Недавние успехи в редактировании генов облегчили генерацию трансгенных модельных животных (Doudna, 2020; Gonzalez-Sulser, 2020). Путем воспроизведения мутаций, обнаруживаемых у пациентов, эти модели часто выявляют ключевые свойства NDD + E и сегодня рутинно используются для тестирования безопасности и эффективности генотерапии. Однако, животные модели не могут воспроизвести все аспекты развития человека, генетику и патологию и часто неспособны предоставить полный спектр NDD + E фенотипов (Fallah & Eubanks, 2020; Gonzalez-Sulser, 2020; Won, Huang, Opland, Hartl, & Geschwind, 2019; Zhao & Bhattacharyya, 2018). Человеческие in vitro модели болезней часто предоставляют захватывающие возможности воспроизведения специфичных для людей свойств нейрального развития, улучшая наше понимание NDD + E и нашу способность эффективно переносить терапию в клинику (Amin & Pasca, 2018; Tidball & Parent, 2016; Table 1). Table 1. Mouse and human stem cell models for NDD + E 1.5 Animal models of NDD + E Генерирование и характеристика NDD + E животных моделей является важным для выяснения критических патологических механизмов и тестирования новых терапий пре-клинически in vivo
Многие трансгенные модели на дрозофиле и рыбках данио нарушений нейрального развития и эпилепсии были сгенерированы, они воспроизводят аспекты патологии человека (Bellosta & Soldano, 2019; Griffin et al., 2018; Vaz, Hofmeister, & Lindstrand, 2019). Эти модели подтверждают значительные успехи в нашем понимании лежащей в основе патофизиологии NDD + E а модели на рыбках данио использованы в качестве инструмента высоко-производительного скрининга новых AEDs. Однако, множество отличий в нейральном развитии не позволяет делать прямой перенос между моделями не млекопитающими и пациентами. Безусловно беспозвоночные виды лишены формирования слоистой коры головного мозга, центральной части возникновения NDD + E (Griffin et al., 2018). Важные генетические и структурные отличия в нейральном развитии между моделями не млекопитающими и людьми означают, что многие молекулярные, клеточные, поведенческие и сетевые изменения, ассоциируемые с NDD + E не могут быть сравнены непосредственно, а вместо этого базируются на тщательной интерпретации клеточных и поведенческих показателей (Praschberger et al., 2017).
Хотя всё ещё присутствуют множественные ограничения по фенотипу, модельные грызуны генетически и онтогенетически довольно сходны с людьми, поэтому они часто выбираются для тестирования генотерапии in vivo. Безусловно, недавние успехи в редактировании генов с использованием CRISPR-Cas9 делают возможным быструю генерацию множества трансгенных мышиных моделей для NDD + E, пригодных для пре-клинических исследований. С мышиных моделей наиболее эффективен переход к клинике, важно, что они отображают как конструктивную валидность (сходство на генотипическом уровне), так и фенотипическую валидность (сходство на симптоматическом уровне) . Генерация knock-in мышиных моделей с мутациями, обнаруживаемыми у пациентов, наилучшим образом обеспечивают construct validity, а тщательный анализ поведенческих и судорожных проявлений необходим, чтобы демонстрировать face validity (пригодность) (Fallah & Eubanks, 2020; Gonzalez-Sulser, 2020; Katz et al., 2012; Silverman & Ellegood, 2018). 1.6 Models of mutations that cause NDD + E through changes in gene expression Эти модели являются менее механически прямыми, чем изменения в ионных каналах или синаптических белках, которые могут быть напрямую связаны с измененной нейронной активностью. Поэтому неудивительно, что некоторые модели, которые воспроизводят изменения в регуляторных генах, ассоциированных с NDD + E , могут иметь варьирующее сходство в отношении эффектов мутаций человека.
Для моделирования синдрома Rett доступно несколько мышиных моделей, экспрессирующих разные типы мутаций MECP2, включая укороченные (Mecp2 R168X и R255X) и missense мутации (Mecp2 T158A, T158M, Y120D и R306C), найденные у пациентов (Bertoldi et al., 2019; Gandaglia et al., 2019; Goffin et al., 2011; Guy, Hendrich, Holmes, Martin, & Bird, 2001; Katz et al., 2012; Lyst et al., 2013; McLeod et al., 2013). Mecp2 мышиные модели обнаруживают широкий спектр фенотипов, которые напоминают синдром Rett, включая моторные и сенсорные нарушения, поведенческие нарушения, судорожные мышечные движения и спонтанные или вызванные манипуляциями судороги (Fallah & Eubanks, 2020; Katz et al., 2012).
Первая мышиная модель FXS была получена с помощью Fmr1 KO и полностью лишена экспрессии Fmrp. Однако, у людей FXS обусловлен X-сцепленной инактивацией гена Fmr1 и поэтому пациенты всё ещё экспрессируют FMR1 вплоть до 10th недель беременности. Чтобы преодолеть эти ограничения и достичь лучшей construct validity, были сгенерированы некоторые с CGG repeat knock-in мыши (Baskaran et al., 2002; Bontekoe et al., 2001; Entezam et al., 2007). Обе knock-in модели обнаруживают пониженную экспрессию FMRP, но в варьирующей степени в зависимости от региона головного мозга. Однако, в отличие от FXS пациентов, ни одна из этих мышиных моделей не демонстрирует в действительности гиперметилирование вставленных CGG повторов, указывая тем самым, что снижение экспрессии FMRP происходит в результате разных механизмов у мышей и людей (Brouwer et al., 2008; Entezam et al., 2007). Аудиогенные, но не спонтанные судороги были описаны у мышей, моделирующих FXS; однако, данные EEG подтверждают сеть гипервозбудимости (Lovelace, Ethell, Binder, & Razak, 2018). Fmr1 KO мыши обладают рядом поведенческих аномалий, таких как перевозбуждение (hyperarousal), страхи, нарушение социальных взаимодействий и снижение способности построения гнезда или судороги, вызванные манипуляциями, поведение, связанное с закапыванием остатков пищи (marble-burying), а также когнитивные нарушения (Dahlhaus, 2018).
Сегодня доступны трансгенные мыши, с воссозданием генотипа AS с потерей экспрессируемого материнского аллеля, тогда как отцовский аллель, замалчиваемый с помощью импринтинга, сохраняется (Ube3am-/p+) (Rotaru, Mientjes, & Elgersma, 2020). Они обнаруживают многие ключевые нейрологические свойства нарушения, такие как дефицит двигательной активности, аномалии EEG, страхи и аудиогенные или индуцированные flurothyl судороги, но имеют лишь незначительный дефицит познавательной способности и не обнаруживают спонтанных судорог (Rotaru et al., 2020).
Гетерозиготные TSC мышиные модели обнаруживают слабый NDD фенотип с дефицитом познавательной способности и социальными нарушениями, но не обнаруживают обычных TSC повреждений или судорог (Ehninger et al., 2008; Goorden, van Woerden, van der Weerd, Cheadle, & Elgersma, 2007). Поскольку гомозиготное состояние является эмбриональной леталью, кондиционные KO, использующие floxed аллели, необходимы для возникновения более тяжелых фенотипических отклонений, как у пациентов (Sahin et al., 2016). 1.7 Models replicating mutations in ion channel genes Имеется всё увеличивающееся количество доступных мышиных моделей, воспроизводящих SCN1A LoF мутации, обнаруживаемые при DS. Такие линии мышей включают целенаправленно вызванные делеции в Scn1a экзоне 1 и экзоне 26, также как и knock-ins of missense и мутации укорочения, наблюдаемые у пациентов: Scn1a R1407X, R1648H, E1099X и A1783V (Martin et al., 2010; Miller, Hawkins, McCollom, & Kearney, 2014; Ogiwara et al., 2007; Ricobaraza et al., 2019; Tsai et al., 2015; Yu et al., 2006). Scn1a+/- обычно обнаруживают спонтанные и вызванные гипертермией судороги, с внезапной и интертектальной эпилептиформной активностью. Недавно полученная мышиная модель Scn1a A1783V
также обнаруживала когнитивные нарушения, страхи и гиперактивное поведение, воспроизведение всего спектра DS фенотипов (Ricobaraza et al., 2019). Однако, тяжесть фенотипических отклонений и жизнеспособность сильно зависели от генетического фона линии, благодаря присутствию специфичных для этой линии генетических модификаторов (Miller et al., 2014; Mistry et al., 2014; Mulligan et al., 2019).
Получены мышиные модели, моделирующие LoF и GoF мутации в SCN2A (Hedrich, Lauxmann, & Lerche, 2019). Scn2a KO мыши, моделирующие гаплонедостаточность, обнаруживают спектр аутизм-подобных фенотипов, таких как гиперактивность, страхи, нарушения социального и коммуникативного поведения, также как и дефицит познавательной способности (Lena & Mantegazza, 2019; Middleton et al., 2018; Spratt et al., 2019; Tatsukawa et al., 2019). Более того, кондиционные KO of Scn2a в возбуждающих нейронах переднего мозга обнаруживают absence-подобные судороги, ассоциированные с spike-волновыми разрядами. (Ogiwara et al., 2018). Трансгенные Scn2aQ54 GoF мыши обладают частичными и absence-подобными судорогами с началом в 2 мес., а также стереотипное повторяющееся поведение (Kearney et al., 2006). Однако, в то время как пациенты с SCN2A энцефалопатией обнаруживают разного типа фокальные судороги, absence-подобные судороги, обычно не описываемые, это указывает на возможный видо-специфический эффект (Hedrich et al., 2019; Howell et al., 2015).
Две knock-in мышиные модели SCN8A энцефалопатии были созданы путем вставки менее тяжелой Scn8a N1768D и более тяжелой R1872W GoF мутаций, которые встречаются у пациентов. Мыши, как было установлено, оказались более чувствительными к GoF мутациям в Scn8a, так N1768D мыши обнаруживают спонтанные судороги, начинающиеся с 2 мес. возраста и вызывающие преждевременную гибель вследствие возникновения в промежуток между 1 - 4 неделями. R1872W имеют более тяжелый фенотип со спонтанными судорогами, начинающимися с 14 дневного возраста и приводящие к преждевременной гибели в течение 24 ч. (Bunton-Stasyshyn et al., 2019; Veeramah et al., 2012).
Гетерозиготная KO мышиная модель KCNQ2 впервые была получена в 2000 и обнаруживала повышенную чувствительность к индуцированным pentylenetetrazole (PTZ) судорогам, но не к спонтанным судорогам (Watanabe et al., 2000). Позднее мутации KCNQ2 и KCNQ3 LoF наблюдали у пациентов с BFNIE , эти мутации были вызваны knocked-in у мышей для получения двух новых мышиных моделей (Singh et al., 2008). Гетерозиготные knock-in мыши обнаруживают пониженный порог к судорогам, индуцируемым электрическими импульсами, тогда как гомозиготные knock-in обнаруживали спонтанные генерализованные tonic-clonic судороги с ранним началом, как это наблюдалось и у пациентов.
P924L GoF мутации в KCNT1, которые наблюдались у двух пациентов с EIMFS были недавно воспроизведены с помощью knocked-in на мышиной модели. Гетерозиготные мыши не обнаруживали какого-либо повышения чувствительности к судорогам, вызываемым термально или химически, и к нарушениям двигательной активности. Однако, гомозиготные мыши не имеют спонтанных судорог и дефицита поведения и снижения продолжительности жизни (Burbano et al., 2018). 1.8 Models of mutations in synaptic proteins Разные Stxbp1+/- мутантные мыши были получены, чтобы воспроизвести вызываемую STXBP1 гаплонедостаточность у людей (Chen et al., 2020; Kovacevic et al., 2018; Miyamoto et al., 2017; Orock, Logan, & Deak, 2018). Stxbp1+/- мыши обнаруживают судорожные мышечные движения (myoclonic jerks), spike-wave разряды, нарушения когнитивной способности, гиперактивность и страхи с измененным социальным поведением. Интересно, что делеция Stxbp1 специфически в GABAergic промежуточных нейронах приводит к ранней летальности, подтверждая критическую роль Stxbp1 в ингибирующих нейронах (Kovacevic et al., 2018). Дальнейшие исследования показали, что Stxbp1+/- мыши обнаруживают снижение силы в синапсах PV+ промежуточных нейронов подобно тому, как это происходит при снижении числа уже готовых к высвобождению пузырьков или вероятности высвобождения, а также при снижении коммуникаций у SST+ промежуточных нейронов по сравнению с пирамидальными нейронами, приводя к снижению подавляющих сигналов (Chen et al., 2020).
Мыши, постоянно лишенные SynI, SynII или обоих (SynKO) постоянно обнаруживают нарушения подавляющей функции и облегченную передачу возбуждающих сигналов (Baldelli, Fassio, Valtorta, & Benfenati, 2007; Chiappalone et al., 2009; Farisello et al., 2013). Такой дисбаланс между возбуждением и подавлением проявляется у SynKO мышей помимо явного эпилептического фенотипа и поведенческими нарушениями, включая дефекты социальных взаимодействий, указывающие на фенотип РАС и когнитивные нарушения (Greco et al., 2013; Michetti, Caruso, et al., 2017).
В противоположность пациентам с BFNIE или PKD/IC, пациенты с мутациями PRRT2s, и PRRT2 KO мыши обнаруживают спонтанные судороги. Однако, они имеют двигательные пароксизмы, такие как проблемы с походкой и хождением задом наперед, это воспроизводит распространенный фенотип PKD, наблюдаемый у PRRT2 пациентов (Michetti, Castroflorio, et al., 2017).
Напротив, в отношении dynamin, были идентифицированы модели по фенотипу, когда мутантные 'fitful' мыши были идентифицированы посредством прямого генетического подхода, проявляли спонтанные судороги в возрасте 2-3 месяцев и, как было обнаружено, имели мутацию в высоко консервативном экзоне DNM1, приводящую к доминантно-негативному эффекту (Boumil et al., 2010). Более того, мутации, располагающиеся в одной из двух альтернативных изоформ dynamin 1, т.к. экспрессия мутантной изоформы была выше в ходе последующего развития головного мозга, это может быть объяснено началом проявления симптомов после созревания. Гомозиготные судорожные ('fitful') мыши обладают дополнительным атаксическим фенотипом с нарушениями слуха и зрения, а также с летальными судорогами (Boumil et al. 2010). Интересно, что доминантно-негативный эффект осуществляется с помощью DNM1 fitful мутации, необходимой для эпилептического фенотипа, т.к. Dnm1 нулевые мыши не имеют судорог (Ferguson et al., 2007).
Пост-синаптические рецепторы были также моделированы in vivo. Мышиная модель GABRG2 Q390X укорачивающей мутации при DS также была недавно сгенерирована (Kang, Shen, Zhou, Xu, & Macdonald, 2015) Используя эту модель, Kang et al. установили, что мутация генерирует обнаружимую укороченную γ2 субъединицу, которая не подвергается nonsense-обусловленному распаду мРНК, а вместо этого накапливается в ER, где она оказывает доминантно-негативный эффект на WT субъединицу. Gabrg2+/Q390X knock-in мыши обнаруживают тяжелую эпилепсию с помощью P19 с тонико-клональными судорогами с interictal эпилептиформной активностью, также с повышенной чувствительностью к судорогам, вызываемым тепловым воздействием, нарушениями памяти и социального поведения (Warner, Liu, Macdonald, & Kang, 2017). Модельные мыши Gabra1+/- DS также существуют, такие гетерозиготные мыши обнаруживают достоверное повышение спонтанной гибели, absence-like эпилепсии с медленными кортикальными пиками (spike) и волнами разрядов (Arain, Boyd, & Gallagher, 2012). Однако, эти мыши не обладают спонтанными генерализованными tonic-clonic судорогами, как это наблюдается у GABRA1 пациентов (Steel et al., 2017).
GluN1 гипоморфные мыши сохраняют только 5%-10% экспрессии обязательной GluN1 NMDA рецепторной субъединицы и первоначально было предположено, что они могут служить моделью шизофрении из-за дефицита сенсомоторного стробирования (gating) (Duncan, Moy, Lieberman, & Koller, 2006). Но дальнейшие поведенческие тесты показали дефицит в ряде когнитивных тестов, подтвердивших, что это может быть моделью ID (Barkus, Dawson, Sharp, & Bannerman, 2012). Более того, гомозиготные, но не гетерозиготные делеции Grin1 экзона 5 ведут к повышенной чувствительности к судорогам, вызываемыми химическими соединениями (Liu et al., 2019). Наблюдались эпилептиформные разрядки, также как и структурные альтерации в коре головного мозга Grin2a KO мышей, но не спонтанные судороги (Salmi et al., 2018).
Syngap1 гетерозиготные KO мыши обнаруживают как construct, так и face validity для формы ID с эпилепсией, наз., MRD5, с 50% снижением SynGAP белка, приводящем в результате к дефициту когнитивной способности , спонтанной interictal активности и снижению порога для судорог (Clement et al., 2012; Ozkan et al., 2014).
Cdkl5 KO мышиные модели CDD были получены и они воспроизводили некотлорые фенотипические признаки, наблюдаемые у пациентов, такие как гипервозбудимость и дефицит социальных взаимодействий, нарушения зрения и памяти (Amendola et al., 2014; Okuda et al., 2018; Wang et al., 2012). Однако, несмотря на преобладание судорог у CDD пациентов, Cdkl5 KO мыши не обнаруживали спонтанной ictal или interictal активности, хотя они были чувствительны к судорогам, вызываемым NMDA (Okuda et al., 2018).
В целом, поскольку гены, участвующие в нарушениях гоа человека, часто законсервированы у грызунов, их функция могут быть не столь критической, чтобы вызывать полную поведенческую неспособность, ассоциированную с NDD + E. Это особенно наглядно, когда эффект мутации косвенный, т.е. опосредован измененной экспрессией гена. У гетерозиготных мышей это также, по-видимому, возможно, что вызывает компенсаторные механизмы, оказывающие эффекты, которые не присутствуют или менее выражены у людей. Следовательно, не все мышиные модели воспроизводят фенотипические отклонения, наблюдаемые у людей, и часто мыши разводятся до гомозиготного состояния до появления симптомов (напр. спонтанных судорог). Мышиные модели также обнаруживают строгие фенотипические эффекты от генетических модификаторов, в частности разные линии мышей демонстрируют важность генетического фона и указывают на то, что многие неизвестные модифицирующие факторы могут влиять на проявления NDD + E у людей (de Lange et al.., 2020; Mistry et al., 2014). Важно, что в некоторых случаях хотя и развивается ранняя пост0натальная эпилепсия у модельных животных с NDD + E, спонтанные судороги обнаруживают тенденцию позднего появления у взрослых, как у мышиных моделей Tsc1+/- (Gataullina et al., 2016). Этот аспект может быть обусловлен видо-специфическими компенсациями или различиями в патофизиологии NDD + E. У Tsc1+/- мышиных моделей отсутствие tubers может быть возможным объяснением отличий с патологией у людей (Gataullina et al., 2016).Несмотря на это, оценка потенциальной терапии при ранних эпилептических проявлениях всё ещё важна для определения возможности лечения у юных пациентов и и для анализа влияния этих подходов на возникновение конгнитивных дефектов. 1.9 In vitro human models of NDD + E Недавно исследователи разработали модели на клетках человека NDD + E, это предоставляет благоприятные возможности использование технологий на человеческих эмбриональных (hESC) и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (hiPSC) technology (Niu & Parent, 2020). hiPSCs позволяют моделировать болезни путем генерации нейрональных клеток, которые несут специфическую генетическую информацию о пациентах, и для тестирования генотерапии в контексте человеческого генома (Zhao & Bhattacharyya, 2018). Поскольку невозможно наблюдать поведение in vitro, то соотв. модели in vivo остаются необходимыми для изучения путей, биохимически, морфологических и электрофизиологических характеристик происходящих из hiPSC нейронов и глии для подтверждения важных патологических механизмов и мишеней, лежащих в основе NDD + E у людей. 1.9.1 Early 2D human stem cell models Некоторые из первых из человеческих клеток моделей NDD + E были разработаны, чтобы моделировать DS, и некоторые ранние результаты подчеркнули затруднения в использовании нейронов, происходящих из iPSCs. Напр., хотя у мышей, DS четко ассоциирует с потерей возбудимости промежуточных нейронов, ранние исследования с использованием происходящих из iPSC нейрональных клеток подтвердили counterintuitive GoF эффект для A5768G, Q1923R и F1415I missense мутаций в SCN1A, обнаружив повышенную возбудимость как возбуждающих, так и подавляющих нейронов (Jiao et al., 2013; Liu et al., 2013). Однако, короткая дифференцировка этих клеток (4-8 недель) у моделей в ранней фазе созревания in vivo, поскольку контрольные происходящие из hiPSC нейроны обнаруживали лишь короткие цепочки AP, подтверждая наследственную функциональную незрелость. Когда последующие исследования сконцентрировались на анализе их электрофизиологических показателей функционально зрелых нейронов путем совместного культивирования нейронов на монослое из кортикальных астроцитов крыс (Higurashi et al., 2013; Sun et al., 2016), то они выявили четкий LoF эффект в DS промежуточных нейронах, несущих SCN1A S1328P missense и R1645X укороченные мутации , со снижением тока Nav и расходования (firing) AP, чего не наблюдается в возбуждающих нейронах. Т.о., идентификация клеточных фенотипов нейронов, происходящих из hiPSC, необходима в функциональных зрелых нейронах, чтобы идентифицировать дефекты, присутствующие у пациентов.
Дополнительным затруднением моделей из стволовых клеток людей стала роль генетического фона. Ранние исследования проводили с использованием только одного пациента и одной линии соотв. возраста контрольных hiPSC. Теперь же мышиные модели и семьи, несущие индивидуальные мутации повторно подтвердили, что различия в генетическом фоне вносят вклад в различия в тяжести NDD + E. Поскольку использование множественных линий клеток могло бы помочь прояснить эффекты генетической гетерогенности, то изогенные пары являются наиболее подходящими для решения этого вопроса. Изогенные hiPSC пары обычно создаются с помощью CRISPR-Cas9 путем коррекции мутаций, вызывающих болезнь, в линии hiPSC пациента или путем внесения их в контрольную линию, тем самым создаются пары клеточных линий, идентичных по генетическому фону и отличающиеся только присутствием или отсутствием специфических мутаций (Hockemeyer & Jaenisch, 2016). Сравнение изогенных линий пациента и контрольных линий позволило идентифицировать мощные фенотипически отклонения, зависящие исключительно от мутации. Напротив, возможно генерировать изогенные линии, используя мутантные и не мутантные первичные клетки от мозаичных индивидов (Maeda et al., 2016). 1.9.2 Mutations affecting gene regulation in 2D hiPSC models Мутации, которые известны, как оказывающие влитяние на регуляцию множественных генов, особенно существенны в возникновении различий между видами. Т.о., модели, происходящие из hiPSC, являются центральными для подтверждения, что предполагаемые патологические механизмы, выявляемые у мышей (или др. видов) имеют значение и для людей. Однако, косвенные эффекты мутаций, указывают, что альтерации миграции клеток (напр.), которые наиболее привлекательны для моделирования in vitro, могут ограничивать некоторые более простые 2D hiPSC модели.
hiPSC модели синдрома Rett были получены с использованием теста на потенциальные воздействия непосредственно на клетки пациента (Marchetto et al., 2010). Rett hiPSC-производные нейроны обнаруживали уменьшение размеров, роста нейритов, формирования glutamatergic синапсов и спонтанной активности. Более того, изогенные контроли могут возникать посредством инактивации X-хромосомы (Cheung et al., 2011). Важно, что исследования установили, что контрольные нейроны, культивируемые совместно с астроцитами, происходящими из Rett syndrome hiPSCs, обнаруживали сходные аномалии морфологических фенотипов, подчеркивая важность включения глиальных клеток в модели болезни in vitro (Williams et al., 2014).
Нейроны, дифференцированные от CDD hiPSC линии пациентов, обладали мутацией CDKL5, вызывающей снижение формирования синапсов и увеличение длины дендритных шипов (spine) (Ricciardi et al., 2012). Недавно исследование по сравнению нейронов, дифференцирующихся из MECP2 и CDKL5 мутантных iPSC линий, обнаружили общие альтерации в экспрессии glutamate D1 рецептора GluD1 (Livide et al., 2015). Эта работа позволила ещё больше прояснить биологические основы сходство фенотипов, наблюдаемых у CDD и RTT пациентов.
FXS смоделирован с использованием hESCs, выделенных из эмбрионов человека, идентифицированных посредством пре-имплантационной генетической диагностики, и hiPSCs, полученных от пациентов FXS (Urbach, Bar-Nur, Daley, & Benvenisty, 2010). Интересно, что сравнение этих клеток выявили различия в экспрессии гена FMR1. В FXS hESCs, ген FMR1 сначала экспрессируется, но затем становится транскрипционно молчащим после дифференцировки, тогда как в FXS hiPSCs локус FMR1 остается неактивным до тех пор, пока он не примет транскрипционно активное состояние в результате репрограммирования. Однако, поскольку FXS hiPSCs не моделируют зависимое от дифференцировки молчание гена FMR1, они остаются ценными инструментами для анализа роли FMR1 в нервных клетках, поскольку и в FXS iPSCs и FXS нейронах FMR1 ген метилирован (Urbach et al., 2010). Нейроны, происходящие из FXS hiPSCs, обнаруживают уменьшение длины нейритов и формирования синапсов, а также увеличение амплитуды и частоты переходов кальция, указывающее на состояние (network) гиперактивности (Liu et al., 2018).
Клетки нейральных предшественников дорсального телэнцефалона, полученные от TSC пациентов с гетерозиготными TSC2+/- мутациями. обнаруживают повышенную пролиферацию в некоторых исследованиях (Li et al., 2017), но не во всех (Zucco et al., 2018). Сходным образом, исследования изменений в клеточной возбудимости и сетевой активности, показали конфликтующие результаты для TSC2+/- нейронов (Costa et al., 2016; Nadadhur et al., 2019). Подобно мышиным моделям, полная потеря TSC1 или TSC2, по-видимому, необходима для достижения соотв. TSC фенотипа в возбудимых кортикальных нейронах (Afshar Saber & Sahin, 2020). Это может быть обусловлено тем фактом, что др. типы нервных клеток также участвуют в патогенезе болезни и необходимы для воспроизведения патологии болезни. Интересно, что гетерозиготы по мутациям TSC1 и TSC2 в клонах олигодендроглии приводят к увеличению пролиферации олигодендроглии и снижению созревания (Nadadhur et al., 2019).
Однако, поскольку происходящие из iPSC нейроны растут в 2D, то это может стать инструментом для дальнейшего понимания механизмов болезни у людей, они лишены многих отличительных характеристик развивающегося головного мозга людей. Напр., межклеточные и секретируемые лигандом и рецептором взаимодействия являются критическими для контроля нейрального развития и синаптической активности, но их сигнальные динамики затруднены, когда нейроны растут в монослое. Более того, 2D культуры часто лишены глии и могут удерживаться лишь ограниченное количество времени, предотвращая возникновение важных характерных для поздних стадий онтогенетических свойств, таких как глиогенез и миелинизация, а также дальнейшее электрофизиологическое и синаптическое созревание. Поэтому исследователи теперь наблюдают за развитием 3D человеческих моделей болезней, используя органоиды человеческого головного мозга (Amin & Pasca, 2018). 1.10 3D human stem cell models Органоиды головного мозга генерируются ненаправленным способом в отсутствие индуктивных сигналов, приводя к появлению 3D структур, представленных клетками из множественных регионов головного мозга, таких как кора, сетчатка или задний мозг (Lancaster et al., 2013). Этот протокол был успешно использован для моделирования микроцефалии, идентификации преждевременной дифференцировки нейронов в качестве ключевого патогенетического механизма. Однако, этот метод базируется на стохастической генерации разных типов клеток нейронов, он обнаруживает высокий уровень batch-to-batch изменчивости. Недавно исследователи тестировали специфические комбинации морфогенов и сигнальных молекул, которые могут формировать паттерн 3D агрегатов в специфические регионы головного мозга , такие как кора (Mariani et al., 2015; Pasca et al., 2015; Qian et al., 2016). Транскриптомный и эпигеномный анализ выявил, что человеческие кортикальные cфероиды (hCS) могут правильно воспроизводить плодное и раннее пост-натальное развитие коры человека (Pasca et al., 2015; Trevino et al., 2020). hCS , происходящие от AS пациентов обнаруживали признаки эпилептоидной активности, что доказывается повышенной синхронностью сети пирамидальных нейронов, вызываемой за счет усиления активности BK каналов (Sun et al., 2019). Важно, что эти результаты были также подтверждены у мышей, моделирующих AS, ult использовали антагониста BK канала, усиливающего чувствительность к судорогам. Это указывает на то, что использование в комбинации человеческих и мышиных моделей может стать мощным способом установления патологических механизмов и улучшения нашей способности доклинически тестировать новые методы лечения.
hCS были также использованы, чтобы моделировать TSC, но как и в случае мышей и 2D моделей полная потеря TSC в результате двуударной соматической мутации необходима для патогенеза (Blair, Hockemeyer, & Bateup, 2018). Как и в случае 2D моделей это может быть обусловлено тем фактом, что hCS единственные содержат возбуждающие нейроны переднего мозга, а использование органоидных моделей, содержащих др. типы нервных клеток, таких как промежуточные нейроны, может приводить к разным исходам.
В самом деле, когда hCS были нацелены на передний мозг, на обеспечение паллиальной судьбы, то они не содержат тормозных нейронов, которые генерируются в субпаллиальной области и мигрируют по касательной, чтобы встретиться со своими корковыми возбуждающими партнерами во время развития (Wonders & Anderson, 2006). Следовательно, чтобы исследовать роль GABAergic промежуточных нейронов при болезнях, сливали human subpallium spheroids (hSS) с hCS, чтобы сформировать 'assembloids' (Birey et al., 2017). Удивительно, промежуточные нейроны, сгенерированные в hSS мигрируют в hCS и формируют функциональные синапсы с возбуждающими нейронами, создавая кортикальные microcircuits. В недавнем исследовании использованы эти модели, чтобы показать критическую и неожиданную роль CACNA1C в миграции промежуточных нейронов (Birey et al., 2017). Кортикальные органоиды могут быть также использованы для моделирования взаимодействий между нейронами и глией во время нейрального развития и при болезнях, т.к. они содержат астроциты и модифицированный протокол может быть использован для индукции генерации миелинизации олигодендроцитов (Marton & Pasca, 2020).
Трансгенные мышиные модели оказались пригодными для углубления нашего понимания биологических основ NDD + E и они составляют фундаментальную платформу для разработки новых генотерапий in vivo. Однако, важны межвидовые различия в генетике и нейральном развитии между мышами и людьми, что не позволяет некоторым мышиным моделям полностью воспроизводить NDD + E фенотипы и это означает, что изучение мышиных моделей должно всё больше сопровождаться параллельными данными на клетках людей. Недавние успехи на 2D и 3D моделях нервных болезней открывают возможность идентификации специфичных для людей признаков мутаций, связанных с NDD + E и тестирования генотерапии внутри контекста генома человека. Однако, человеческие модели всё ещё имеют сильные ограничения и не воспроизводят полностью физиологическую структуру головного мозга и не включают внешние стимулы, которые является фундаментальными во время развития. Следовательно, комбинирование in vivo мышиных моделей и in vitro человеческих моделей NDD + E может быть способом пролить новый свет на эти нарушения и улучшить нашу способность их переноса в новые генотерапии в клинике. 2 Gene therapy for NDD + E Генотерапия нацелена на облегчение болезней путем внесения генетического материала в клетки мишени, чтобы восстановить в них физиологические функции. Для большинства нарушений NDD + E лежащие в основе клетки являются нейронами и поэтому физическая доступность создает узкое горлышко. Это из-за того, что терапия нуждается в доставке в ЦНС или непосредственно в головной мозг, обходя гемато-энцефалический барьер (BBB) или системным введением, способным эффективно целенаправленно воздействовать на весь головной мозг.
Дополнительным ограничением является то, что генотерапия NDD + E может нуждаться в воздействии в критический период прежде, чем будут созданы зрелые circuits, возможно даже во время эмбриогенеза, чтобы восстанавливать все аспекты патогенных фенотипов (Wykes & Lignani, 2018) (Table 2). Table 2. 2.1 Classical gene therapy approaches: Gene replacement or supplementation Большинство исследований по генотерапии NDD + E фокусировано на экзогенных нарушениях экспрессии генов. Наиболее прямым из этих подходов является доставка дополнительного трансгена в клетки, лишенные гена, способного восстанавливать их нормальную функцию. Альтернативно, инструменты, которые избирательно снижают экспрессию генов мишеней могут быть использованы, такие как антисмысловые олигонуклеотиды (ASOs) илди РНК интерференция (RNAi; Rinaldi & Wood, 2018; Setten, Rossi, & Han, 2019). В то время как эти методы оказываются успешными и приводят к клиническим испытаниям при ряде болезней (High & Roncarolo, 2019), прогресс при NDD + E отстает и испытания только начинаются (напр., Stoke Therapeutic and Encoded Therapeutics при Dravet синдроме или Ultragenyx при синдроме Angelman), подтверждая, что эти нарушения могут выиграть по сравнению с более сложными стратегиями. Кроме того, нарушения уровней экспрессии генов, участвующих NDD + E часто требую более тщательного дозирования из-за важной роли этих генов, важных для развития нервной системы. В самом деле, чрезмерное превышение необходимого изменения в экспрессии генов часто связано с его собственной патологией NDD (Meins et al., 2005; Oostra & Willemsen, 2003). Вопрос мозаицизма ещё больше осложняет целенаправленное воздействие на клетки при многих NDD + E нарушениях, вызываемых X-сцепленными генами или импринтингом аллелей, таких как FXS, RTT и AS.
Редактирование генома является многообещающей альтернативой к добавлению генов в качестве способа лечения NDD + E путем восстановления генома в нормальное состояние. Система CRISPR/Cas редактирования генов стала наиболее выдающейся в области генотерапии в последние годы в качестве программируемо формы редактирования генов (Doudna, 2020). В этом довольно простом методе CRISPR/Cas наиболее широко используется чтобы инактивровать гены на геномном уровне путем внесения инсерционных и делеционных мутаций (indels) в сайтах, где вызываются разрывы двойной нити (DSBs; Dai et al., 2016; Wang, Zhang, & Gao, 2020). Поскольку гомозиготная делеция должна предположительно усиливать большинство NDD + E, где имеют место гетерозиготные доминантно наследуемые мутации, то может оказаться возможным целенаправленное воздействие на патогенный аллель (Christie et al., 2020; Gao et al., 2018). Напротив, при методе, сходном с большинством традиционных генотерапий, каталитически dead Cas9 (dCas9) белки были адаптированы к разнообразным эффекторным доменам, таким как активаторы транскрипции (CRISPRa) и репрессоры (CRISPRi) и могут быть использованы, чтобы модулировать экспрессию эндогенных генов и тем самым поддержать нормальный биогенез (Chavez et al., 2015; Qi et al., 2013). Важно, что эти подходы отрабатывают эндогенные гены и позволяют воспроизводить сложные транскрипты мРНК; однако они все равно потребуют осторожного дозирования. Для всех, базирующихся на Cas9, подходов, серьезные опасения по-прежнему остаются относительно вызывания повышенного риска нецелевого редактирования из-за долгосрочной экспрессии и потенциального иммуногенного ответа на бактериальный белок. (Wang, Mou, & Li, 2015). В то время как иммуногенные нарушения ЦНС, ассоциирующие с антителами против ядерных белков нейронов, не являются широко распространенными, редкие формы аутоиммунных энцефалитов осуществляются за счет вовлечения мембранных белков (Platt, Agalliu, & Cutforth, 2017).
Имеется на сегодня большое количество исследований, описывающих целенаправленное воздействие на не генетическую эпилепсию (Colasante, Qiu, et al., 2020; Ingusci, Verlengia, Soukupova, Zucchini, & Simonato, 2019; Walker & Kullmann, 2020). Эти подходы имеют целью контролировать судороги, не связанные с генетическими причинами и поэтому не рассматриваются в отличие от NDD + E с известными генетическими причинами. 2.2 Gene therapy delivery for NDD + E Сегодня среди наиболее хорошо известных векторов доставки для генотерапии являются вирусные, с adeno-associated virus (AAV) в частности, являющимся предпочтительным для in vivo генотерапии (Lykken, Shyng, Edwards, Rozenberg, & Gray, 2018). AAV векторы являются однонитчатыми ДНК parvoviruses с уникальными свойствами, которые наиболее подходят для терапии, включая низкую интеграцию в геном, низкую иммуногенность и естественный тканевой тропизм (Li & Samulski, 2020). Для нарушений ЦНС, AAV9 наиболее частый выбор среди AAV из-за его естественного тропизма в отношении нейральной трансдукции и умеренной способности пересекать BBB, делающей возможной системную доставку (Manfredsson, Rising, & Mandel, 2009). AAV векторы также поддерживают долговременную экспрессию их полезной нагрузки, что желательно, когда полезная нагрузка действует как дополнение, потому что это снижает потребность в повторном дозировании. Однако, это может быть рискованным для CRISPR/Cas редактирования генома, когда продолжительная экспрессия ассоциирует с иммунной реакцией на бактериальный белок и редактирование вне мишени (Merkle et al., 2015).
AAV векторы могут доставлять и через системные вливания для лечения NDD + E или посредством стереотактический инъекций для обхода BBB in vivo. Чтобы добиться максимальной эффективности или изучать специфические регионы головного мозга, большинство исследований по проверке концепции используют stereotactic инъекции, такие как внутричерепные (IC), инъекции внутрь гиппокампа (IH) или внутрь желудочков головного мозга (ICV) . В то время как stereotactic инъекции всё ещё являются жизнеспособными маршрутами у пациентов с NDD + E, системные пути введения способны обеспечить доставку генов в нервную систему, это можно рассматривать как идеальное для клиники из-за меньшей инвазивности. У людей, это достигло наибольшей распространенности посредством внутривенного введения (IV) или intrathecally (IT) введения при нарушениях ЦНС. У грызунов, IV инъекции наиболее распространены, обычно путем введения в хвостовую вену, хотя retro-orbital и intrajugular (IJ) инъекции также используются. С помощью современных AAV векторов периферическая доставка довольно неэффективна и требует высоких доз, которые могут вызывать существенные побочные эффекты. 2.3 Current NDD + E gene therapy Как было установлено, генотерапия является эффективной при разных NDD + E у животных моделей, при этом некоторые стратегии дошли до клинических испытаний. Многие результаты таких пре-клинических исследований, по-видимому, подчеркивают важность стадии развития, на которой производится терапевтическое вмешательство, наблюдаются большие эффекты от более раннего вмешательства. 2.4 Gene therapy for NDD + E associated with altered gene expression Эти нарушения являются естественными кандидатами для генотерапии, поскольку , потому что лежащие в основе гены контролируют ряд важных нисходящих путей, на которые трудно целенаправленно воздействовать индивидуально. Несколько групп добиваются успехов в целенаправленном воздействии на причинные гены; однако время и дозировка являются важными проблемами. 2.4.1 Rett syndrome Реактивация гена Mecp2 у мышей RTT выявила достоверно отличающиеся их патологические фенотипы (Guy, Gan, Selfridge, Cobb, & Bird, 2007). Исходя из этого наблюдения, некоторые группы использовали терапию по добавлению Mecp2 на животных моделях RTT. Системные внутривенные (IV) введения в хвостовую вену само-компенсирующегося вектора AAV9 доставляли человеческий ген MECP2 мышам, нулевым по Mecp2, это было достаточным для увеличения продолжительности их жизни в среднем на 5 недель, для восстановления движений и поведенческих фенотипов и останавливали прогрессирование болезненных проявлений (Gadalla et al., 2013; Garg et al., 2013). Однако, MECP2 дупликация ассоциировала с разными NDD (Meins et al., 2005), указывая тем самым, что уровни экспрессии MECP2 должны удерживаться в узком временном окне. Величина избыточной экспрессии MECP2 при синдроме с дупликацией ассоциирует с токсичностью у мышиных моделей составляет в 1.6 раз выше нормального уровня и в 2.4 раз от нормальных уровней (Jugloff et al., 2008; Koerner et al., 2018), указывая, что экспрессия д. удерживаться ниже вдвое, чем у здоровых индивидов. Недавно, доставка склонного к нестабильности Mecp2 трансгена с неэффективной трансляцией показала, что это всё ещё улучшает проявления болезни у RTT мышей, тогда как вызывание более незначительного увеличения экспрессии Mecp2 обнаруживает потенциал меньшего риска (Luoni et al., 2020). 2.4.2 Fragile X Syndrome Терапия с помощью постнатального добавления Fmr1 подает надежду на лечение FXS, указывая, что болезненные проявления могут быть, по крайней мере, частично устранены после рождения. AAV доставка Fmr1 ослабляет дисфункцию гиппокампа и поведенческие отклонения у Fmr1-KO мышей (Gholizadeh, Arsenault, Xuan, Pacey, & Hampson, 2014; Zeier et al., 2009). Однако, поскольку двухкратное увеличение экспрессии хорошо переносится Fmr1-KO мышами, a 2.5 или более кратное увеличение вызывает двигательную гиперактивность и супрессирует старт-рефлекс по сравнению с WT мышами (Arsenault et al., 2016), подчеркивая риск, связанный с замещением FMR1. CRISPR был использован для реактивации транскрипции FMR1 в качестве альтернативы добавлению разными способами in vitro. В полученной от пациентов с FXS линии hESC, CRISPRa оказался способным реактивировать транскрипцию FMR1, но без соотв. изменений экспрессии FMRP (Haenfler et al., 2018). Считается, что это обусловлено транскрибируемыми CGG повторами, предупреждающими трансляцию FMRP, тем самым подчеркиваются потенциальные ограничения использования CRISPRa в генах, которые обычно замалчиваются. При альтернативной стратегии, CRISPR/Cas9 была использована для коррекции генетической причины FXS путем эксцизии увеличенных повторов CGG в человеческих FXS iPS клетках, вызывающей реактивацию экспрессии FMRP в 20% изолированных колоний (Xie, et al., 2016).
Др. терапевтические мишени были предложены для FXS по принципу восстановления равновесия синтеза белка и синаптической функции без соотв. возникновения изменений в FMR1 (Krueger & Bear, 2011), при этом mGluR5 была среди наиболее изученных (Bear, Huber, & Warren, 2004). Поскольку пре-клинические исследования по фармакологическому подавлению mGluR5 у FXS мышей оказались успешными (Richter et al., 2015), поэтому клинические испытания с использованием негативных аллостерических модуляторов оказались неудачными (Berry-Kravis et al., 2016) возможно из-за возникшей толерантности, которая была обнаружена у мышей (Yan, Rammal, Tranfaglia, & Bauchwitz, 2005). У FXS мышей, CRISPR-обусловленный нокаут mGluR5 в striatum у FXS мышей оказался достаточным для устранения поведения преувеличенных повторений (Lee, Lee, et al., 2018), это повышает потенциал, что генотерапия против mGluR5 может быть успешной, когда лекарства оказываются недейственными. Недавно идентифицирован GSK3? путь в качестве альтернативной мишени с предпочтительным профилем побочных явлений в отношении mGluR5 (McCamphill, Stoppel, Senter, Lewis, & Heynen, 2020).
2.4.1 Rett syndrome Поскольку синдром Angelman вызывается LoF мутациями в материнском UBE3A, инъекции в гиппокамп AAV9, доставляющего ген UBE3A, были использованы в качестве генотерапии AS мышей, при этом было установлено заметное улучшение ассоциативного обучения (Daily et al., 2011). Однако, избыточная экспрессия UBE3A строго связана с нарушениями спектра аутизма (Vatsa & Jana, 2018), это делает избыточную экспрессию потенциально вредной у людей. Отцовский ген UBE3A обычно замалчивается с помощью UBE3A анти-смыслового транскрипта UBE3A-ATS (Meng, Person, & Beaudet, 2012), это делает материнскую копию единственным функционально активным аллелем. Поэтому, Meng et al. применили альтернативный подход для реактивации экспрессии отцовского Ube3a аллеля у AS мышей с помощью анти-смыслового олигонуклеотида (ASO), чтобы заставить молчать мышный Ube3a-ATS, это позволило лучше контролировать экспрессию Ube3a (Meng et al., 2015). Также этого оказалось достаточно, чтобы восстановить контекстуальное обучение страху, оно не повлияло на поведенческие и моторные фенотипические отклонения.
Реактивация гена Ube3a у AS мышей на разных ст. развития подчеркивает наличие критического окна для вмешательства во многие аспекты болезненных отклонений, это может объяснить ограниченный успех упомянутой выше генотерапии у взрослых мышей. Восстановление Ube3a перестает способствовать развитию моторики между 3 и 6 неделями после родов, и только восстановление у эмбриона влияет на тревожность и поведение, связанное с аутизмом. (Silva-Santos et al., 2015). Кроме того, эпилептические фенотипы могут быть откорректированы на ст. P21, но не взрослых (Gu et al., 2019). Это указывает на то, что генотерапия AS, корректирующая все болезненные проявления находится на ранней ст. развития. 2.4.4 Tuberous sclerosis Hamartin дополняющая терапия была исследована в качестве потенциального лечения TSC. Для Tsc1-floxed и стохастических Tsc1-floxed мышиных моделей, ICV инъекции AAVrh8 вектора, доставляющего человеческий ген TSC1 на ст. P0 оказались достаточными для устранения биомаркеров патологии головного мозга, и удлинения продолжительности жизни и улучшения rotarod активности (Prabhakar et al., 2015, 2019). Удивительно, IV инъекции вектора P21 также оказалось достаточным для увеличения жизнеспособности TSC мышей, указывая тем самым, что, по крайней мере, определенные аспекты болезни могут лечиться с помощью вмешательств в поздний период жизни (Prabhakar et al., 2019). Однако, эффекты терапии с добавлением гена на обучение и память не были исследованы. 3 GENE THERAPY FOR MUTATIONS AFFECTING ION CHANNELS В некоторых случаях, например, в калиевых каналах, пораженные гены могут доставляться напрямую; однако для более крупных генов, таких как натриевые каналы, добавление вирусов (которые ограничены полезной нагрузкой) невозможно. Кроме того, крупные пропорции мутаций, затрагивающие ионные каналы приводят к токсическим GoF эффектам, при этом не происходит добавления. Следовательно, исследования генной терапии этих заболеваний не часто обусловлены простой заменой мутантного гена. 3.1 Dravet syndrome Принимая во внимание, что большинство случаев DS вызывается LoF мутациями в SCN1A, большинство поыток генотерапии было сфокусировано на повышении активности Nav1.1. Однако, это трудный сценарий по ряду причин. Во-первых, по тому, что DS, по-видимому, вызывается дисбалансом возбуждения и подавления, связанным с потерей экспрессии SCN1A, которое преимущественно затрагивает промежуточные нейроны (Yu et al., 2006), важно смещать увеличение функции Nav1.1 в сторону этой популяции клеток, чтобы восстановить баланс. Кроме того, размер гена SCN1A (6 kb) превосходит возможности его упаковки в AAV векторы (~4.5kb).
Первый предложенный терапевтический подход базировался на соединениях, базирующихся на олигонуклеотидах (AntagoNATs), нацеленных на анти-смысловую не-кодирующую РНК, которая контролирует экспрессию Scn1a (Hsiao et al., 2016). Этот подход оказался способным усиливать активность Scn1a in vitro и in vivo у мышей, моделирующих синдром Dravet, также ка и у не человекообразных приматов. В настоящий момент основным препятствием этому подходу может быть период полу-жизни AntagoNATs, требующий еженедельных intrathecal инъекций для достижения устойчивого уровня активности Scn1a.
Др. попытка преодолеть эти барьеры связана с доставкой с помощью AAV гена Nav?1 auxiliary субъединицы под контролем происходящего из Gad-1 промотора, что осуществлялось посредством ICV инъекций Scn1a+/- мышам (Niibori, Lee, Minassian, & Hampson, 2020). Т.к. это приводит к частичному устранению болезненных проявлений, которые обнаруживали половые отличия, использованный промотор обладал лишь умеренной избирательностью к GABAergic нейронам, что препятствовало его эффективности. Более того, Nav?1 взаимодействует многими др. натриевыми каналами и поэтому не может быть осуществлена избирательная терапия. Поскольку это исследование подтвердило принцип лечения, но подход недостаточно эффективен или специфичен для переноса в клинику.
Др. подход был более специфически нацелен на коррекцию лежащей в основе клеточной патологии, он разработан с использованием CRISPRa , чтобы повысить эндогенную экспрессию Scn1a (Colasante, Lignani, et al., 2020; Yamagata et al., 2020). Используя для промежуточных нейронов переднего мозга избирательный mDlx5/6 энхансер для управления экспрессией dCas9 и доставкой необходимых компонентов посредством двух AAV9 векторов новорожденным мышам, это исследование продемонстрировало значительное снижение фебрильных судорог у Scn1a+/- мышей по сравнению с WT контролем, когда как восстановление экспрессии Scn1a достигало нормальных уровней (Colasante, Lignani, et al., 2020; Yamagata et al., 2020). Однако, судороги не были подавлены полностью, возможно из-за избирательной экспрессии mDLX промотора или ограниченной совместной экспрессии двух AAVs в промежуточных нейронах. Судороги также не были полностью устранены при использовании трансгенных Dravet мышей, экспрессирующих dCAS9-VPR в VGAT-позитивных подавляющих нейронах, что, по-видимому, обусловлено поздним вмешательством (4-недельные животные) и/или низкой эффективностью трансдукции (Colasante, Lignani, et al., 2020; Yamagata et al., 2020). Важно, что эти воздействия должны базироваться на долго-временной экспрессии экзогенных Cas9 белков в нейронах, что повышает риск иммуногенности и/или эффектов вне мишени. 3.2 SCN8A and SCN2A encephalopathy SCN8A энцефалопатии вызываются de novo GoF мутациями в Nav1.6, приводящими к гиперактивности нейронов. Недавнее исследование показало, что снижение уровней транскриптов Scn8a анти-смысловыми олигонуклеотидами (ASO) является потенциальной стратегией трансляционной терапии. Снижение Scn8a на 25% - 50% приводит к задержке начала судорог и увеличению продолжительности жизни не только у мышиных моделей SCN8A энцефалопатии, но и также при Dravet Syndrome (Lenk et al., 2020). Хотя на данный момент отсутствует генотерапия для LoF SCN8A и SCN2A мутаций, или GoF SCN2A мутаций, разработка новых стратегий начата. CRISPRa для усиления активности пониженной экспрессии канала или ASO для снижения их патологического увеличения являются одними из возможных вариантов лечения этих патологий . 3.3 Targeting mutations affecting synaptic proteins Во многих случаях стратегии целенаправленного воздействия на синаптические белки сходны с теми, что применяются к ионным каналам. В частности, подход, базирующийся CRISPRa, может быть применен к любой NDD + E болезни, вызываемой генами, слишком большими, чтобы быть упакованными в AAV, такие как SYNGAP1, где повторная экспрессия белка в модели мышей с гаплонедостаточностью способна ослабить поведенческие фенотипы (Creson et al., 2019), или при STXBP1 (Stamberger, Weckhuysen, & De Jonghe, 2017). Сроки, специфичность типа клеток и доминантно-отрицательные мутации - новые проблемы. 3.4 DNM1 epileptic encephalopathy Для Dnm1 судорожных мышей, у которых патология вызывается доминантно-негативным эффектом мутантного аллеля, нокдаун Dnm1 базирующийся на доставке microRNA с помощью единственного билатерального ICV введения scAAV9во время раннего пост-натального развития, достаточен, чтобы редуцировать пагубные фенотипические отклонения и клеточные свойства (Aimiuwu et al., 2020). Хотя нокдаун оказался эффективным у гомозиготных Dnm1 мышей с судорогами, доминантно-негативные мутации у людей обычно гетерозиготные. Поэтому идеальным подходом будет избирательная инактивация мутантного аллеля без воздействия на здоровый аллель и риска усиления патологии. 3.5 CDKL5 deficiency disorder AAV доставка человеческого CDKL5, как было установлено, улучшает поведенческий фенотип у CDKL5 нокаутных мышей и восстанавливает синаптические отклонения в нейронах, происходящих из iPSCs от CDKL5-дефицитных пациентов (Gao et al., 2020). Каждая изоформа CDKL5 восстанавливает разные параметры в нейронах, происходящих от пациентов, подчеркивая ограниченность добавления экзогенного гена, где утерян эндогенный сплайсинг. Это подтверждает, что базирующийся на CRISPRa подход может обеспечить улучшение эффективности, как только продуцируемые CDKL5 транскрипты будут преобразованы в соответствии с эндогенным клеточным аппаратом (machinery). Хотя эта статья имеет несколько ограничений (например, отсутствие контрольных линий Хотя эта статья имеет несколько ограничений (например, отсутствие контрольных линий iPSC, полное повторение фенотипа человека и слабое влияние лечения на некоторые параметры), исследование является первым доказательством концепции, которая может помочь в разработке новых методов лечения и терапевтических стратегий для CDKL5 , полное повторение фенотипа человека и слабое влияние лечения на некоторые параметры), исследование является первым доказательством концепции, которая может помочь в разработке новых методов лечения и терапевтических стратегий для CDKL5 . 4 New avenues for gene therapy and delivery 4.1 Improving AAV vectors AAV система доставки имеет некоторые ограничения. Основным среди них является лимит упаковки (<4.7Kb), это исключает доставку многих NDD + E генов, таких как каналы. Используя CRISPRa и CRISPRi для усиления эндогенной экспрессии может позволить использование обхода лимита по упаковке для крупных генов, но в случаях, когда гены транскрипционно молчащие или мутации вызывают возникновение доминантно-негативного эффекта, то это может быть неэффективным (Haenfler et al., 2018). Генотерапия NDD + E также нуждается в доставке в ЦНС и, скорее всего, также нуждается в применении лечения во время раннего развития для всех аспектов болезненных проявлений прежде чем завершится формирование circuit. Однако даже AAV9, один из наиболее проницающей BBB капсид, проникает через BBB лишь в умеренной степени у перинатальных и неонатальных грызунов и не человекообразных приматов и людей (Mattar et al., 2013; Rahim et al., 2011). Стереотактические инъекции способны обходить BBB, но являются инвазивными и достигают только локальных регионов головного мозга. В случае NDD + E это часто очень важно для трансдукции, т.к. многие клетки ЦНС способны к восстановлению формирования нормальных circuit, делая распространенную системную трансдукцию ЦНС крайне желательной. Иммунная реакция на AAV векторы является ещё одним препятствием, как на уровне иммунного ответа, так и предсуществующих антител у хозяина к AAV (Rabinowitz, Chan, & Samulski, 2019). Когда перенос AAV генотерапии на людей станет широко распространенным, то произойдет столкновение с проблемами эффективности, обусловленными этими вопросами, исхоодя из необходимости улучшения векторов доставки. Преобразование AAV векторов, которые избирательно будут улучшать эти свойства, возможно c помощью подхода по созданию векторов с наибольшей пригодностью для клиники (Li & Samulski, 2020). Два главных подхода к преобразованию были использованы с обещающими результатами. Подходы по рациональному преобразованию касаются структуры и функции, путем перепрофилирования и изменения мотивов способом, который генерирует желательные свойства (Lee, Guenther, & Suh, 2018). Целенаправленная эволюция, с др. стороны, использует давление на селективный скрининг кандидатов модификаций, которые обладают желаемыми характеристиками (Bartel, Weinstein, & Schaffer, 2012).
Рациональное преобразование было использовано для создания AAV векторов с улучшенными свойствами, базируясь на информации о том, как AAV капсиды взаимодействуют с соотв. рецепторами. Напр., AAV9.HR является AAV9 вариантом, содержащим две модифицированные аминокислоты, которые обеспечивают прохождение через BBB и нейральный тропизм, но трансдуцируют периферические ткани в меньшей степени (Wang et al., 2018). Такого типа тропизм может оказаться идеальным для генотерапии NDD + E , вызываемых генами, которые экспрессируются также и периферическими тканями, такими как FMR1. Рациональное преобразование используется также для повышения эффективности трансдукции путем мутирования AAV9 капсид, чтобы уклониться от протеосомной деградации (Petrs-Silva et al., 2009). В конечном итоге, рациональные преобразования могут стать мощным инструментом для получения хорошо известных взаимодействий между капсидами и рецепторами. Кристаллические структуры наиболее широко используемых AAV серотипов позволяют облегчить поиски капсид AAV и разработку химерных AAV серотипов.
Направленная эволюция может преодолеть ограничения, накладываемые рациональным преобразованием, путем создание векторов доставки, которые прекрасно выполняют свои специфические роли в отсутствие точного понимания лежащих в основе механизмов (Packer & Liu, 2015). Направленная эволюция может быть использована для отбора вариантов со свойствами, которые необходимы для целенаправленного воздействия на NDD + E, но контролируемые c помощью плохо изученных механизмов, такие как проникновение через BBB. В самом деле, используя приготовленную на заказ базирующуюся на Cre эволюционной системе, наз. CREATE, вариант AAV9 , наз. AAV-PHP.B был разработан с чрезвычайно высокой проходимостью через BBB и трансдукцимонной эффективностью (Deverman et al., 2016). Дальнейшая эволюция AAV-PHP.B привела к появлению AAV-PHP.eB, который повышает трансдукцию ЦНС, и к AAV-PHP.S, который эффективно трансдуцирует периферическую нервную систему PNS) оне пересекает BBB (Chan et al., 2017). AAV-PHP.eB был использован для улучшения проявлений болезни у RTT мышей за счет эффективной трансдукции ЦНС c помощью одной не инвазивной инъекции (Luoni et al., 2020), подтверждая концептуальную пригодность AAV-PHP векторов при генотерапии NDD + E . Однако эти векторы, примененные к C57BL/6J мышам, обнаруживали ограниченный тропизм к ЦНС у др. видов и линий мышей, это ограничивает их использование (Hordeaux et al., 2018). Это подчеркивает ключевое ограничение направленной эволюции; доставка векторов снова выступает против давления специфического отбора и может терять свои достижения, будучи применена в др. биологическом контексте. Но открытие, что рецептор LY6A , является важным для AAV-PHP трансдукции, поспособствовать продукции вариантов, эффективных у людей (Huang et al., 2019).
Недавно система CREATE была усовершенствована в мультиплексную систему, наз. M-CREATE, чтобы сделать возможной идентификацию вариантов посредством многих давлений отбора (Ravindra Kumar et al., 2020). M-CREATE была использована для идентификации AAV вариантов, которые могут пересекать BBB у многих линий мышей и обладают тропизмом к нейронам, астроцитам или сосудистым клеткам, делая возможными беспрецедентные системные или клеточно-специфичные трансдукции ЦНС. В частности, AAV-PHP.N является вариантом с высокой специфичностью к нейронам и с пониженной трансдукцией, это может позволить высоко специализированную доставку при NDD + E. Капсиды, идентифицируемые с помощью M-CREATE пока tot не были тестированы помимо мышей, но но система может оказаться ценной для понимания, насколько хорошо эти свойства законсервированы у разных видов. Понимание лежащих в основе механизмов пересечения BBB у таких разных вариантов может позволить создать векторы со сходными важными свойствами и у людей, т.к. данные, получаемые в будущем в экспериментах с M-CREATE , могут быть использованы, чтобы получать in silico AAV варианты. Возможно, M-CREATE может быть также использована для изучения AAV вариантов, которые смогут эффектинов пересекать плаценту для неинвазивной перинатальной доставки при NDD + E, хотя осуществление генетических вмешательств во время таких критических стадий развития очень рисковано. 4.2 Building on the CRISPR toolbox Система CRISPR/Cas геномного редактирования была адаптирована для широкого круга новых методов по созданию новых инструментов с повышенной пригодностью и эффективностью (Doudna, 2020). Гибкость этой системы вместе с использованием ряда естественных и синтетических Cas вариантов по сравнению WT SpCas9, таких как XCas9 и SpRY с нетрадиционным распознаванием PAM (Hu et al., 2018; Walton, Christie, Whittaker, & Kleinstiver, 2020), или более мелких SaCas9, которые лучше упаковываются в векторы многообещающие (Friedland et al., 2015). Пока осуществимость некоторых из этих систем сильно зависит от их будущей оптимизации, также как и иммуногенности и эффектов вне мишени. Системы с само-ограничивающей экспрессией предполагаются в качестве потенциального способа снижения этих эффектов (Chen et al., 2016; Li et al., 2019). Здесь некоторые из таких систем с наибольшим потенциалом для генотерапии NDD + E суммированы. 4.2.1 CRISPRa and CRISPRi CRISPRa/i являются многообещающими альтернативами по отношениюю к добавлению генов. dCas9 , слитые с активатором транскрипции или репрессором способны регулировать экспрессию эндогенных генов и поддерживать нормальный биогенез с более незначительным влиянием, как при более низком титре. Это может приводить к очень высокой эффективности и безопасности воздействия гаплонедостаочности или GoF при NDD + Es. Размер этих dCas9 комплексов остается проблемой, требующей использования двух AAV векторов для совместной доставки sgRNA и значит снижения эффективности (Colasante, Lignani, et al., 2020; Colasante, Qiu, et al., 2020). Разработка систем CRISPRa/i базируется на более мелких, ортологах dCas9s, которые продуцируются Staphylococcus aureus dCas9 (SadCas9), которые могли устранять эти проблемы (Gao et al., 2016). Негативные эффекты долговременной экспрессии dCas9 также существуют и нуждаются в дальнейшем исследовании до переноса в клинику. 4.2.2 Base editing CRISPR редактирование оснований это инструменты редактирования, базирующиеся на поврежденных Cas белках, слитых с deaminases, которые способны эффективно конвертировать C-G в T-A и A-T в G-C с исключительной точностью, открывая возможность для реальной коррекции патологии на уровне генома (Gaudelli et al., 2017; Komor, Kim, Packer, Zuris, & Liu, 2016). Оба класса редакторов оснований генерируют минимальные indels, поскольку они не разрезают ДНК, а только генерируют зарубки (nicks) одиночной нити, что делает их идеальными для коррекции точковых мутаций в генах, участвующих в развитии, или моделирующих эти мутации в клетках людей. Размер генов редакторов оснований (6 kb) также позволяет их использование in vivo, поскольку они превышают возможности AAV. Недавно, двойные AAVs были использованы для доставки редакторов оснований в виде половинок. которые восстанавливались с помощью trans-splicing inteins (Levy et al., 2020). Split intein редакторами оснований обнаруживало высокую эффективность редактирования в головном мозге при системной доставке посредством IV инъекций AAV-PHP.eB векторов и оказалось способным ослаблять нейродегенерацию у мышиных моделей нейродегенеративной атаксии (Levy et al., 2020). Использование редакторов оснований ограничено узким временным промежутком для оснований, которые они могут редактировать относительно последовательности PAM. Вновь разработанные редакторы оснований, которые распознают широкий круг non-G PAMs открывает большую часть генома для редактирования оснований в теории, потенциально увеличивая эффекты вне мишени из-за увеличения количества PAM сайтов (Miller et al., 2020; Walton et al., 2020). Фактически новые инструменты настоятельно нуждаются в изучении эффектов вне мишени редакторов оснований (Tang, 2020). В конце концов, прежде чем они поступят в клинику, необходимо существенное снижение риска и цены этих подходов путем разработки новых конструкций по доставке одним AAV вектором. 4.2.3 Targeted integration Целенаправленная интеграция в геном in vivo представляет собой захватывающий способ лечения NDD + E с помощью коррекции мутаций, т.к. это обходит затруднения, ассоциированные с мозаицизмом или доминантныим негативными эффектами. CRISPR-генерируемые разрезы были использованы для индукции редактирования генома посредством репарации DSB. Два механизма репарации: аккуратный, но менее эффективный homology-directed repair (HDR) и склонный к indel non-homologous end joining (NHEJ). Оба пути могут быть использованы для инкорпорации ДНК матрицы, при этом HDR фактически требует одного, чтобы участок был фланкирован гомологичными регионами. Пока HDR используется наиболее часто из-за своей аккуратности, но он менее эффективен в пост-митотических клетках, таких как нейроны. HDR подход in vivo показывает, что эта система может быть использована для модификации ДНК нейронов, но с невысокой эффективностью (Nishiyama, Mikuni, & Yasuda, 2017). Чтобы сделать возможной интеграцию в геном нейронов, была разработана базирующаяся на NHEJ техника homology-independent targeted integration (HITI) (Suzuki et al., 2016). HITI является более эффективной в нейронах, чем HDR, и способна улучшать зрительную функцию путем коррекции мутаций у модельных крыс с дегнерацией сетчатки, но HITI всё ещё обладает лишь умеренной эффективностью (Gao et al., 2019; Suzuki & Izpisua Belmonte, 2018; Suzuki et al., 2019). Поскольку HITI может быть использована для коррекции крупных делеций, лежащих в основе NDD + E, то существующая на сегодня высокая доля вставки indel в место интеграции, которые могут нарушать естественный биогенез гена мишени. Аккуратность и эффективность HITI д. быть улучшены прежде, чем этот подход будет использован на людях. Др. техника, использующая сходную NHEJ интеграцию, это homology-independent universal genome engineering (HiUGE; Gao et al., 2019). По эффективности in vivo и in vitro она сходна с HITI, HiUGE использует модульные sgRNA и донорские кассеты, которые делают её идеальной для высоко-производительного скрининга меченных белков для анализа их функции и локализации. HiUGE может быть идеальным для скринига нижестоящих мишеней в виде NDD + E мутантных факторов транскрипции, таких как UBE3A или FMR1, , чтобы идентифицировать новые терапевтические мишени.
Замещение геномного локуса, содержащего патогенную мутацию, экзогенной здоровой копией в раннем развитии представляет собой теоретически золотой стандарт для терапевтического редактирования генома при NDD + E. Prime editing - это недавно разработанная методология, которая действительно может осуществить такого рода замещение локуса (Anzalone et al., 2019), используя поврежденный Cas9, слитый с обратной транскриптазой и запрограммированную с помощью prime editing gRNA (pegRNA), которая специфицирует мишень и матрицу для редактирования. Prime editing, как было установлено, является эффективным и точным в клетках человека in vitro и способно корректировать две генетические болезни (Anzalone et al., 2019). Prime editing также обнаруживает значительную гибкость по сравнению с редактированием оснований, т.к. оно менее ограничено близостью к PAM и может осуществляться в значительном круге более сложных редактирований. Пока эффективность prime editing варьирует существенно в зависимости от pegRNA, геномного локуса и типа клеток, при этом эффективность редактирования двух локусов в первичных нейронах была низкой (4%и 6%). Многие исследования пытаются выяснить клеточные детерминанты эффективности prime editing, чтобы адаптировать эту систему к большей эффективности в нейронах, прежде чем она будет применена к NDD + E, хотя оно всё ещё несет захватывающий потенциал для многих NDD + E болезней. Напр., prime editing может теоретически быть использовано для замещения чрезвычайно увеличенных CGG повторов в FMR1, чтобы лечить Fragile X синдром или переписывать крупные участки SCN1A для лечения множественных причин DS. Основным затруднением использования prime editing in vivo является размер prime редакторов и pegRNA (примерно 7 kb), который превосходит пределы упаковки AAV. Возможно, что подход split intein сможет это преодолеть, как и в случает редактирования оснований, но prime editing всё ещё очень молодая технология, нуждающаяся в оптимизации. 4.2.4 Editing the epigenome and RNA Cas белки были также слиты с разными эпигеномными эффекторами, такими как DNA methylases (dCa9-Dnmt3a) или demethylases (Tet1-dCas9) (Liu et al., 2018), чтобы сделать возможным эпигеномное редактирование. Эпигеномное редактирование может стать мощным инструментом для моногенных NDD + E нарушений, при которых участвует эпигеном, таких как FXS, без внесения геномных воздействий вне мишени. В самом деле, используя dCas9, слитую с Tet1 demethylase, Liu et al. оказались способны обратить гиперметилирование CGG повторов вFXS iPS клетках и реактивировать экспрессию FMRP (Liu et al., 2018), избегая риска ассоциации с редактированием генома. Такое восстановление экспрессии оказалось достаточным для восстановления электрофизиологических дефицитов, подавая надежду, что эпигеномное редактирование in vivo сможет обеспечить улучшение болезненных проявлений.
Семейство Cas13 является уникальным среди Cas белков, пригодных для целенаправленного воздействия и расщепления РНК вместо ДНК, это делает возможным использование CRISPR системы для редактирования РНК (Shmakov et al., 2015). Современное использование Cas13 включает стандартное расщепление, а также более точное редактирование оснований из C в U (Abudayyeh et al., 2019) или A в I (Cox et al., 2017). RNA редактирование открывает потенциальные преимущества по сравнению с редактированием ДНК для коррекции correcting NDD + E патологии, при этом обратимость редактирования РНК особенно привлекательна. В частности, редактирование оснований РНК может оказаться многообещающим для RTT, где коллекция мутаций пациентов с RTT у мышей способна с помощью ADAR2-based химерной 'editase' восстанавливать транскрипты Mecp2 и функцию белка MeCP2 (Sinnamon et al., 2020). Эта работа сконцентрирована на молекулярных изменениях и не сообщает об эффекте терапии на фенотипические проявления RTT. Дополнительным беспокойством является высокий уровень редактирования вне мишени, что связано с экспрессией инструмента редактирования. 4.2.5 Inactivating CRISPR Хотя CRISPR/Cas является чрезвычайно точным инструментом редактирования генома, ож имеются затруднения, связанные с потенциальными вредными эффектами редактирования вне мишени (Merkle et al., 2015; Zhang, Tee, Wang, Huang, & Yang, 2015), в частности, из-за долговременной экспрессии белка Cas, что связано с повышением редактирования вне мишени (Merkle et al., 2015). Разные CRISPR ингибиторы, наз. anti-CRISPRs были предложены в качестве 'off-switch', чтобы ограничить эти эффекты вне мишени, хотя на сегодня они разработаны недостаточно, чтобы использоваться для контроля редактирования генома (Marino, Pinilla-Redondo, Csorgo, & Bondy-Denomy, 2020), в конечном счете перенос в клинику базирующихся на CRISPR инструментов, может потребовать некоторых рассуждений, как они могут быть инактивированы или экспрессироваться временно. 5 The next steps for developing gene therapy for NDD + E Innovative therapeutic approaches have recently been developed that aim to tackle NDD + E pathologies, alongside some that are still ongoing. The constant improvement in gene therapy tools over recent years is one of the most important reasons for this. The gene editing revolution with the discovery of CRISPR as well as the enhanced reliability and efficacy of ASOs and gene delivery have opened new ways for designing treatments. Furthermore, the increased understanding of the genetic causes of NDD + E and the possibility to build diverse models more efficiently has significantly improved the development of rational approaches.
Now, we still need to better understand how NDD + E progress during development and what the best therapeutic window is for each individual disease. Rather than having a specific gene therapy tool for each single mutation or gene, we would ideally need universal tools that can cover multiple patients, and most importantly the tool should be decided based on when the intervention is feasible (Figure 2). The use of gene editing to correct a mutation at later stages of NDD + E may not result in a complete rescue of the pathology due to developmental changes that have already occurred, and it is probably preferable to intervene at or before the onset of symptoms. An early identification of the genetic causes, while not always feasible, could be a game changer for these gene therapy approaches.  Figure 2 Potential gene therapy approaches for NDD + E. The onset of the disease is drawn in the early childhood but can vary among the different NDD + E |