Увеличение количества происходящих из human pluripotent stem cell (hPSC) клеток, трансплантируемых пациентам, напр., известно более 30 проводимых или завершенных клинических испытаний по многим показаниям, включая и повреждения спинного мозга, макулярную дегенерацию и типа 1 диабет¹. Широта этих клинических испытаний подчеркивает возможности базирующейся на hPSC клеточной терапии. Однако, базирующаяся на hPSC терапия обнаруживает уникальную угрозу безопасности по сравнению с терапией клетками, происходящими от взрослых^2,3. Чтобы использовать потенциал базирующейся на hPSC терапии, необходимы стратегии смягчающие эти уникальные риски. Такие риски распадаются на две категории (Fig. 1a).

Fig. 1: Genetically engineered safeguards for human pluripotent stem cell-based therapies. figure1 a Safety risks of human pluripotent stem cell (hPSC)-based cell therapies. b Summary of the safeguards described in this study. iCaspase9 inducible Caspase9, OiCaspase9 orthogonal inducible Caspase9, TKHSV herpes simplex virus-derived thymidine kinase, FKBPF36V FKBP12 with F36V point mutation, mFRB mutant FRB domain. c Applications of the safeguards described in this study. d Small molecules used to activate respective safeguards.

Во-первых, дифференцировка hPSC часто приводит к возникновению гетерогенной популяции клеток^4,5, и даже к присутствию небольшого количества недифференцированных hPSCs (10000 или даже меньше), которые могут формировать in vivo тератомы^6,7. Если биллионы произошедших из hPSC клеток трансплантированы пациенту, то даже 0.001% оставшихся клеток hPSCs может быть неприемлем для терапии, т.к. 5-log деплеция недифференцированных hPSCs может оказаться критической⁵. В самом деле, трансплантация определенного количества hPSC, произошедших из печени⁸ и поджелудочной железы^9-11 будут давать тератомы у животных моделей³, которые возможно точно также будут возникать у пациентов.

Во-вторых, дифференцированные типы клеток из неправильного клона могут после трансплантации, генерировать опухоли или нежелательные ткани. Напр., трансплантация PSC, происходящих из нейральных популяций, животным моделям будут генерировать опухоли^12-14 или кисты¹⁵ в определенных случаях. В самом деле, hPSCs были также описаны, как вызывающие определенные генетические аномалии в культуре (напр., TP53 мутации или BCL2L1 амплификации)^16-18, некоторые из которых индуцируют свое дифференцированное потомство, чтобы сформировать опухоль in vivo¹³. Эти проблемы техники безопасности могут быть в дальнейшем усилены, т.к. hPSCs преобразуются, чтобы стать гипоиммуногенными с тем, чтобы минимизировать их отторжение иммунной системой пациента^19,20. Очевидно, что если hPSC происходят из гипоиммунногенных клеток, то оказываются злокачественно трансформированы или инфицированы вирусами, тогда они контролируются неадекватно иммунной системой реципиента. В таких случаях индуцибельная система, чтобы элиминировать все трансплантированные происходящие из hPSC клетки д. стать ценным инструментом для снижения этих рисков.

Чтобы ослабить эти угрозы безопасности при клеточной терапии, базирующейся на hPSC, мы разработали ортогональные системы избирательного убийства недифференцированных hPSCs или эффективно элиминировать все клеточные продукты, если необходимо (Fig. 1b-d). Все три из этих генетически кодируемых систем надежности (NANOGiCaspase9, ACTBOiCaspase9, and ACTBTK) специфически вставляются в эндогенные гены и позволяют нам устранять популяции клеток, происходящие hPSC после использования малых молекул in vitro и in vivo.

Улучшение безопасности клеточной терапии, базирующейся на hPSC является важным приоритетом в порядке создания такой терапии, доступной для широкого круга пациентов с разными показаниями³, включая такие болезни (напр., не онкологические болезни) для которых современная терапия не идеальна, при которой минимизация риска от hPSC-происходящей терапии важна. На преклинических моделях, происходящие из hPSC популяции клеток формировали тератомы^8-11, и др. типы опухолей^12-14 или кисты¹⁵ с разными частотами. Другая угроза безопасности связана с тенденцией hPSCs приобретать определенные генетические мутации после культивирования^16-18; такие мутации, как было установлено, приводят к образованию опухолей за счет их дифференцированного потомства in vivo¹³. Менее известное, но всё ещё важное возможное применение защиты терапии от базирующейся на гипоиммуногенных hPSC клеточных продуктов^19,20. После трансплантации, если гипоиммуногенные клетки становились раковыми или инфицированными, они не могли адекватно контролироваться с помощью иммунной системы пациента. Здесь мы описали общую платформу улучшения потенциала безопасности терапии клетками, происходящими из hPSC, с целью смягчения двух угроз безопасности, которые связаны с этой во всем остальном многообещающей клеточной терапией.

Мы преобразовывали hPSCs с помощью двойной ортогональной защиты с разной действенностью, которая могла быть активирована в ответ на разные непредвиденные обстоятельства. The first safety switch первый предохранительный переключатель (NANOGiCasp9) представлял собой метод существенного снижения риска формирования тератом перед трансплантацией. В частности, он позволял истощение in vitro клеток, формирующих тератомы из клеточных продуктов, происходящих из терапевтических hPSC более чем в 106-раз, используя AP20 (малая молекула, вызывающая апоптоз) лекарство. Такая степень истощения должна была создавать надежный буфер для клеточных продуктов более чем из 1 миллиарда клеток или более, чтобы быть трансплантированными без потенциальной токсичности формирования тератом (принимая во внимание, что 10000 hESCs достаточно, чтобы сформировать тератому в мышиной модели⁶).

Напротив, вторая ортогональная защита переключения (или ACTBTK или ACTBOiCasp9) предоставляла два разных пути (воздействия GCV или AP21, соотв.), чтобы быстро элиминировать все клеточные продукты - не только плюрипотентные клетки - если необходимо. Система ACTBOiCasp9 более быстро элиминировала клетки in vivo и была менее иммуногенная , чем система, базирующаяся на вирусе ACTBTK⁴⁹. Её следовало выбирать для элиминации клеточных продуктов, если они приводили к вредным последствиям или из-за того, что их значение для терапии более не было необходимым.

Важно, что оба эти ортогональные аварийные переключатели интегрируются в одну и ту же линию hPSC ( ACTBTK-mPlum;NANOGiCasp9-YFP hPSC линия и ACTBTK-mPlum;NANOGiCasp9-YFP hPSC линия), это позволяет нам использовать разные малые молекулы, чтобы активировать определенные меры безопасности в ответ на разные непредвиденные обстоятельства. Лекарства, используемые для активирования наших аварийных переключателей (ganciclovir и AP20) мы благополучно использовали у пациентов^44,50, подтвердив возможность переноса в клинику нашей системы гарантии безопасности.

Любая базирующаяся на маркерах стратегия для устранения нежелательных клеток - таких как описанные здесь - эффективна настолько, насколько специфичен выбор маркерного гена. NANOG является очень специфическим маркером для плюрипотентных клеток in vivo^34-36, который, как было установлено, действует и in vitro. Тем не менее, NANOG всё ещё экспрессируется в редких дифференцированных клонах (напр., примордиальных зародышевых клетках⁵¹). NANOGiCasp9 охрана, следовательно, не может быть применена к таким клеточным продуктам, производным hPSC. Недавно была разработана SOX2iCasp9 система для элиминации плюрипотентных клеток²⁸. Однако, SOX2 является менее специфическим маркером для плюрипотентных клеток, т.к. он также экспрессируется в разных дифференцированных клонах, включая эктодермальные (напр., нейральные)⁵² и передней энтодермы (напр., печени)⁵³ предшественники (Fig. 2b). Система TERTTK также была разработана для элиминации нежелательных клонов, происходящих из hPSC²⁴, но эта система оказалась эффектиной только в специальных сценариях, когда нежелательными типами клеток были TERT+ , но желательными оставались терапевтические типы клеток TERT-. Разнообразные негенетические способы⁵ также существуют, чтобы устранять плюрипотентные клетки, включающие малые молекулы (нацеленные на SCD1 и SURVIVIN)^25-27, цитотоксические антитела (нацеленные на PODXL1)²², и культуральные среды^54,55, а также внеклеточный матрикс⁵⁶, которые преимущественно элиминируют плюрипотентные клетки. Однако, SCD1, SURVIVIN, и PODXL1 экспрессируются как в недифференцированных, так и дифференцирующихся hPSCs (Supplementary Fig. 1a), подчеркивая важность специфичности для систем устранения клеток.

Были получены двойные ортогональные геном-редактирующие линии hPSC, непригодные для клинического использования, поскольку они содержали чужеродные флуоресцентные белковые маркеры и были произведены без использования Good Manufacturing Practices. Однако, такая защита может быть преобразована в др. линии hPSC с важными для клиники маркерами (такими как укороченные версии NGFR, EGFR, CD19 или CD20), поскольку Cas9 RNP/AAV6 система, использованная для генетического преобразования этих линий, чрезвычайно эффективна и специфична в пределах линий hPSC³⁸. Более того, система редактирования генома RNP/AAV6 также является эффективной в hPSCs³⁸, при этом селективные маркеры могут быть даже не нужны для эффективной идентификации клонов, содержащих биаллельные интеграции обеих этих систем безопасности. Поскольку использование двойной защиты решает две важные проблемы безопасности для лечения клеток, производных hPSC, также можно было бы конструировать клетки путем редактирования генома, используя только одну из систем, поскольку они независимы друг от друга и используют разные генетические локусы для своей активности.

Наконец, наши системы защиты с точностью вызывают нокаут эндогенных локусов внутри hPSCs (by contrast to past efforts to randomly insert them using lentiviral transgenes45,46), тем самым снижают риск инсерционного мутагенеза или эктопического замалчивания этими системами безопасности. Избегание замалчивания трансгена д. повышать эффективность системы защиты, а избегание инсерционного мутагенеза д. предоставить дополнительную надежность генетического преобразования клеточных продуктов.

Итак, мы использовали геномное редактирование, чтобы преобразовать общую платформу, чтобы повысить безопасность будущей терапии путем трансплантации клеток, происходящих из hPSC. В частности, мы разработали линии hPSC, несущие две индуцибельные лекарствами меры защиты, которые обладают отличающимися функциями и нацелены на самостоятельные факторы опасности. Применение in vitro одной из малых молекул истощает недифференцированные hPSCs болле чем в 106 раз, предупреждая тем самым от образования тератом in vivo. Использование второй малой молекулы убивает все типы клеток. происходящие из hPSC, предоставляя тем самым возможность устранения всех клеток, производных hPSC in vivo, если возникают вредные события.