Из-за различий между человеком и животными необходимо экстраполировать соотв. возраста человека и возраста мышей при подготовке преклинических исследований на животных моделях (Workman et al., 2013). Изучение терапевтических подходов к внутреннему уху д. учитывать оптимальное время вмешательства при нарушениях, которые зависят от определенной патологии, дефицита, онтогенетических программ и генетической мишени. Наконец, важно учитывать потенциальную минимизацию инвазивных инъекций, прямой поставки в ухо при нарушениях слуха и баланса. Локальная доставка имеет дополнительные преимущества, ограничивая потенциал системной токсичности, увеличивая доставляемую дозу лекарства и эффективность, а также снижая цену.

Терапевтические стратегии, базирующиеся на молекулах нуклеиновых кислот, которые модифицируют или корректируют экспрессию генов успешно лечат потерю слуха и вестибулярной функции у модельных животных, демонстрируя, что такого типа лекарства могут быть эффективны и при лечении людей (Wang et al., 2018). Базирующиеся на нуклеиновых кислотах подходы представляют собой широкий класс потенциальных терапевтических молекул, которые используют нуклеиновые кислоты, чтобы достичь терапевтического результата, включая, напр., генотерапию с использованием переносе ДНК в клетки, обычно используя вирусные векторы, подходы по редактированию генов (e.g. CRISPR/Cas9-sgRNAs, TALENs и Zinc finger nucleases), mRNA/DNA вакцины, доставку мРНК и олигонуклеотиды (Coutinho et al., 2019; Crooke, 2017; Gao et al., 2018; Lieberman, 2018; Shahryari et al., 2019; Zhang et al., 2019).

Целенаправленная доставка биоактивных реагентов или непосредственно в собственно внутреннее ухо или косвенно через амниотическую полость, окружающую эмбрион, демонстрируя interventional аспекты стратегии. Эффективность генотерапии, нацеленной на отоцисты мыши, сравнима с терапевтическими контрпримерами (counter examples) с участием доставки в подростковое и взрослое ухо.

Акустический старт-рефлекс является объективным поведенческим измерением слуховой функции, которой обладают как юные мыши, так и плоды человека (Hepper and Shahidullah, 1994; Shnerson and Willott, 1980). Не существует др. поведенческих или физиологических измерений слуховой функции, систематически используемых у юных мышей и человеческих плодов. Сравнение начала акустического старт-рефлекса означает становление униформной референсной точки для интактной слуховой функции у обоих видов (Fig. 1).



Fig. 1. Temporal framework for therapeutic intervention in the mouse and human inner ears. A, The mouse inner ear at E11.5 is a fluid-filled vesicle lined by otic epithelial progenitor cells that contribute to the sensory and nonsensory structures of the inner ear. A subpopulation of otic progenitors gains neural competence and migrates out of the vesicle to establish the nascent cochleovestibular ganglion (green) that will innervate auditory and vestibular hair cells. Hearing in the mouse can be detected by acoustic startle responses at???P12. Therapeutic strategies aimed at the restoration of hearing and balance in mouse models of human hearing loss are most effective when performed from P0-P5 after which effectiveness rapidly declines or is eliminated entirely. P0-P5 is represented as the Postnatal Window of Efficacy. B, The human inner ear at 8 weeks gestational age (GA8) is morphologically similar to the E11.5 mouse otic vesicle. Hearing in humans may be detected by acoustic startle responses as early at GA19 during the second trimester of pregnancy. The postnatal window of efficacy in the mouse closes one week prior to hearing onset at P12. A proposed Prenatal Window of Efficacy in the human fetus may close as early as GA18, one week prior to hearing onset at GA19. Abbreviations: AC, anterior crista; ASC, anterior semicircular canal; CVB, cochleovestibular ganglion; ES, endolymphatic sac; LC, lateral cristae; LSC, lateral semicircular canal; PC, posterior crista; PSC, posterior semicircular canal; SM, saccular macula; UM, utricular macula. Inner ear schematics are not drawn to scale. (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the Web version of this article.)

Быстрый акустический старт-рефлекс (startle response) у млекопитающих характеризуется сгибанием конечностей и сокращением лицевых мышц, это сопровождается удлинением реакции конечностей в ответ на интенсивный звук короткой продолжительности (Davis, 1980; Wilson and Groves, 1972). Первичный circuit акустического старт-рефлекса использует передачу импульса от слухового нерва в cochlear root neurons (CRN), нейроны вторичного порядка, которые распределены среди нервных волокон улитки в вентральном cochlear ядре (Harrison et al., 1962; L?pez et al., 1993; Sinex et al., 2001). CRN проецируются в pontine reticular nucleus (PnC), который затем модулирует чувствительность двигательных нейронов (Lauer et al., 2017). Акустические импульсы могут также модулировать PnC непосредственно путем активации дорсального и вентрального (ventral cochlear nuclei (VCN)) и косвенно посредством активации с помощью VCN вентральной tegmental области, которая проецируется в PnC (Lauer et al., 2017). Реакция акустического старт-рефлекса фундаментально зависит от импульса от слухового нерва и является самой базовым показателем, предоставляющим информацию об исправности периферической слуховой функции и он ассоциирован с восходящими и нисходящими путями. Акустический старт-рефлекс у мышей впервые определяется на 12 день после рождения (P12) (Shnerson and Willott, 1980), указывая, что значительный период постнатального развития необходим перед появлением слуха (Fig. 1).

Поскольку новорожденные слышат при рождении, Heppner and Shahidullah изобрели образец акустического старт-рефлекса для определения начала слуха у плодов человека (Hepper and Shahidullah, 1994). Микрофон помещается на живот от 19 по 35 неделю беременности, чтобы передавать стимулы в виде чистых тонов от 100 tдо 3000 Hz. Ультра-сонографические доказательства в виде движений головы, верхней части тела или плеч плода в ответ на стимулы в виде чистых тонов служат доказательством старт-рефлекса. Приблизительно 50% плодов реагируют на тон в 500 Hz на 23 неделе беременности и на стимулы в 250 Hz и 100 Hz на 25 неделе беременности. Реакции на стимулы в 1000 Hz и 3000Hz обнаруживаются у 50% плодов на 30-31 неделях беременности. Удивительно, один из плодов реагировал на стимулы в 500 Hz stimuli at 19 неделе беременности (Hepper and Shahidullah, 1994). Более того, по мере развития плода, интенсивность стимулов, необходимых для генерации старт-рефлекса на все тестируемые частоты снижалась до 20-30 dB (Hepper and Shahidullah, 1994). В последующих исследованиях использовали habituation paradigm, Shahidullah and Hepper показали, что плоды в 35 недель беременности начинают различать между чистыми тонами в 100 и 250 Hz звуки речи [ba] и [bi], но этого не отмечается на 27 неделе беременности (Shahidullah and Hepper, 1994). Акустический старт-рефлекс у плода человека возникает самое раннее на 19 неделе беременности, указывая на начало восприятия звуков у людей во втором триместре беременности. Более того, в последнем третьем триметре плод способен к сложному преобразованию слуховых сигналов, связанному с распознаванием частот (Fig. 1B).

Akil с колл. продемонстрировали, что восстановление функции слуха у мышей, нокаутных по vesicular glutamate transporter 3 (Vglut3), оказывалось оптимальным, когда производили инъекии через мембрану окна улитки (round window membrane (RWM)) AAV2/1-Vglut3 в период P1-3 (Table 1) (Akil et al., 2012). Применение AAV-Vglut3 на ст. P10-12 с помощью инъекций в RWM или cochleostomy оказалось менее эффективным по восстановлению слуховых порогов, сложных потенциалов действия и акустического старт-рефлекса. Кроме того, сохранение улучшения слуха было не устойчивым по времени. Хирургическая доступность уха на ранних постнатальных стадиях в комбинации с пластичностью pre-hearing внутреннего уха, чтобы восстановиться от травмы, наносимой микроинъекцией, повлияли на методологические разработки. Сходным образом, AAV2/Anc80L65-harmonin b1, доставляемый с помощью RWM на ст. P0-P1, оптимально восстанавливал механо-электрическую трансдукцию, ABRs, distortion product otoacoustic emissions (DPOAE), и акустический старт-рефлекс у Ush1c мутантных мышей. Удивительно, RWM инъекции на ст. P10-12 не восстанавливали функцию слуха (Table 1) (Pan et al., 2017). Эти исследования показали, что AAV-обеспечиваемый перенос гена в pre-hearing улитку оказывается тем более благоприятным, чем ближе к или вначале появления слуха.



Table 1. Gene therapies and pharmacotherapies administered from postnatal day 0-5 optimally restore sensory function compared to later postnatal administration in mouse models of hearing loss and vestibular dysfunction.

Терапевтическая эффективность, достигаемая при раннем постнатальном вмешательстве у мышей, не является результатом исключительно способом вирусом обусловленного переноса гена. Lentz с колл. показали, что корректирующие сплайсинг ASO (ASO-29) , вводимые внутрибрюшинно Ush1c мутантным мышам одной дозой на ст. P5 восстанавливают ABRs и устраняют поведение кручения, тогда как воздействия на ст. P10 оказались менее эффективными для лечения дефицита слуха. Напротив, воздействие ASO вплоть до P13, но не до P16 устраняет поведение верчения. При дальнейшем совершенствовании этого способа воздействия, Ponnath с колл. сообщили, что лечение Usher мышей одной дозой на ст. P1, P5 или P7, или множественными дозами на ст. P1 и P3 или P1, P3, P5 и P7, приводили к восстановлению ABR и DPOAE, при этом оптимальное восстановление функции как внутренних (DPOAE) , так и наружных (ABR) волосковых клеток достигалось одной дозой на ст. P1 и лишь сравнительно небольшое улучшение обнаруживалось при использовании нескольких доз (Table 1) (Ponnath et al., 2018). Сходным образом, Vijayakumar с колл. количественно оценивали восстановление вестибулярной функции у Ush1c мутантов, которых лечили внутрибрюшинными введениями ASO-29 в виде одиночной или множественных доз (Table 1) (Vijayakumar et al., 2017). Vestibular sensory evoked potentials (VsEPs) восстанавливались оптимально с помощью одной дозы ASO-29 на ст. P1. В предыдущей работе было показано, что одиночная внутрибрюшинная инъекция ASO-29 мутантным Ush1c мышам на ст. P3-13 была достаточной для восстановления повреждения в открытом поле и коррекции фенотипа кружения (Lentz et al., 2013). Эти данные указывают на то, что поведенческие оценки баланса не являются информативными, такие как оценки функциональности VsEPs в вестибулярной системе.

Исследования замещений генов у Vglut3 нокаутных мышей и коррекции сплайсинга с помощью ASO у Ush1c мутантных мышей были проведены, чтобы продемонстрировать терапевтический потенциал этих подходов врожденной глухоты у людей и определить оптимальный постнатальный срок чувствительности к терапевтическим вмешательствам. Дополнительные исследования генотерапии у мышиных моделей DFNB7/11 (TMC1), DFNA36 (TMC1), DFNB66/67 (LHFPL5), USH1G (SANS), DFNB31 (WHRN), USH3 (CLRN1) и DFNB1 (GJB2) ограничили вмешательства определенными возрастными рамками P0-P5 и все они продемонстрировали изменчивые уровни функционального восстановления (Table 2). Итак, эти данные определили оптимальный постнатальный временной промежуток терапевтической эффективности P0-P5 у мышей, который соответствует одной неделе до начала возникновения слуха на P12 (Fig. 1A).

Table 2. Gene therapies and pharmacotherapies administered from postnatal day 0-5 in mouse models of hearing loss and vestibular dysfunction.

Постнатальный промежуток эффективности у мышей указывает на то, что вывод о временном промежутке терапевтической эффективности у людей также может соответствовать одной неделе до начала возникновения слуха на 18 неделе беременности (Fig. 1B). Очевидно, что у незрелых, не слышащих ранних новорожденных мышей внутреннее ухо на ст. P0-P5 не является моделью функционального созревания, слуха во внутреннем ухе новорожденных детей. Генотерапия и фармако-терапевтические исследования на мышах подтверждают, что максимальный терапевтический эффект у людей может быть достигнут вмешательством в незрелом внутреннем ухе второго триместра до начала появления слуха. Предупреждающая молекулярная коррекция вредных мутаций до начала болезненного фенотипа, как полагают, будет оптимально восстанавливать сенсорную функцию (Wang et al., 2018).

Экспериментальная эмбриология является палитрой молекулярной, генетической и микро-манипуляционной техники, используемой для изучения типов клеток, тканей или органов в развивающемся эмбрионе (Fraser and Harland, 2000; Schoenwolf, 2001). У амфибий, напр., трансплантации ткани от донора реципиенту помогли установить, что передача сигналов от дорсальной губы бластопора организует нервную ось (De Robertis, 2009; Sander and Faessler, 2001). Химеры курица-перепел предоставляют уникальные популяции трансплантированных клеток, чтобы однозначно отслеживать, какие существуют неприкрытые пути миграции нервного гребня и их соотв. клеточные судьбы (Le Douarin et al., 2004). У амфибий и птиц доступ к развивающемуся эмбриону относительно прост и он сохраняет внешнесредовое окружение, которое поддерживает эмбриональное развитие.

Экспериментальная эмбриология у плацентарных млекопитающих, однако, довольно затруднительна. Напр., чтобы определить эффективность плодной генотерапии или фармакотерапии у мышиных моделей болезней внутреннего уха человека, доставка генов или лекарств д. проводиться в подходящее время развития. Более того, измененные эмбрионы д. развиваться до рождения , а постнатальное развитие д. быть устойчивым от начала возникновения слуха и до оценки сохранения сенсорного восстановления. К сожалению, ранний морфогенез внутреннего уха млекопитающих создает заполненный жидкостью анатомический компартмент, выстланный клетками предшественниками отического эпителия, чувствительного к терапевтическим вмешательствам до созревания сенсорного эпителия (Fig. 1).

Внутреннее ухо высших позвоночных развивается из утолщенного участка головной эктодермы, наз. отической плакодой, которая инвагинирует в головную мезенхиму рядом с каудальной частью заднего мозга, формируя отический бокал (Sher, 1971). По ходу морфогенеза отический бокал превращается в пузырек, заполненный жидкостью или отоцист (Fig. 1A) (Brigande et al., 2000). Предшественники отического эпителия, выстилающие слуховой пузырек дают сенсорные и несенсорные структуры внутреннего уха, а также нейроны, которые иннервируют сенсорные волосковые клетки. На исходе ~9 дней у мышей, отоцист развивается в зрелый мембранозный лабиринт, состоящий из отдельных вестибулярных и слуховых сенсорных частей (Bok et al., 2007; Wu and Kelley, 2012). Гребни полукружных каналов и utricular и saccular пятна содействуют возникновению баланса и органа Корти из закрученной улитки, служащей для восприятия звуков (Fig. 1A).

Нетравматические манипуляции в внутренним ухом мышей in utero осуществляются с помощью микроинъекций через матку биоактивных реагентов (Fig. 2) (Wang et al., 2012). Мышиный эмбрион, подобно человеческому эмбриону, растет в жидкой среде, обеспечиваемой с помощью последовательного расположения внеэмбриональных мембран (Fig. 2A). Амнион непосредственно окружает эмбрион и формирует амниотическую полость (Dobreva et al., 2018; Pereira et al., 2011). Амниотическая жидкость содержит клетки, слущивающиеся с плода человека, которые можно достать с помощью амниоцентеза для диагностических целей, начиная с 15 недель беременности (Carlson and Vora, 2017). Желточный мешок у мышей покрывает амнион, формируя экзоцеломическую полость, проксимальнее к амниону и дистальнее к полости желточного мешка (Fig. 2A) (Palis, 2006). Одной из критических функций этих заполненных жидкостью полостей является гашение и аммортизация осцилляций эмбриона или плода для защиты от механических травм. Микроинъекции через матку осуществляются с помощью стеклянной микропипетки с наружным диаметром 18-25-µm через матку, висцеральный желточный мешок и амнион к месту воздействия (Fig. 2A and B). Небольшие уколы в амнион и висцеральных желточный мешок быстро закупориваются клетками, взвешенными в амнионе и экзоцнломической полости после вынимания микропипетки (Wang et al., 2012).



Fig. 2. Bioactive reagent delivery into the mouse otic vesicle and amniotic cavity. A, Schematic representation of transuterine microinjection into the otocyst at E12.5. The microinjection pipette is advanced through the uterus (red line), the visceral yolk sac (black line), and amnion (green line) and inserted the right otic vesicle. B, The E12.5 otocyst is filled with fast green tracer dye delivered with a pressure injection system. The tapered endolymphatic duct (ED) presents dorsally and the clam shell shape of the vestibule ventrally are morphological correlates of successful otic vesicle targeting. C, Schematic representation of transuterine microinjection into the amniotic cavity at E13.5. D, The amnion is pierced where it tents between the snout and right hind limb (RH). The fast green injectate (I) is visible as a plume beneath the snout in the lateral view during the injection. One minute after completing the injection, injectate has diffused throughout the amniotic cavity obscuring the face and abdomen of the embryo. The injection in B was performed with the uterus resected and that in D was performed in vitro with the embryo and extraembryonic membranes intact to facilitate imaging. Abbreviations: ac, amniotic cavity; ec, exocoelomic cavity; M, midbrain; P, embryonic component of the placenta; T, tail; ysc, yolk sac cavity. (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the Web version of this article.)

Отоцист является привлекательной мишенью для микроинъекций через матку, поскольку пузырек доступен, он находится непосредственно под поверхностью головы, а отические предшественники, купаются в реагенте, повышая вероятность устойчивой биоактивности в развивающемся внутреннем ухе. Успешность инъекции подтверждена с помощью следов краски в заостренном эндолимфатическом протоке и с помощью появления clam shell в преддверии (vestibule) (Fig. 2A and B). Сходным образом, амниотическая полость является жизненно важной мишенью для инъекций через матку, поскольку полость доступна в области между передними конечностями передним мозгом, где оболочка амниона оттопыривается мордой и передними лапами; успешность инъекции легко оценить с помощью секвестрации следов краски в проксимальной части эмбриона; и потенциально весь эмбрион подвергается действию биоактивного реагента при системном введении (Fig. 2C and D).

Понятно, что у только что рожденных мышат внутреннее ухо моделирует внутреннее ухо плода человека. Три первоначальных исследования твердо установили потенциальную возможность генотерапии плода для лечения врожденных потерь слуха.

Kim с колл. продемонстрировали, что AAV-обеспечиваемый перенос гена в отоцист мышей на ст. E12.5 может восстанавливать слух у мышей с врожденной глухотой из-за отсутствия methionine sulfoxide reductase B3 (MsrB3) (Table 3) (Kim et al., 2016). Виды реактивного кислорода окисляют methionine в sulfoxides, который затем исправляется с помощью активности methionine sulfoxide reductase A и B (Jiang and Moskovitz, 2018). MsrB3 активно экспрессируется в основании пучков стереоцилий в сенсорных волосковых клетках, а в случае мутаций энзима возникает выраженная врожденная глухота (Kwon et al., 2014). AAV2/1-обеспечиваемый перенос MsrB3 в отический пузырек на ст. E12.5 нокаутных по MsrB3 мышей восстанавливает экспрессию мРНК MsrB3 и 15% экспрессии белка MsrB3 во внутреннем ухе (Kim et al., 2016). ABR пороги на ст. P28 во внутреннем ухе леченных мутантов восстанавливаются до уровня дикого типа к 4 и 8 kHz и пости до уровня дикого типа к 16 и 32 kHz. Удивительно, морфология пучков стереоцилий во внутренних и наружных волосковых клетках леченых мутантов оказывается сходной со структрой пучков волосков и паттерном дикого типа. Восстановленный слух сохранялся вплоть до почти 7 недель, тогда как повышенные пороги ABR обнаруживались к 4, 8 и 32 kHz. Дегенерация пучков стереоцилий коррелировала со снижением функции слуха. Эти данные впервые подтвердили, что отические предшественники, дающие слуховые волосковые клетки являются чувствительными мишенями для AAV-обеспечиваемой стратегии замещения генов, чтобы исправлять врожденную глухоту.



Table 3. Gene therapies and pharmacotherapy administered from embryonic day 11.5-13.5 in mouse models of hearing loss and vestibular dysfunction.

Miwa с колл. показали, что осуществляемый с помощью электропортации перенос генов на ст. E11.5 в отоцист мыши может восстанавливать слух у мышей с врожденной глухотой (Table 3) (Miwa et al., 2013). Щелевые соединения являются межклеточными каналами между соседними клетками, соприкасающихся оболочками, это позволяет переходить ионам, вторичным мессенджерам и метаболитам (Laird and Lampe, 2018). 6 мономеров connexin образуют 4 трансмембранных домена, каждый из которых представляет собой полу-канал в плазматической мембране (Nielsen et al., 2017). Полу-каналы соседних клеток соединяются, чтобы образовать зрелое щелевое соединение. Экспрессия connexin 30 во внутреннем ухе в точности соответствует экспрессии connexin 26 и благодаря этому также участвует в становлении и поддержании эл. потенциала внутри улитки (Xia et al., 2001). Мутации в connexin 30 ответственны за доминантные формы несиндромальной глухоты, а мутации в одной из копий connexin 30 и 26 лежат в основе двугенной, аутосомно рецессивной несиндромальной глухоты (del Castillo et al., 2005; del Castillo et al., 2002). С помощью электропортации осуществляемый перенос гена connexin 30 в отоцист на ст. E11.5 нокутных по connexin-30 мышам влсстанавливал потенциал внутри улитки и восстанавливал пороги ABR к 4, 12 и 20 kHz (Table 3) (Miwa et al., 2013).

Трудность получения достаточных количеств нокаутных по connexin 30 эмбрионов для более детального анализа привело к разработке альтернативной модельной системы, при которой плазмида, кодирующая 4 короткие шпилечные РНК (shRNA), целенаправленно воздействующая на дикого типа connexin 30, была электропортирована с помощью плазмиды, кодирующей кДНК shRNA, резистентной к connexin 30 (Miwa et al., 2013). Совместно трансфицированная эмбрионам дикого типа она обнаруживала улучшение на ст. P30 ABR порогов к 4, 12 и 20 kHz, а также восстановление потенциала внутри улитки по сравнению с животными, которым трансфицировали connexin 30 shRNA, которые обнаруживали ослабление ABR порогов и endochclear потенциалов, как у нокаутных по connexin 30 мышей. Анализ слуха осуществлялся на ст. P30. Кроме того, наружные волосковые клетки были сохранены только в совместно трансфицированных улитках в сравнении с трансфицированными только shRNA. Эти данные продемонстрировали, что ранние отические предшественники восприимчивы к переносу генов с помощью электропортации, что улучшает функцию слуха в течение первого мес. жизни.

Осуществимость доставки плодам терапии, базирующейся на нуклеиновых кислотах и её эффективность по коррекции утраченного слуха вызвала интерес к расширению репертуара терапевтических реагентов. Терапия, базирующаяся на нуклеиновых кислотах, использует нуклеиновые кислоты или близко родственные химические соединения. Deoxyribonucleic acids (ДНК) и рибонуклеиновые кислоты (РНК) стали предметом интенсивных исследований. Ряд результатов привел к созданию быстро растущего объема лекарств (Table 4). Терапия нуклеиновыми кислотами может быть сгруппирована на базе молекул ДНК и РНК и их активности. Основным типом нуклеиновых кислот для терапевтических и генотерапевтических подходов, это доставка мРНК/ДНК в качестве вакцин, доставка мРНК для трансляции и экспрессии белка и олигонуклеотиды (Coutinho et al., 2019; Crooke et al., 2018; Lieberman, 2018; Shahryari et al., 2019; Zhang et al., 2019).

.

Table 4. In vivo nucleic acid-based drugs approved for sale to treat human disease.

Обеспечиваемый вирусом перенос ДНК, кодирующей ген дикого типа. чтобы заместить функцию дефектного гена сегодня наиболее распространенная стратегия для лечения дефектов внутреннего уха у мышей (Wang et al., 2018). Adeno-associated viral векторы являются особенно ценными благодаря доступности вирусных серотипов, способных трансдуцировать слуховые и вестибулярные волосковые клетки; благодаря низкому профилю токсичности AAV; сохранению экспрессии трансгена; и потенциалу доставлять крупные кДНК (Isgrig et al., 2019; Tan et al., 2019; Wang et al., 2019). Кроме того, использование AAV в качестве эффективной in vivo терапевтической стратегии, подтолкнуло доступность двух разрешенных FDA лекарств для лечения спинальной мышечной атрофии (Zolgensma™) Leber's врожденного амавроза (Luxturna™) и более 50 клинических испытаний на людях с использованием AAV подходов для лечения болезней, таких как дефицит lipoprotein lipase, Leber's врожденного амавроза, пигментной дегенерации сетчатки и спинальной мышечной атрофии (Table 4) (Hudry and Vandenberghe, 2019; Naso et al., 2017; Rodrigues et al., 2018).

Др. базирующиеся на нуклеиновых кислотах подходы, которые обнадеживают, для лечения внутреннего уха, это подходы по редактированию генов, которые непосредственно изменяют последовательности ДНК. Имеется ряд подходов по редактированию, один из которых особенно обнадеживает благодаря его относительно высокой эффективности, связанной с использованием бактериальной эндонуклеазы Cas9. Cas9 распознает специфическую последовательность ДНК с помощью single guide RNAs (sgRNAs) и разрезает мишень ДНК, которая затем репарируется с помощью клеточного аппарата репарцации ДНК. CRISPR-Cas9 может быть модифицирована довольно просто с помощью инструмента геномного редактирования (Pickar-Oliver and Gersbach, 2019). Одним из недостатков стратегии редактирования генов является то, что она нуждается в доставке нуклеаз или нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазу вместе с гидом (guide) РНК в клетку. Однако,, Gao с колл. продемонстрировали, что Cas9 рибонуклеопротеиновый комплекс может быть непосредственно инъецирован во внутреннее ухо, проникнуть в клетки, отредактировать ДНК и откорректировать экспрессию гена и функцию слуха. Был подтвержден важный концептуальный принцип, что прямое редактирование мутантного гена может восстанавливать сенсорную функцию (Gao et al., 2018). Редактирование генов имеет др. узкое место, связанное с эффективностью и эффектами вне мишени. Однако, важным преимуществом в этой области стало сочетание модифицированного Cas9 энзима с обратной транскриптазой, что позволяет редактировать различные основания, чтобы сделать искусственную молекулу РНК, избавляясь тем самым от необходимости в ДНК матрице. Этот подход к редактированию обладает потенциалом повышенной точности, специфичности и многосторонности терапевтического редактирования генов (Anzalone et al., 2019). Существуют затруднения по адаптации к внутреннему уху эффективной доставки крупных комплексов редактирования или их кДНК в клетки мишени.

Олигонуклеотиды довольно большой подкласс молекул нуклеиновых кислот, которые были разработаны с целью терапии, некоторые из которых обнаруживают эффективность в лечении нарушений внутреннего уха и с др. многообещающим потенциалом. Терапия с помощью олигонуклеотидов обеспечивается разными способами действия



Fig. 3. Major types of oligonucleotide strategies being investigated and developed as therapeutics. The major types of oligonucleotides that are being pursued for the treatment of human conditions are shown. A. Antisense oligonucleotides (ASOs). ASOs can be subdivided into two major types. The first type is RNase H-dependent gapmers that have core DNA nucleotides that, upon base-pairing to complementary RNA render the RNA susceptible to cleavage by RNase H, an endoribonuclease the cleaves the phosphodiester bonds of RNA that is hybridized to DNA. In contrast, the second major type of ASO is the steric block ASOs that are designed to create a steric block to processing of mRNA by limiting access to RNA processing proteins and protein complexes or disrupting RNA secondary structure or RNA/RNA interactions, for example. Steric block ASOs are chemically modified RNA-like molecules that, when bound to target RNA, do not elicit degradation but instead, depending on where they hybridize, can modify mRNA transcription, splicing, polyadenylation, stability and translation, for example. Steric blocking ASOs can also hybridize to non-coding RNAs such as miRNAs (anti-miRs, antagomirs, AMO) to block miRNA activity. B. RNA interference. Oligonucleotides that induce RNA interference are designed to down-regulate target gene expression by recruiting the cellular RNA-induced silencing complex (RISC). Two general strategies include siRNAs that are completely complementary to a single target and specifically repress a single target and miRNAs (miRNA mimics) that have only partial complementary to target RNAs and thereby can suppress numerous targets. Delivery of RNAi-inducing nucleic acids to cells can involve delivery of siRNA directly or can be achieved by delivery of a viral-vector expressing a longer RNA sequence that forms a short-hairpin RNA (shRNA) that is a substrate for cleavage to create an siRNA molecule substrate for the RISC complex. C. Other types of oligonucleotide strategies. Aptamers are short oligonucleotides designed to form secondary structures that are recognized by proteins and modulate its activity by binding and inhibiting receptor binding or enzymatic activities. Oligonucleotides can also act as decoys and binding sites for proteins to sequester them and thereby limit activity by mimicking binding sites. Others, such as CpG oligonucleotides, are intended for stimulation of the immune system upon recruitment of protein such as TLR9. Catalytic nucleic acids such as DNAzymes and ribozymes are oligonucleotides that bind to target and perform a chemical reaction. These activities can be used to cleave or edit their targets and also have value as diagnostics and in biosensing.

Одним из олигонуклеотидных подходов является использование антисмысловых олигонуклеотидов (ASOs), которые являются однонитчатыми, модифицированными нуклеотидами, функцией которых является спаривание оснований с комплементарной последовательностью в РНК мишени. Спаривание оснований ASO может иметь разные последствия в зависимости от длины, структуры, химии и сайта мишени для ASO (Crooke, 2017). Существуют два общих класса ASOs (Fig. 3A). Стерически блокирующие ASOs представлены RNA-подобными нуклеотидами, которые были модифицированы, чтобы повысить стабильность, улучшить сродство и специфичность (Khvorova and Watts, 2017). Эти стерически блокирующие ASOs соединяются с РНК и предупреждают взаимодействия региона мишени с др. белками или РНК, и действуя подобным образом могут вмешиваться в ряд ступеней транскрипции, процессинга, стабильности или трансляции мРНК, напр., или путем спаривания оснований с miRNA, могут секвенировать её активность (обозначаются как AMO, antagomir or anti-miR). Стерически блокирующие ASOs, предупреждающие или модулирующие сплайсинг pre-mRNA обнаруживают особую успешность при лечении спинальной мышечной атрофии (De Vivo et al., 2019; Montes et al., 2019). Др. крупный класс ASOs это Ribonuclease H (RNase H)-зависимые ASOs. Такие ASOs, иногда обозначаются как gapmers, представлены центральными ДНК нуклеотидами, которые сопровождаются на флангах модифицированными РНК-подобными нуклеотидами. После соединения со своей РНК мишенью DNA/RNA двунитевой регион становится субстратом для расщепления с помощью RNase H, тем самым вызывается общие супрессирующие механизмы, нацеленные на экспрессию мРНК (Fig. 3A).

Др. олигонуклеотидный подход обладает преимуществами клеточного пути RNA interference (RNAi), который использует взаимодействие small-interfering RNAs (siRNA) с РНК мишенью, формируя РНК дуплексы, которые распознаются и соединяются с помощью RNA-induced silencing complex (RISC) (Fig. 3) (Setten et al., 2019). Путь RNAi нуждается в процессинге субстрата в виде двунитчатой РНК, одна из нитей которой осуществляет взаимодействие с РНК мишенью. В клетках млекопитающих экзогенные, длинные dsRNAs (обычно более 30 нуклеотидов) могут быть распознаны с помощью рецепторов участвующих в пути передачи сигналов, который индуцирует продукцию типа I interferon (interferon response), запуская реакцию врожденного иммунитета, механизм клеточной защиты от вирусной инфекции (Maillard et al., 2016). Активация этого противо-вирусного пути затрагивает статус воспаления ткани и может также препятствовать самому пути RNAi, повышая одновременно потенциал эффектов вне мишени и смешанных эффектов экспрессии генов (Machitani et al., 2017; Olejniczak et al., 2016; Sioud, 2015). Т.о., подход с двунитчатыми РНК олигонуклеотидами д. быть предназначен для ускользания от действия иммунной системы, обычно с помощью длины менее 30 нуклеотидов. Напр., прямое внесение синтетических siRNAs, вместо длинных dsRNAs, выявляет RNAi, которая в основном, хотя и не полностью, обманывает реакцию interferon (Ishibashi et al., 2011).

Короткие шпилечные РНК (shRNAs) являются более длинными stem-loop РНК, которые обычно поставляются с помощью вирусных векторов, транскрибируются в ядре и затем преобразуются в siRNAs. Эти производные siRNAs постепенно загружаются на RISC для специфической активности по замалчиванию генов точно также как синтетические siRNAs (Rao et al., 2009). Однако, потребность в вирусных векторах для экспрессии shRNA вызывает затруднения с доставкой, экспрессией и безопасностью, которые сопровождают подходы по генотерапии (Wang et al., 2019). RNAi может также использовать miRNAs. Важным отличием между базирующейся на miRNA терапии, которая воспроизводит естественно появляющиеся miRNAs у клетках, и siRNA подходов является то, что siRNAs являются полностью комплементарными своим намеченным целям и имеют одну специфическую РНК мишень, тогда как miRNAs комплементарны лишь частично и могут иметь многочисленные мишени (Lam et al., 2015).

Аптамеры и decoys отличаются от др. форм молекул нуклеиновых кислот и поэтому они не действуют путем комплементарного спаривания оснований с мишенью, а скорее путем соединения с белками, чтобы секвестрировать их от соединения со своими биологическими мишенями (decoys, aptamers) или чтобы запретить реакцию иммунной системы (CpG олигонуклеотиды) (Fig. 3C) (Bayik et al., 2016; Denichenko et al., 2019; Nimjee et al., 2017). Соединение белков с нуклеиновыми кислотами вмешивается в нормальную активность белков. Кстати, только один аптамер, Macugen™, был разрешен FDA для коммерческого использования, хотя др. также были тестированы в клинических испытаниях по разным показаниям (Kaur et al., 2018; Zhou and Rossi, 2017). Macugen™ был разрешен FDA в 2004 в качестве лечения неоваскулярной зависимой от возраста макулярной дегенерации. Лекарство действует, связывая VEGF и блокируя взаимодействия с его рецептором. Хотя и не столь успешные по сравнению с др. терапевтическими стратегиями, базирующимися на нуклеиновых кислотах, DNAzymes и ribozymes были также тестированы в качестве терапевтических средств. Эти нуклеиновые кислоты были предназначены для связывания и расщепления, блокирования и репарации или модификации связанных РНК посредством ферментативной активности, присущей структуре олигонуклеотидов (Fig. 3) (Lilley, 2019; Liu et al., 2017). С помощью этих стратегий пока не удавалось воздействовать и лечить нарушения внутреннего уха, их потенциал нуждается в дальнейшем исследовании.

Использование молекул нуклеиновых кислот для лечения болезней быстро увеличивается. Лечебный потенциал любого подхода, базирующегося на нуклеиновых кислотах, предопределяется как и обычного лекарства. В частности, затруднения касаются доставки, специфичности, токсичности; свойств, которые в большинстве случаев являются уникальными для типа нуклеиновых кислот (Johannes and Lucchino, 2018; Lieberman, 2018). Сегодня лекарства, базирующиеся на нуклеиновых кислотах, на рынке воздействуют на болезни, затрагивающие ЦНС и периферическую нервную систему, используя как как большие, так и малые дозирующие объемы и разные интервалы между дозами. Эффективность этих стратегий предоставляет доказательства ценности терапии лекарстами из нуклеиновых кислот, также как и цены их использования. Однако, сегодня невозможно подсчитать цены сходного типа терапевтических вмешательств в амниотическую послость и применения отических ASO для лечения болезней внутреннего уха, поскольку фармакодинамика ASOs после доставки в плод или амниотическую полость д. быть определена экспериментально. Несмотря на это, терапия, базирующаяся на нуклеиновых кислотах, в целом обладает преимуществами как лечение, поскольку зависит от их специфического типа, они могу 1) активировать мишени, которые исторически не поддаются лечению с помощью малых молекул; 2) легко и быстро преобразуется и синтезируется; 3) относительно стабильны; 4) комбинируются с др. лекарствами; и 5) и нуждаются в индивидуальной персонализации. Обширные исследования по улучшению дизайна, химическим модификациям и доставке, привели к быстрому росту способностей лекарств из нуклеиновых кисло. Отражением этих улучшений и преимуществ стал сентябрь 2019, когда 9 терапий, базирующихся на олигонуклеотидах, и два терапевтических вмешательства, базирующихся на замещении генов с доставкой in vivo были одобрены для коммерческой продажи FDA или European commission (Table 4) и ещё больше находится на разной стадии клинических испытаний (Shahryari et al., 2019).

Успех в терапии потери слуха и вестибулярной дисфункции у модельных мышей для болезней внутреннего уха человека был достигнут при использовании ASOs, которые использовали постнатально (Hastings and Jones, 2019; Lentz et al., 2013; Vijayakumar et al., 2017). Этот успех подстегнул интерес к пониманию потенциала этих молекул в качестве лекарств при дисфункции внутреннего уха, в частности эффективности доставки из плодам. Depreux с колл. установили, что доставка антисмысловых олигонуклеотидов на ст. E13-13.5 в амниотическую полость мышей модулирует экспрессию РНК мишени у постнатальных мышей (Table 3) (Depreux et al., 2016). Метастазы, ассоциированные с lung adenocarcinoma transcript 1 (MALAT1) хорошо охарактеризованы с помощью некодирующей РНК, которая широко экспрессируется по всему телу и не существенна для плодной и постнатальной жизнеспособности. Высоко эффективные ASO, нацеленные на MALAT1, была микроинъецирована на ст. E13-13.5 в амниотическую полость мышей, а уровни MALAT1 были количественно оценены в разных тканях, включая и внутреннее ухо на ст. P1, P7, P15 и P30. Целенаправленное воздействие на MALAT1 оказалось эффективным в почках и печени на 1 и 4 неделях после рождения, соотв. Снижение MALAT1 во внутреннем ухе было устойчивым на 2-3 неделях после рождения. Данные подтверждают, что системное введение ASOs в плод может быть эффективным для модуляции генной экспрессии во внутреннем ухе.

Авт. затем занялись поиском, действительно ли ASO, доставляемые в амниотическую полость, могут модулировать экспрессию мРНК в соотв. моделях болезней внутреннего уха. Синдром Usher типа 1c у мутантных мышей, несущих мутацию 216G > A в каркасном белке harmonin, который вносит скрытые сайты сплайсинга, сдвиг рамки считывания и преждевременный стоп-кодон (Lentz et al., 2007). Ush1c мутантные мыши аккуратно воспроизводят слуховые, вестибулярные и зрительные фенотипические отклонения в раннем юном возрасте (Lentz et al., 2010; Mathur and Yang, 2015; Millan et al., 2011). Доставка ASO, нацеленных на скрытые сплайс-сайты в амниотической полости мутантных Ush1c мышей на ст. E13-13.5, создают правильно сплайсируемую Ush1c мРНК на ст. P22, которая сравнима с уровнями Ush1c мРНК , достигаемыми с помощью эффективной терапии при внутрибрюшинных инъекциях ASO-29 на ст. P5 (Depreux et al., 2016; Lentz et al., 2013; Ponnath et al., 2018). Эти данные демонстрируют, что доставка ASO в амниотическую полость эффективно модулирует метаболизм РНК в печени, почках и внутреннем ухе и подтверждают, что введение в амниотическую полость ASOs может быть приемлемым способом лечения врожденных болезней, возникающих с результате аберрантного сплайсинга пре-мРНК .

Внутреннее ухо плодов мышей подвергалось целенаправленному воздействию исключительно на ст. отоциста для доставки биоактивных реагентов, чтобы лечить генетические формы потери слуха и баланса (Table 3). Зарождающийся отический пузырек формируется у эмбрионов человека на ст. 21-29 сомитов и полностью закрывается в заполненную жидкостью структуру примерно на ст. 30 сомитов или 6 недель беременности (O'Rahilly, 1963). Важно, что большинство беременностей у людей подтверждается на ст. 6 недель беременности, когда эмбрион человека всего лишь 3-5 mm в длину с отоцистами в несколько сот микронов вдоль передне-задней оси (O'Rahilly, 1963). Маловероятно, что возникающий пузырек отоциста человека может представлять собой подходящую мишень для терапевтического вмешательства, исходя из его раннего образования в ходе развития, малых размеров и недоступности выстилки матки. Прямая доставка биоактивных реагентов в развивающееся внутреннее ухо до закрытия предполагаемого пренатального окна эффективной терапии на ст. 19 недель беременности, д. требовать целенаправленного воздействия на зрелый мембранозный лабиринт во время второго триместра беременности (Fig. 2) (Johnson Chacko et al., 2019; Locher et al., 2013). Модельные системы высших позвоночных характеризуются возникновением слуха у плодов и требуют доставки определенных биоактивных реагентов и тестирования их надежности и эффективности в этом возрасте.

Имеются многообещающие примеры, при которых лекарственная или генотерапия применяются вне постнатального промежутка времени эффективности, но улучшают сенсорные функции (Table 5). В каждой такой модельной системе структура волосковых клеток в основном сохраняется в течение продолжительного времени после рождения предоставляя возможность молекулярного вмешательства для улучшения экспрессии гена и восстановления функции.



Table 5. Gene therapies and pharmacotherapies administered from postnatal day 6-90 in mouse models of hearing loss and vestibular dysfunction.

Мыши Tg; KIKI моделируют прогрессирующую потерю слуха, наблюдаемую у пациентов при Usher синдроме type , несущих мутацию в clarin-1, пронизывающем мембрану 4 раза трансмембранном белке, участвующем в синаптической функции и организации цитоскелета (Dulon et al., 2018; Ogun and Zallocchi, 2014). У мышей Tg; KIKI clarin-1 временно экспрессируется в волосковых клетках с помощью atonal homolog 1 энхансера, который поддерживает развитие и созревание волосковых клеток. Мыши Tg; KIKI обладают также аллелем человека N48K clarin-1, с missence мутацией в законсервированном сайте N-glycosylation, это, как полагают, влияет на укладку и стабильность белка (Alagramam et al., 2016). Потеря слуха у Tg; KIKI мышей начинается на ст. P30 и прогрессирует до выраженной потери слуха к ст. P70 (Alagramam et al., 2016). BioFocus 844, небольшая молекула стабилизатор unglycosylated clarin-1 N48K белка, была использована до начала потери слуха с увеличением дозы в промежутке P10-P45, а также ближе к началу потери слуха на ст. P30-P45. Оба режима продемонстрировали сохранение порогов ABR для 8, 16 и 32 kHz га ст. P55 Tg; KIKI мышей. Это исследование показало, что эти формы потери слуха, при которых сохраняется структура волосковых клеток может быть пригодна для эффективного фармакологического вмешательства в боле поздний период времени.

RE1-silencing transcription factor (REST) является белком,связывающим ДНК, который ассоциирован с histone deacetylases (HDAC), чтобы выключать экспрессию нейрональных генов в не нервных клетках (Table 5) (Chong et al., 1995; Schoenherr and Anderson, 1995). В сенсорных волосковых клетках внутреннего уха укороченная форма REST, лишенная существенных функциональных доменов, продуцируется в результате альтернативного сплайсинга экзона 4, что приводит к появлению неактивного, укороченного белкового продукта (Nakano et al., 2018). Т.о., нейрональные гены мишени являются важными для развития и функции волосковых клеток. В серии экспериментов, Nakano с колл. показали, что G > A мутация в третьем интроне REST лежит в основе DFNA27 (Nakano et al., 2018). Мутация изменяет в REST альтернативный сплайсинг экзона 4, приводя к включению мутантного экзона 4, лишенного стоп-кодона. DFNA27 REST аллель продуцирует функциональный белок, который мешает экспрессии нейрональных генов в волосковых клетках. приводя к потере слуха и вестибулярной дисфункции. Удивительно, HDAC ингибитор SAHA (Vorinostat), вводимый ежедневно под кожу на ст. P7-P15 улучшает слуховые пороги до 8 и 16 kHz у мышей, лишенных одной копии REST экзона 4. Эти данные подтверждают, что фармакологическое ингибирование HDACs в созревающем внутреннем ухе может быть пригодной стратегией для разработки терапии DFNA27 .

Otoferlin экспрессируется в клетках внутреннего уха и концентрируется на базо-латеральной поверхности, где находятся специализированные ленточные синапсы, сообщающиеся с афферентными нейронами спирального ганглия (Roux et al., 2006). Otoferlin обладает трансмембранным доменом, последовательности которого делают возможной инсерцию в мембраны синаптических пузырьков и несут 6 C2 доменов, участвующих в связывании кальция и фосфолипидов (Michalski et al., 2017). Hams с колл. показали, что otoferlin формирует гетеро-олигомерные комплексы с помощью одновременного привлечения белков SNARE и L-type кальциевого канала, Cav1.3 (Hams et al., 2017). Авт. полагают, что otoferlin локализует SNARE белки на проксимальной части каналов Cav1.3, действуя как чувствительный к кальцию каркасный белок, чтобы синхронизировать приток кальция со слиянием синаптических пузырьков (Hams et al., 2017). Мутации в otoferlin вызывают ещё до формирования речи несиндромальную потерю слуха и чувствительную к температуре несиндромальную слуховую нейропатию, нарушая высвобождение синаптических пузырьков из клеток внутреннего уха (Chaib et al., 1996; Shearer and Smith, 1993; Yasunaga et al., 1999). Генотерапевтические стратегии имеют целью внесение дикого типа гена otoferlin в волосковые клетки внутреннего уха оказываются несостоятельными из-за размера кодирующей области otoferlin, который превосходит способность к упаковке AAV ~4700 bp (Wu et al., 2010). Два недавних исследования усовершенствовали подходы, чтобы использовать AAV векторы для доставки крупных генов в волосковые клетки внутреннего уха (Table 5).

Al-Moyed с колл. сравнивали два split-AAV подхода, при которых кодирующая последовательность otoferlin была подразделена между двумя AAV2/6 векторами. Чтобы сформировать otoferlin мРНК полной длины, внутренние волосковые клетки д. быть трансдуцированы этими векторами, чтобы воссоздать кодирующий регион полной длины, с которого и будет осуществляться транскрипция (Al-Moyed et al., 2019). При trans-splicing методике две половинки кодирующей области otoferlin соединяются с помощью негомолгичного соединения концов и сплайсина, удаляющего мешающие длинные терминальные повторы. При dual AAV гибридной методике две порции кодирующего региона соединяются с помощью двух потенциальных механизмов: соединение негомологичных концов со сплайсингом, в качестве trans-splicing метода или с помощью гомологичной рекомбинации, облегчаемой с помощью AK последовательности, вызывающей рекомбинацию, из F1 фага, сопровождающей сплайсинг (Table 5) (Trapani et al., 2014). Оба подхода привели в формированию полной длины мРНК otoferlin у нокаутных по otoferlin мышей и к восстановлении 30% белка otoferlinпо сравнению с внутренними волосковыми клетками дикого типа. Быстрый экзоцитоз оказывался полностью восстановленным у обработанных мутантных мышей, тогда как зависимое от otoferlin пополнение пузырьками во время устойчивой деполяризации внутренних волосковых клеток составляло 30-50% от дикого типа. Click ABR пороги на ст. 3-4 недель улучшались до 40-60 dB для SPL , а для чистых тогов ABR пороги также улучшались до 8 и 12 kHz, tтогда как суммированные амплитуды волн I-V снижались приблизительно наполовину для каждого из возрастов. Авт. полагают, что оптимизация продукции белка otoferlin, которая коррелирует с восполнением доли пузырьков и слуховой функции, может быть достигнута путем усиления вектора в геномной ориентации, чтобы облегчить рекомбинацию, улучшить эффективность транскрипции рекомбинированных геномов и усиливать до максимума эффективность трансляции.

Akil с колл. приспособили технологию dual AAV векторов с AAV гибридной методикой, но они использовали alkaline phosphatase recombinogenic bridging последовательность вместо AK последовательности (Akil et al., 2019; Dyka et al., 2014). Получение полной длины кодирующей последовательности otoferlin возможно посредством соединения негомологичных концов со сплайсингом или с помощью гомологичной рекомбинации, облегчаемой рекомбиногенной последовательностью. Двойные AAV векторы применены к нокаутным по otoferlin мышам непосредственно пред возникновением слуха на ст. P10 и после на ст. P17 и P30 (Table 5). Пороги к чистым тонам ABR спустя 4 недели после инокуляции на ст. P10 и P17 восстанавливались до уровня дикого типа к 8, 16 и 32 kHz. Click ABR пороги оценивали для оценки сохранения восстановленного слуха в 20 и 30 недель после инокуляции на ст. P10 и P17, соотв., и пороги в основном сохранялись на уровне дикого типа. Сохранение порогов к чистым тонам не было описано при инокуляциях на ст. P10 и P17. Пороги к чистым тонам на 3, 14 и 20 неделях после инъекций на ст. P30 были сходными с уровнями дикого типа к 8 и 16 kHz, хотя отмечалось повышение порога к 32 kHz (Akil et al., 2019). Кроме того, латентность волны 1, определяемая как временной интервал между началом click стимула и пиком амплитуды волны I, не отличалась от дикого типа для любого возраста, нормализованные амплитуды волны 1 были снижены почти вдвое у каждого возраста. Авт. полагают, что двойной AAV подход д. предупреждать фенотип otoferlin глухоты, когда применяется не позднее ст. P30. Сохранение функционального восстановления в течение 20 недель примечательно и может быть связано с усилением стабильности рекомбинантной кДНК otoferlin в постмитотических клетках и нечувствительно к митотическому разбавлению биоактивных реагентов.

Эти первоначальные попытки разработать split AAV вектор для терапевтического замещения гена с крупной кодирующей последовательностью обнадеживают. Однако, прямое сравнение эффективности гибридной стратегии невозможно из-за различий в экспериментальном дизайне. В частности на otoferlin обнаружены отличия у нокаутных мышей на разных генетических фонах и когда кодирующий регион otoferlin разделялся в разных местах в кДНК, чтобы сконструировать двойные AAV векторы. Кроме того, обнаруживались различия в рекомбиногенных последовательностях, вирусных капсидах и возрасте доставки AAV (Table 5). Непосредственное сравнение гибридных стратегий с контролем этих колебаний д. прибавить нашему пониманию пригодности каждого подхода.

Имеющиеся клинические данные подтверждают, что генотерапия плодов человека может быть эффективной. Плодная hypohidrotic ectodermal дисплазия является редким, наследственным нарушением, затрагивающим развитие поверхностной эктодермы эмбриона (Itin, 2013). Мутации в гене ectodysplasin A (EDA) объясняют 90% пациентов с X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia (XLHED) (Lin et al., 2017; Yin et al., 2013). Furin, расщепляющий EDA, типа II мембранный белок и член сверхсемейства tumor necrosis factor, продуцирует секретируемую форму (Chen et al., 2001). EDA участвует в эпителиально-мезенхимной передаче сигналов во время морфогенеза поверхностных элеменов эпителия, включая кожу, ногти, волосы, зубы, потовые железы и meibomian железы (Li et al., 2017, 2018; Wang et al., 2016). Дети, рождающиеся с XLHED подвержены риску возникновение гипертермии из-за неспособности потеть и эффективно терморегулироваться (Hammersen et al., 2011). Близнецы с диагнозом XLHED in utero были лечены рекомбинантной человеческой формой EDA с помощью инъекций в амниотическую полость на ст.26 и 31 беременности (Schneider et al., 2018). Постнатально у близнецов обнаруживалось больше зачатков зубов, чем у их нелеченных братьев; нормальные количества слюных желез; устойчивая способность к продукции пота. Напротив, одиночные эмбрионы. леченные одной дозой рекомбинантного белка обнаруживали сходные улучшения характеристик роста поверхностного эпителия, но полное восстановление не происходило в отношении потовых желез (Schneider et al., 2018).

Эти данные подтверждают, что фетальная фармакотерапия для нарушений развития эпителия обладает потенциалом вызывать устойчивую защиту от потенциально фатальной гипертермии. Продолжаются споры о рисках и пригодности плодной генотерапии (Almeida-Porada et al., 2016; Coutelle, 2008; DeWeerdt, 2018; Wagner et al., 2009). Общее мнение на сегодня, что если постнатальные медицинские вмешательства эффективны, то предпочтительно избегать вмешательства в плоды и у беременных женщин. Но безусловно при врожденных с ранним началом потери слуха фетальная генотерапия может восстанавливать слух и баланс более полно и на продолжительное время по сравнению с постнатальными вмешательствами.

The identification of dominant, recessive, X-linked, and mitochondrial gene mutations that cause hearing loss has infused the field of auditory neuroscience with the genetic information required to accelerate the development of gene and pharmacotherapeutics to restore inner ear sensory function. The rapidly advancing potential of nucleic acid therapeutics to treat disease has created an urgent need to address treatment approaches. Targeted interventions in mouse models of human inner ear disease are routinely deployed at P0-P5 in the functionally immature ear. This approach consistently results in a broad range of improvements in hearing sensitivity and balance. The P0-P5 mouse inner ear models the second trimester human inner ear, suggesting that gene therapy and pharmacotherapy in the human fetus may be most effective for sustained rescue of inner ear function. ASOs, in particular, have shown promise as a pharmacotherapeutic strategy due to their chemical stability, toxicity profile, specificity, cost-effectiveness, and demonstrated efficacy for the treatment of other neurological and musculoskeletal diseases. In the case of genetic mutations with delayed sensory cell compromise, early neonatal intervention before irreparable damage or loss of hair cells, supporting cells, or spiral ganglion neurons is a promising approach. The development of higher vertebrate model systems of human inner ear disease will be essential for testing novel therapeutic strategies such as ASO delivery to the amniotic cavity to preemptively restore gene expression prior to the onset of hearing loss and imbalance.