CRISPR-Cas9 система приспособлена к индукции нацеленных на определенный сайт разрывов двойной нити (DSBs) в ДНК (Jinek et al., 2013). CRISPR/Cas9 технология теперь разрабатывается с терапевтической целью для многих органов м видов. Модификации генов с помощью CRISPR/Cas9 после DSBs ДНК могут быть осуществлены или с помощью non-homologous end joining (NHEJ) или с помощью homology-directed repair (HDR) путем включения матрицы эктопического гена.

Печень является предпочтительным органом для клеточной и генной терапии, а также для редактирования генов, поскольку наследственные болезни многочисленны и часто угрожают жизни. HDR при tyrosinemia у модельных мышей, как было установлено, корректирует болезнь, хотя эффективность гомjлогичной рекомбинации без индукции DSBs была очень низкой (Paulk et al., 2010, Junge et al., 2018). У сходных модельных мышей CRISPR/Cas9-обеспечиваемое фенотипическое исправление было продемонстрировано посредством гидродинамических инъекций ДНК (Yin et al., 2014) и комбинации не вирусной Cas9 мРНК с adeno-associated viral (AAV) вектором, обеспечивающим доставку HDR матрицы (Yin et al., 2016). AAV векторы появились как устройства для доставки генов в печень в ходе клинических испытаний на людях (Nathwani et al., 2014). Недавно было испробовано использование двойной AAV векторной системы, кодирующей Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) кассету экспрессии на одном векторе и guide RNA (gRNA) и репарационной матрицы на втором векторе, это приводило к устранению мутации в гене ornithine transcarbamylase у новорожденных мышей (Yang et al., 2016). Подразделение такого in vivo инструмента по двум векторам позволило преодолеть ограничение по размеру багажа AAV, который ограничен 4.9 kb (Grieger and Samulski, 2005) - 5 kb (Wu et al., 2010). Совместная доставка двух разных AAV векторов, кодирующих части из необходимых компонентов, которые восоединялись внутри клетки с помощью транс-сплайсинга, гомологичной рекомбинации или inteins (Truong et al., 2015), это оказалось осуществимым in vivo с низкими частотами (Xu et al., 2004).

Здесь мы сконструировали одиночный AAV вектор, кодирующий Cas9, репарационную матрицу и два gRNA гена, в результате вектор вмещал геном в 5.73 kb (исключая inverted terminal repeats [ITRs]), чтобы корректировать экзон 5 fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) у мышей, моделирующих tyrosinemia (Grompe et al., 1993). Вектор был упакован в AAV вариант, лишенный минорного капсидного белка VP2 (ΔVP2). решение базировалось на том факте, что VP2 не существенен для сборки и инвазивной способности (Warrington et al., 2004), но требует пространства в капсиде, поскольку N-терминальный домен из 5 VP2 белков ориентирован внутрь капсиды (Bleker et al., 2006). Grieger and Samulski (Grieger and Samulski, 2005) тестировали эту стратегию для серотипов 1-5, не обнаружив преимуществ такой упаковки. Хотя и не было обнаружено преимуществ в их исследовании, мы решили проверить эту стратегию, особенно в контексте AAV8, поскольку его тропизм к печени составлял привлекательное преимущество для цели нашего исследования, поскольку эффективная доставка большого размера трансгена посредством AAV в печень оставалась необходимым инструментом. Донорская матрица была фланкирована с помощью геномных последовательностей, на которые д. целенаправленно воздействовать SaCas9, чтобы обеспечить эксцизию матрицы прежде гомологичной рекомбинации. Вирусный вектор был использован для репрограммирования в гепатоцитах Fah-/- транскрипционного фактора ex vivo, которые затем были трансплантированы in vivo посредством инъекции в хвостовую вену. Оба подхода оказались успешными в повторном заселении исправленных по Fah гепатоцитов и они длительно выживали без 2-(2-nitro-4-trifluormethyl-benzoyl)-1,3-cyclohexandion (NTBC), который блокирует путь катаболизма tyrosine, это не позволяло накапливаться выше fumarylacetoacetate. Последующий анализ установил, что хотя частицы AAV8Δ^VP2 вектора демонстрируют способность к эффективной коррекции гена, удаление VP2 не увеличивает усиления способности к упаковке. Согласно Grieger and Samulski, мы также не наблюдали преимуществ AAV2. Однако, при сравнении с естественной способностью к упаковке AAV8 и AAV2 капсид с или без делеции VP, мы неожиданно обнаружили явные различия. В частности, AAV8 вектора обеспечивали упаковку геномов вплоть до 6.17 kb, тогда как AAV2 вектора достигали в соответствии с литературой, порога приблизительно в 5 kb.

Итак, репрограммируемые гепатоциты были подвергнуты действию AIO-SL.AAV2^ΔVP2 и затем трансплантированы, в результате возникали крупные кластеры FAH-позитивных гепатоцитов. Прямые инъекции AIO-SL.AAV8^ΔVP2, скорее всего, приводили к экспрессии FAH и долговременному выживанию гепатоцитов. Вектор AIO-SL вызывал ~6- кратное увеличение степени интеграции матрицы по сравнению с векторами без self-linearization матрицы. Последующий анализ показал, что AAV8 частицы в противоположность AAV2, включали геномы более крупного размера, чем 5.2 kb. Следовательно, наш вектор, базирующийся на AAV8, может стать многообещающим инструментом для стратегии редактирования генов, чтобы исправлять моногенные болезни печени, требующих удаления и/или замещения более крупных по размеру фрагментов.