Посещений:
ГЕТЕРОПЛАЗМИЧЕСКИЕ БОЛЕЗНИ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК



ДНК-редактирующие энзимы. Терапевтический потенциал

DNA-editing enzymes as potential treatments for heteroplasmic mtDNA diseases
U. Zekonyte, S. R. Bacman, C. T. Moraes
J. Int. Med. https://doi.org/10.1111/joim.13055
Митохондрии, как известно, являются "силовыми станциями", продуцирующими большую часть клеточного АТФ посредством оксидативного фосфорилирования (OXPHOS). Однако, митохондрии участвуют в мириадах др. функций, помимо продукции АТФ, включая, но не ограничиваясь биоэнергетическими путями (Krebs Cycle и β -окисление), биосинтетическими путями (синтез аминокислот, нуклеотидов, холестерола, глюкозы и гема), передачей клеточных сигналов, балансом redox эквивалентов (NADH/NAD + уровней), аннти-оксидантной защитой, реакцией, аутофагией и апоптозом [1-3].
Митохондрии, как полагают, возникают из альфа-протеобактерий, захваченных эукариотическими предшественниками, которые позднее установили эндосимбиотические взаимоотношения. Со временем, большинство генов родоначального митохондриального генома были потеряны или перенесены в ядро за счет латерального переноса генов, сделав современные митохондрии содержащими только 37 генов [4, 5]. Подобно своим прокариотическим предшественникам митохондрии представлены двумя самостоятельными мембранами: внутренняя митохондриальная мембрана (IMM) и наружная митохондриальная мембрана (OMM) [2, 5]. Между IMM и OMM находится межмембранное пространство (IMS). Оксидативное фосфорилирование происходит в комплексах, внедренных во IMM. В митохондриальном матриксе энзимы цикла трикарбоновых кислот (TCA) генерируют NADH и FADH2, которые действуют как переносчики электронов, поставляя электроны в электронную транспортную сеть (ETC). ETC состоит из 4-х комплексов (комплекс I-IV), которые подкачивают протоны из митохондриального матрикса в IMM. Генерируемый градиент протонов используется для усиления АТФ синтазы (комплекс V), который фосфорилирует АДФ в АТФ [2].
Протеом митохондрий составляет ~ 10% от всего протеома клетки. Поэтому большинство митохондриальных белков транскрибируются генами ядра, транслируясь в клеточный матрикс и импортируясь в митохондрии. Оптимальная функция митохондрий зависит как от ядерного, так и митохондриального генома и мутации любого из них затрагивают функцию и здоровье митохондрий [6].
Отдельно от ядерного генома, 16.5 kb двойной нити циркулярного митохондриального генома (mtDNA) кодируют 13 белковых субъединиц для энзимов OXPHOS: 7 субъединиц Complex I, 1 для Complex III, 3 для Complex IV, и 2 для Complex V; и 22 tRNA's и 2 rRNA's, необходимые для трансляции внутри митохондрий [7, 8]. У млекопитающих mtDNA почти всегда наследуется по материнской линии, а отцовская mtDNA активно разрушается после оплодотворения [2, 9, 10].
Организация митохондриального генома слегка отличается от ядерного генома. А именно, у позвоночных в mtDNA кодон AUA (кодирует метионин вместо изолейцина), UGA (кодирут триптофан вместо STOP), и AGA и AGG (кодируют STOP вместо аргинина) [6]. mtDNA не организована в парные хромосомы, а скорее присутствует в виде компактных нуклеоидов (комплекс из mtDNA и белка) , которые пролиферируют независимо от ядерной ДНК (nDNA) [11]. Посредством пока невыясненного механизма, как известно, количество копий mtDNA тонко контролируется [12]. Напр., происходит увеличение числа копий mtDNA во время созревания ооцита, и постоянные количества копий в примордиальных зародышевых клетках [13]. Митохондрии также имеют свой собственный аппарат репарации ДНК , который, как полагают, менее эффективен, чем репарация nDNA . Это может объяснить высокое количество копий mtDNA , как результат вредных мутаций, которые д. быть супрессированы копиями дикого mtDNA [6].

Heteroplasmy, segregation и disease


Имеется в среднем около 1000 копий mtDNA в каждой клетке человека [14]. Если только субнабор этих молекул обнаруживает измененную последовательность, то мы имеем т. наз. гетероплазмию. Однако многие люди из популяции несут низкие уровни мутаций mtDNA без симптомов. Это обусловлено тем, что существует определенный порог мутантных по отношению к дикого типа mtDNA, прежде чем будет достигнут биохимический фенотип (обычно >70-90%) в зависимости от мутации [15].
Симптомы митохондриальной болезни варьируют значительно, даже между пациентами, несущими одну и ту же мутацию. Это потому, что симптомы зависят от уровня гетероплазмии в затронутой ткани. Биохимический порог отличается в каждой ткани и в зависимости от достигнут ого порога проявляются симптомы [16, 17].
Индивиды с высокими уровнями мутантной mtDNA часто обнаруживаются в семьях с отсутствием болезни в анамнезе и матери которых здоровы. Если mtDNA наследуется по материнской линии, то как же возникает подобный феномен? Важно отметить, что обычно матери уже являются носителями субнабора мутантных молекул mtDNA, но уровни их гетероплазмии не достигают биохимического порога, необходимого для проявления болезни. Напротив, дети, рожденные с субпороговыми уровнями иногда имеют гетероплазмию мутаций, уровни которых увеличиваются в течение жизни и у взрослых развивается болезнь. Увеличение мутантной mtDNA может происходить c помощью одного из механизмов, включая узкое горлышко в передаче во время оогенеза, очищающей селекции по время передачи зародышевой линии, вегетативной сегрегации, ослабленной репликации или репликативных преимуществ [6].
У млекопитающих mtDNA наследуется матерински, а женщины, несущие гетероплазмическую мутантную mtDNA могут передавать разные количества мутантной mtDNA своему потомству. Это обусловлено 'узким горлышком', которое возникает в зародышевой линии матери, при этом уровни mtDNA существенно уменьшаются, так что предается ~200 копий на клетку и затем количество увеличивается предположительно до 100 000 копий в зрелых ооцитах [6, 18, 19]. Таким способом, небольшой субнабор mtDNA молекул может становиться представленным избыточно в зрелом ооците. Также в состоянии зародышевой линии mtDNA может подвергаться селекции, механизм которой мало понятен, который наделяет потомков определенным типом мутаций [20, 21].
Делящиеся клетки случайно сегрегируют свои митохондрии во время клеточных делений. Если присутствует вариант гетероплазмии, то каждая дочерняя клетка может получить разные пропорции дикого типа и мутантной mtDNA. Средний процент мутантной mtDNA может оставаться тем же самым в клеточной популяции, но если клетки с более высокими уровнями мутантной mtDNA пролиферируют быстрее, то будет проявляться 'эффект основателя', создающий линию клональных клеток с более высокими уровнями мутантной mtDNA. Этот процесс называется вегетативной сегрегацией и имеет место при сегрегации во время формирования ооцита, а также со временем в делящихся соматических клетках в теле [6, 22].
Последний метод селекции мутантной mtDNA - это репликативное преимущество. В этом механизме молекулы mtDNA, которые обладают определенного сорта репликативным преимуществом, копируются более часто, чем млекулы дикого типа mtDNA. Это было подтверждено для молекул, которые несут крупные патогенетические делеции, они на несколько kilobases меньше молекул дикого типа, следовательно, делеции, теоретически, реплицироваться на несколько циклов быстрее и чаще доступны для репликации. Этот механизм также является возможным объяснением накопления уровней мутантной mtDNA в течение жизни пациента, что приводит к прогрессированию тяжести фенотипических отклонений [6].
Единственным различием между nDNA и mtDNA является то, что nDNA реплицируется только один раз в клеточном цикле, тогда как mtDNA реплицируется постоянно в ходе клеточного цикла, даже в постмитотических клетках. Этот процесс наз. relaxed репликацией. В течение всего клеточного цикла mtDNA постоянно заменяется (turning over), это также может вызывать сдвиги в гетероплазмии. Отбор в направлении или против мутантной mtDNA (mentioned later) может сильно менять гетероплазмию в ходе жизни [6, 22, 23]. Это одно из объяснений того, как гетероплазмия может меняться у индивида со временем и вызывать позднее проявление или прогрессирование болезни в ходе жизни.
ем
Мутации накапливаются у индивидов со временем, при этом в среднем 100 мутаций mtDNA на индивид возникает к 70 годам[6, 24]. Такое накопление мутаций может испытывать влияние со стороны некоторых упомянутых выше механизмов, чтобы повышать мутантную mtDNA и также связано с процессом старения и и болезнями с поздним началом [24].
Мутации в mtDNA участвуют в нейромышечных и нейродегенеративных нарушениях, а также в бюолее сложных болезнях, таких как диабет, сердечно-сосудистые болезни, рак и старение [1, 2]. Кстати, свыше 300 мутаций mtDNA оказываются связаннс болезнями человека и затрагивают 1/5000 индивидов в популяции [15, 24, 25]. Мутации в mtDNA в основном вызывают дисфункцию митохондрий за счет подавления биогенеза OXPHOS посредством мутаций OXPHOS комплексов или за счет нарушений трансляции в митохондриях посредством мутаций, вызывающих нестабильность в tRNAs и rRNAs. Снижение продукции АТФ - биохимическое изменение, которое возникает в результате этих мутаций - может приводить к нарушению функций клеток и клиническим проявлениям [7].

Changing mtDNA heteroplasmy using DNA-editing enzymes


Митохондриальные генетические болезни могут серьезно нарушать качество жизни. У пациентов могут возникать потери слуха и зрения, мышечная слабость, потеря координации, инсульты и диабет помимо прочих [26-29]. Сегодня нет эффективного лечения таких пациеннов и помимо только постановки диагноза доктора могут только справляться с симптомами, предписывая различные витамины и добавки, упражнения, словесную терапию, физическую терапию, трудотерапию и респираторную терапию [30].
Ученые стремятся изменить соотношение мутантного и дикого типаmtDNA, путем элиминации мутантной mtDNA в клетках, чтобы устранить биохимический дефект. Т.к. соотношение, приводящее к болезни составляет >70-90% мутантной mtDNA, то возможно ослабить симптомы путем снижения уровня мутантной mtDNA до 20-30%. Это может стать мощным подходом, поскольку нет необходимости замещать всю или половину копий мутантной mtDNA, как в случае с генами nDNA. В последние 20 лет, растет интерес к генотерапии и энзимам редактирования генов.



Figure 1

Different mitochondrial nucleases used to change mtDNA heteroplasmy. Mitochondrial-targeted restriction endonuclease, Zinc-finger nuclease, TALEN и Tev-TAL hybrids have been used in experimental models (cultured cells и mouse) to change mtDNA heteroplasmy

Table 1. Advantages и disadvantages of current methods to eliminate mutant mtDNA

Mitochondria-targeted restriction endonucleases


Митохондрии не имеют эффективного механизма репарации от двухнитчатых разрывов (DSB) . Более того, недавно было показано, что превращенная из кольцевой в линейную mtDNA быстро деградирует за счет компонентов реплисом, включая митохондриальную polymerase gamma (POLG) и нуклеазу MGME1 [31-33]. Нацеленные на митохондрии рестрикционные эндонуклеазы (mitoREs) являются рекомбинантными REs, которые экспрессируются в ядерно-цитозольных компартментах и достигают органелл благодаря сигналам локализации в митохондриях (MLS), которые являются N-терминальными полипептидами, которые помогают направлять белки в митохондрии. Будучи импортированными mitoREs распознают специфическую последовательность в mtDNA и вызывают двунитчатые разрывы. Этот метод был использован для избирательного расщепления одного из типов mtDNA в клетках с гетероплазмией или мышиных линиях, вызывая сдвиг в гетероплазмии. Линия клеток цибридов, содержащая как мышиную, так и крысиную mtDNA, стала первой моделью для проверки принципа действия такго механизма. Мышиная mtDNA содержит два сайта PstI, тогда как крысиная mtDNA не содержит ни одного. Экспрессия mito-PstI в такой гетероплзмической клеточной линии приводит к значительному сдвигу в гетероплазмии, за счет снижения мышиной mtDNA [34].
Временная экспрессия SmaI в линии клеток, полученной от пациента с болезнью Leigh's, несущего гетероплазмическую мутацию m.8993T>G даостигалась за счет использования нацеленной на митохондрии SmaI. SmaI распознавание последовательности является специфическим для точечной мутации, но не для дикого типа mtDNA. Такое избирательное расщепление приводит к редукции уровней мутантной mtDNA в культуре клеток (с 98% мутантной mtDNA до 60%). Наблюдалось восстановление всего уровня mtDNA, уровней клеточной АТФ и мембранного потенциала, указывая, что временная экспрессия mitoREs не является вредной для клеток [35].
MitoREs оказались также не эффективными in vivo у NZB/BALB гетероплазмических модельных мышей. ApaLI имеет одну распознаваемую последовательность на BALB mtDNA, но не на NZB mtDNA. Было установлено, что использование рекомбинантного adeno-associated virus type-6 (rAAV6) и adenovirus type-5 (rAd5) элиминировало BALB mtDNA в сердце и печени, соотв. [36]. Сходные результаты наблюдали, используя rAAV9 [37].
Нацеленные на митохондрии REs эффективны в расщеплении мутантной mtDNA и сдвиге гетероплазмии, но они ограничены из-за малочисленности уникальных сайтов распознавания, вызываемых патогенными мутациями.

Mitochondria-targeted Zinc-Finger nucleases


Чтобы преодолеть барьер, предоставляемый mitoREs, ученые нашли способы преобразовывать эндонуклеазы, чтобы они распознавали более длинные интересующие специфические сайты мишени. Zinc-finger нуклеазы (ZFNs) действуют как димеры, которые обладают как Cys2His2 zinc-finger ДНК-связывающим доменом, так и a FokI ДНК-расщепляющим доменом.ДНК-связывающий домен может быть изменен, чтобы распознавать относительно длинные и специфические последовательности, а FokI расщепляющий домен, после димеризации вызывает двунитевые разрывы [38].
Происходящие от пациентов клетки цибриды, несущие мутацию m.8993T> G, ассоциированную с нейропатией, атаксией и retinitis pigmentosa (NARP), временно трансфицированные mtZFN, обнаруживали снижение мутантной mtDNA и восстановлен е митохондриальной респираторной функции. mtZFN были также использованы для распознавания 'common deletion', делеции в 4977-bp, ассоциированной с синдромами Kearns-Sayre и Pearson's и эффективно снижали уровень mtDNA в клетках [39].
Совсем недавно, mtZFNs были использованы для (in vivo) у гетероплазмической мышиной модели, несущей мутацию m.5024C>T в mt-tRNAAla [39]. Эта мышиная модель обнаруживала снижение общего уровня mt-tRNAAla, когда уровень мутаций был высок [40]. После системного введения rAAV9-mtZFN, животные обнаруживали достоверное сни жение мутантной mtDNA в сердце и увеличение tRNAAla, это показывало, что подобное воздействие устраняет биохимические отклонения фенотипа [39].

Mitochondria-targeted transcription activator-like effector nucleases


Др. семейство программируемых ДНК-редактирующих энзимов, которые были разработаны для генотерапии, это transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Подобно ZFNs, TALENs обладают ДНК -связывающим доменом, слитым с FokI эндонуклеазным доменом и они функционируют как димеры. ДНК-связывающий домен представлен модулями, каждый содержит по 34 аминокислоты, при этом 12th и 13th аминокислоты распознают последовательность мишень mtDNA . Эти детерминантные аминокислотные остатки наз. repeated variable di-residues (RVDs) [41]. Поскольку необходимы два ДНК-связывающих домена, один из них был предназначен чтобы связываться специфически с сайтом мутантной mtDNA, тогда как второй мономер соединялся как с дикого типа, так и мутантной mtDNA (Fig. 2a).



Figure 2

MitoTALEN recognition of specific mtDNA sequences. Panel a illustrates how one of the mitoTALEN monomers binds to a mutant?specific region, whereas the other monomer would bind both mutant и wild?type molecules. Panel b illustrates the mechanism of heteroplasmy shift. After a doublestrand break triggered by the specific mitochondrial?targeted nuclease, linearized genomes are rapidly degraded. The reduced mtDNA levels lead to an increase in mtDNA replication of the residual molecules, thereby increasing wild-type mtDNA levels

MitoTALENs бцыли разработаны in vitro, чтобы обнаруживать распространенную делецию (m.8483_13459del4977) и Leber's hereditary optic neuropathy мутацию (m.14459G> A). Обе конструкции успешно сдвигали гетероплазмию в направлении дикого типа в от пациентов произведенной линии клеток цибридов [42]. MitoTALENs вызывали myoclonic epilepsy with ragged-red fibres (MERRF) (m.8344A> G) и мутацию в гене ND5, ассоциированную с синдромом MELAS/Leigh (m.13513G> A) [43]. Как и в случае др. систем, концептуальная основа заключалась с том, что DSB в мутантной mtDNA д. приводить к временному истощанию (в основном из-за высоких уровней мутантной mtDNA), сопровождаемому повторным заполнением популяции молекул mtDNA более высоким процентом молекул дикого типа (Fig. 2b). Такое изменение в гетероплазмии д. предоставлять существенный компонент OXPHOS, прежде отсутствующий, и восстанавливать функцию OXPHOS и нормальный митохондриальный мембранный потенциал (ΔΨm) (Fig. 2b).
rAAV9-mitoTALENs были протестированы на гетероплазмических модельных мышах, обладающий мутацией m.5024C> Tn. После системного введения происходил достоверный сдвиг в направлении дикого типа mtDNA в скелетных мышцах после локальных (внутримышечных) и системных инъекций. Такие животные также обнаруживали восстановление тотальных уровней mt-tRNAAla, указывая на устранение фенотипических отклонений [44].
Фактор, который лимитирует клиническое использование mitoTALENs заключается в том, что они являются очень крупными гетеродимерами, которые трудно упаковать в уникальный вирусный вектор. Архитектурой, которая может преодолеть это ограничение, является мономерная GIY-YIG обратная (homing) нуклеаза из фага T4 (I-TevI), нацеленная на митохондрии (mitoTev-TALEs). Каталитический домен I-TevI, который довольно не специфичен, был слит с TALE ДНК-связывающим доменом. TALE связывающий домен специфически целенаправленно воздействует на анти-смысловую линию, в которой точечная мутация m.8344A> G содержит цистеин. Он отличается от тимина в той же самой позиции у линии дикого типа. Созданы два мономерных mitoTev-TALEs, отличающиеся по размеру TALE ДНК-связывающего домена RVDs. Эти молекулы были протестированы на цибридах, полученных от пациентов, обладающих точечной мутацией m.8344A> G, ассоциированной с миоклональной эпилепсией и ragged-red волокнами (MERRF). MitoTev-TALE эффективно снижал уровень мутантной mtDNA и повышал оксидативное фосфорилирование обрабатываемых клеток цибридов. Временное истощение mtDNA наблюдалось в обработанных клетках, так что дальнейшая характеризация потребовало оценки безопасности такой архитектуры mitoTev-TALE [45].
MitoTALENs были также использованы для целенаправленного воздействия на MELAS мутации в iPSCs. В одной работе было показано, что преобразованные mitoTALENs целенаправленно воздействуют на мутацию m.13513G> A, и уровни мутантной mtDNA снижаются после трансдукции [46]. В др. работе было показано, что в линии клеток iPSC, обладающая мутацией m.3243A> Gn, a mitoTALEN против этой мутации успешно элиминирует мутантную mtDNA, как в клетках iPSC, так и ооцитах свиней после прямой инъеции mitoTALEN мРНК . Было предположено, что этот метод может быть использован для предупреждения передачи мутантной mtDNA при успешном IVF [47].

Mitochondria-targeted CRISPR/Cas9


Система редактирования ДНК CRISPR/Cas9 революционизировала редактирование генов. CRISPR-associated (Cas) гены работают с single-guide RNA (sgRNA), чтобы редактировать последовательности специфических ДНК мишеней. Однако, её пригодность для редактирования mtDNA оказалась спорной и неубедительной. Известно только одно сообщение, в котором было успешно использована CRISPR для расщепления mtDNA в клетках HEK-293T cells. Авт. экспрессировали sgRNAs, специфичную к mtDNA генам Cox1 и Cox3, и надеялись, что этого достаточно локализовать Cas9 в митохондриях. Они описали почти 80-90% снижение интактной mtDNA в HEK-293T клетках [48, 49]. Др. исследования, в основном неопубликованные, оказались неспособны заставить работать mitoCRISPR. Поскольку не существует природного механизма импорта РНК в митохондрии, поэтому использованные механизмы оказались неэффективными. Развернулись споры о возможности использования систем, подобных CRISPR, работающих в митохондриях млекопитающих [49, 50]. Снова главным ограничением стала способность импорта РНК в митохондрии [50]. Использование CRISPR-подобной архитектуры в митохондриях будет очень мощным благодаря последним успехам в разработке инструментов редактирования оснований ДНК [51].

Viral vectors used to deliver mitochondria-targeted nucleases


Adenoviruses
Как уже упоминалось рекомбинантный аденовирус типа 5 (rAd5) был использован in vivo у NZB/BALB мышей, чтобы доставлять mito-ApaLI в митохондрии. rAd5 экспрессирующие mitoREs оказались успешными в элиминации BALB mtDNA в сердце [36]. Хотя rAd5 может нести вставку в 7kb и используется при терапиирака, он не является популярным для использования in vivo из-за его короткого промежутка экспрессии и поощрению сильной иммунологической реакции [52].
Adeno-associated virus
Adeno-associated virus (AAV) наиболее широко используемый вирусный вектор для генотерапии, поскольку экспрессирует длительное время трансген и хорошо известен своей клинической безопасность [53]. Рекомбинантный AAV (rAAV) в основном непатогенен с пониженной иммуногенностью для пациентов [54]. Соотв., дикого типа AAV

непатогенными вирусами и не связаны с какой-либо болезнью или симптомами у людей [55]. Широкий круг тканей и типов клеток может быть трансдуцирован разными серотипами AAV векторов [56, 57]. Ученые работают над дальнейшим изменением оболочки этого вируса, чтобы менять специфичность ткани [58, 59]. Поскольку ген экспрессируется эписомно, то низкая частота интеграции добавляет безопасность [60, 61]. Эписомная экспрессия также сохраняется в тканях, особенно в медленно делящихся и постмитотических тканях [61]. Это полезная характеристика, которая может быть использована как преимущество для экспрессии терапевтических генов в мышцах и нервах пациентов, страдающих от нейромышечных нарушений, таких которые ассоциированы с дисфункцией митохондрий.
Вирусный вектор, однако, обладает некоторыми неудобствами, такими как ограничение размера упаковки до менее 5kb (включая вирусные ITRs), это ограничивает размер трансгена для эффективной доставки [62]. Хотя профиль безопасности AAV хороший, отмечается иммунная реакция у пациентов при воздействии AAV [63]. Поэтому при клинических испытаниях и лечении с использованием AAV, пациенты предварительно тестируются на предмет реакции к специфическому серотипу AAV и/или лечатся иммунодепрессантами [64].
Использование базирующейся на AAV терапии зависит от ткани, нуждающейся в лечении, и болезни. Используются или системное применение (внутривенное) или локальные инъекции непосредственно в ткань. При некоторых клинических испытаниях использовали системную венозную доставку к мишени в печени, т.к. этот орган восприимчив к широкому кругу вариантов AAV. Однако, системные инъекции вызывают иммунные реакции, затрудняющие или делающие невозможным эффективную генотерапию более одного раза [62].
Трансдукция постмитотических тканей, таких как мышцы, преодолевает эту проблему необходимости нескольких доз, поскольку трансген остается в эписоме, что очевидно при экспрессии трансгена в течение нескольких лет. При одиночной инъекции непосредственно в мышцу, белок трансгена может действовать локально или системно. Это имеет место в случае Glybera®, что является базирующейся на rAAV1 генотерапией при lipoprotein lipase deficiency (LPLD), инъецируемом непосредственно в бедро [62].
Прямое введение rAAV в ЦНС используется особенно, если существуют затруднения с созданием терапии для ЦНС, преодолевающей гемато-энцефалический барьер (BBB). rAAV2, rAAVrh10 и rAAV9 были использованы в клинических испытаниях, чтобы осуществить трансдукцию в ЦНС рекомбинантного трансгена. Этот путь особено необходим для болезней. таких как болезнь Альцгеймера и спинальная мышечная атрофия (SMA) [65, 66]. Альтернативно, rAAV9, как было установлено, пересекает BBB даже при системном введении, это было использовано при клинических испытаниях лечения SMA (AVXS-101) [62].
Кроме того, существует множество используемых AAV серотипов, большинство из которых обладает широким тропизмом и может трансдуцировать не только ткани мишени. Эта проблема может быть решена путем изменения существующих белков капсид AAV, чтобы они более избирательно трансдуцировали специфические ткани и снимжали трансдукцию вне мишени [67]. Рациональные разработки, направленная эволюция и in silico методы были использованы, чтобы создать новые вирусные капсиды с более точной тканевой спецификацией [48]. Тканевая специфичность может быть также достигнута путем использования ткане-специфических промоторов. Наиболее распространенным промотором, используемым для митохондриальных нуклеаз является cytomegalovirus (CMV) повсеместный промотор [48]. Однако, ткане-специфические промоторы, такие как α1-antitrypsin (AAT) промотор для трансдукции печени [68], PGDF и NSE для нейронов [69, 70], и desmin для скелетных мышц [71], м. оказаться пригодными для испытаний на человеке

Nonviral vectors


Главным препятствием для использования вирусных векторов являются эффекты иммуногенности, которые они могут вызывать. Используя невирусные векторы можно преодолеть эту проблему. Не вирусные векторы, такие как наночастицы, используются для переноса крупных плазмидных молекул ДНК, малых молекул ДНК в форме олигодеоксинуклеотидов и РНК. Наночастицы для доставки химических невирусных нуклеиновых кислот обычно используют в форме lipoplexes (DNA/catatonic lipid), polyplexes (DNA/catatonic polymer) и lipopolyplexes (DNA/catatonic polymer/catatonic lipid). Неорганические наночастицы могут быть продуцированы из крмнезема или золота, в то время как органические частицы получаются в форме липидных эмульсий, липидных наночастиц и и широкого разнообразия органических полимеров. Доставка этих молекул не всегда прямолинейна, нуждается в физических методах, таких как прямые инъекции, электропортации, сонопортации и magnetofection, чтобы обеспечить доставку гена [72, 73]. Об использовании наночастиц для генотерапии митохондриальных болезней пока не сообщалось.

Challenges for human application of mitochondria-targeted DNA-editing enzymes


Редактирующие ДНК энзимы были успешно трансдуцированы и специфически сдвигали гетероплазмию mtDNA в культуре клеток и у животных, но каждый из них имел определенные недостатки для митохондриальной генотерапии у пациентов. REs пригодны только, если они распознают уникальную мутацию в mtDNA, которая является редкой. Хотя ZFNs и TALENs могут преодолевать эти препятствия, поскольку они могут быть запрограммированы, чтобы распознавать почти любую желательную последовательность, но их димерная природа и крупный размер затрудняют компактизацию обеих половин энзима в один вирусный вектор. Использование двух независимых вирусных частицы увеличивает цену и вызывает технические затруднения, как обе половники энзима собрать в один комплекс, необходимый в одной и той же клетки, чтобы он функционировал. Идет поиск высоко специфичных мономерных энзимов, чтобы преодолеть это узкое горлышко.
Иммунологические барьеры существуют для базирующейся на AAV генотерапии. AAV могут вызывать иммунную реакцию и пациенты, получающие базирующееся на AAV лечение прежде д. быть тестированы на чувствительность к AAV капсиде или принимать иммуносупрессанаты. Должна быть нейтрализована иммунная система. Дальнейшие преобразования AAV серотипов с пониженной иммунологической реакцией расширят пригодность терапии. Изменения вирусных капсид и снижение количества вирусных генов являются двумя возможными методами.
Затруднительно продуцировать AAV вирусные частицы в достаточно высоких титрах, которые необходимы для использования у людей, поэтому при дальнейшеи клиническом использовании это ограничение также необходимо преодолеть [55]. Л очень высокие дозы могут не всегда быть более эффективными. В недавней работе проанализированы эффекты AAV9-mtZFN в снижении количества мутантной mtDNA в мышиной модели, несущей точечную мутацию m.5024C> T в tRNAAla гене в трех разных дозах : низкий, средний и высокий титр. Было установлено, что наивысший титр вызывает тяжелое истощение всей mtDNA, из-за разрезов вне мишени в mtDNA дикого типа. Более того, промежуточный титр не обнаруживал достоверного истощения mtDNA и лучше выполнял работу по сдвигу гетероплазмии в направлении дикого типа и устранению биохимических отклонений в сердце мыши [74].
Одним из наиболее важных препятствий в использовании генотерапии у людей является цена осуществления клинических испытаний и самого лечения. Терапия, разрешенная FDA, может стоить миллионы долларов (такая как Glybera®, цена которой составляет US$1.2 миллиона, и Luxterna, цена которой US$425,000 для одной глазной дозы). Эта высокая цена в основном отражает цену разработки реагента в лекарство. Снижение цены продукции путем обнаружения более эффективных способов продукции высоких титров вируса в необходимых количествах может стать первой ступенью облегчения процесса и снижения цены [75].

Other current gene therapy approaches to mitochondrial diseases


Генотерапия для кодируемых в ядре генов для митохондриальных белков была опробована на мышах. Torres-Torronteras и колл. восстановили нормальный пул нуклеозидов в плазме, тонком кишечнике, скелетных мышцах, головном мозге и печени у Tymp-/- мышей, моделирующих mitochondrial neurogastrointestinal encephalopathy (MNGIE). В этом эксперименте они использовали лентивирусные частицы, экспрессирующие thymidine phosphorylase [76]. Flierl и колл. восстановили ANT1 в мышиной модели митохондриальной миопатии, ассоциированной со слабостью мышц и progressive external ophthalmoplegia (PEO), вызываемых мутациями в сердечно-мышечной изоформе ANT1. Рекомбинантный AAV, несущий мышиную Ant1 кДНК, был инъецирован в икроножуную мышцу мышиных нокаутов по мышечной изоформе ANT1, и выявлялись улучшения в гистопатологии [77]. Рекомбинантный rAAV9-tafazzin приводил к фенотипическому улучшению Barth синдрома у модельных мышей [78].
Комбинация внутривенных (IV) и в желудочки головного мозга (ICV) инъекций rAAV2/9-hNDUFS4 Ndufs4-KO новорожденным и молодым мышам, выяви ла частичное смягчение болезненных проявлений [79]. Наша группа недавно показала, что истощение митохондриального комплекса I субъединицы (NDUFS3), приводящее к делеции у мышей скелетных мышц, ассоциирует с тяжелой миопатией, сопровождаемой пролиферацией митохондрий. Системные инъекции rAAV9-Ndufs3 приводят к реверсии миопатии [80].
Клинические испытания сегодня проводятся для LHON, используя rAAV-обеспечиваемую аллотопическую экспрессию ND4, это согласуется с экспрессией повторно преобразованного, обычно кодируемого mtDNA, гена в ядре [81]. Поскольку глаз является иммуно-привилегированной тканью, теоретически, то множественные дозы могут быть введены пациенту в течение жизни без досадной иммунной реакции [62]. Фаза III клинического испытания аллотопического rAAV2-ND4 для Leber's Hereditary Optic Neuropathy (LHON) пока продолжается. Мы верим, что преклинические исследования этой модели не полностью выявили трудности аллотопической экспрессии ND4. Белок ND4 чрезвычайно гидрофобен, это затрудняет его импорт через митохондриальные поры импорта [82]. Более того, аллотипически экспрессирующийся белок будет конкурировать с эндогенным белком за участие в комплексе I. Результаты пока не являются обещающими, при этом и экспериментальные и контрольные глаза ведут себя одинаково. Следовательно, результаты фазы III клинического испытания не пришли к своему завершению, хотя и было установлена их безопасность [83]. LHON клинические испытания по заместительной терапии аллотопичного митохондриального гена суммированы в Table 2.

Table 2. Current ongoing clinical trials for mitochondrial allotopic gene replacement therapy for LHON