Первичный иммунодефицит (PID) это гетерогенное нарушение, характеризующееся отсутствием или нарушениями развития и/или функции одного или более элементов иммунной системы, возникающее в результате мутаций одиночного гена. Более 430 генов выступают в качестве причины болезни, это приводит к большому набору клинических проявлений, включая чувствительность к инфекциям, аутоиммунитет, воспаление и озлокачествление.¹ Лечебные воздействия варьируют, но главной опорой ведения тяжелых форм PID являлась поддерживающая терапия до начала использования целевой терапии в форме haematopoietic stem cell transplant (HSCT).² При специфических условиях генотерапия может предоставить альтернативное воздействие и ex vivo генотерапия аутологичными HSC использованы в клинических испытаниях для широкого круша нарушений, что сопровождалось успешным лечением ряда PIDs в последние 20 лет.³ Теперь лицензированные аутологичные продукты для генотерапии доступны пациентам с дефицитом adenosine deaminase (ADA), с комбинированным тяжелым иммунодефицитом (ADA-SCID) и β-thalassaemia. Генотерапия с помощью T клеток может служить потенциальным терапевтическим подходом для для состояний с первичными нарушениями лимфоидного компартмента и в этом отношении были изучены иммунные нарушения и инфекционные болезни, используя ряд разных техник модификаций гена (Fig 1). (Table I).

Fig 1 Schematics representing the different targets and platforms for T cell gene therapy approaches. (Top) T cell scheme demonstrating current T cell-dependent targets of immunodeficiency and corresponding treatment platforms with either vector-based gene therapy, chimaeric antigen receptor (CAR)-T cell therapy or gene editing. (Bottom) Key modes of gene-editing technology including Transcription activator-like effector nuclease (TALENS) with enhanced modularity and DNA-binding domains (DBD) and the CRISPR/Cas9 system.

Table I. List of immunodeficiency diseases and associated T cell directed treatment platforms with zinc finger nucleases (ZFN), transcription activator-like effector nucleases (TALEN), gamma and alpha retroviral (GRV/ARV) and lentiviral (LV)?mediated therapies - previous clinical trials and current preclinical studies.

Терапия ген-модифицированными Т клетками привлекла огромный интерес в последнее время, вследствие успешного лечения пациентов со злокачественными B клетками с помощью Т клеточной терапии с chimaeric antigen receptor (CAR). Однако, концепция Т-клеточной иммунотерапии зародилась 10 лет тому назад и была существенно улучшена и приспособлена к ряду состояний, включая инфекционные болезни, злокачественные и иммунные нарушения. Эволюция началась в 1980s с вливаний донорских лимфоцитов после модифицирования генов периферических лимфоцитов, проникающих в опухоли лимфоцитов, вирус-специфических цитотоксических Т клеток^{4, 5} и CAR-T клеток; j] это не является исчерпывающим списком стратегий, пригодных для клинического использования.⁷Каждое повторение терапии модифицированными Т клетками было критическим для нашего обучения и позволило улучшить протокол, адаптированный к индивидуальны обстоятельствам, базируясь на необходимости сохранения или улучшения эффективности модифицированных клеток и клинических протоколов.^{8, 9}

До сегодняшнего дня только ex vivo HSC генотерапия вызывала устойчивый терапевтический эффект при специфических PID; вплоть до сегодняшнего дня недостаточно клинических данных, чтобы продемонстрировать эффективность T-клеточного подхода к любому наследственному нарушению. Трансдукция HSCs делает возможной корреляцию всех гематопоэтических клонов, включая миелоидный компартмент, что существенно для многих PIDs, таких как Wiskott-Aldrich синдром и хроническая болезнь легких и хронический грануломатоз, а коррекция CD34+ клеток способствует продолжительности жизни посредством модификации само-обновляющихся предшественников. При ряде PIDs, как полагают, компартмент Т клеток единственный, функция которого нарушена и поэтому корекция этого компартмента д. предоставлять терапевтическую возможность, обладая преимуществами по сравнению с классическим HSC подходом. В самом деле, некоторые состояния продемонстрировали непригодность HSC генотерапии из-за конститутивной экспрессии во всех гематопоэтических клонах, что приводило к пролиферации лимфоидных клеток.¹⁰ Перенос ген-модифицированных Т клеток продемонстрировал безопасность в предыдущих клинических испытаниях для некоторых severe combined immune deficiency (SCID) и при этом иммунотерапия не сопровождалась инсерционным мутагенезом. Процедура с аутологическими Т клетками также нуждается в существенно меньшей препаративной химиотерапии, чем процедура с HSC, которая связана со снижением токсичности. Тем не менее, сохранение T клеток in vivo остается нерешенным вопросом в контексте иммунодефицита.

Adenosine deaminase deficient severe combined immunodeficiency (ADA-SCID) стал одной из первых мишеней вследствие открытия искусственного преобразования T клеток с помощью вирусных векторов в 1990s.¹¹ При ADA-SCID, пациенты лишены T, B и NK клеток как результат нарушений гуморального и адаптивного иммунитета, такие пациенты чувствительны к угрожающим жизни инфекциям в раннего возраста.

ADA является энзимом пути утилизации отходов метаболизма пуринов¹², он повсеместно экспрессируется во многих типах тканей и проявляется во многих системах, характеризуется потерей слуха, болезнями легких и задержкой развития.^13,14 Отсутствие фермента приводит к продукции токсических метаболитов, которые чрезвычайно вредны для развития лимфоцитов и возникает иммунодефицит, фатальное состояние, если остается нелеченным. В ходе трех декад были разработаны множественные лечебные процедуры как для ведения, так и лечения ADA-SCID. Лечебные средства включают enzyme replacement therapy (ERT) из PEGylated ADA, вводимого внутримышечно раз в две недели, которые вызывали детоксификацию метаболитов и часто некоторое восстановление иммунитета. ERT использована чтобы стабилизировать пациентов перед определяющим воздействием, но следует учитывать непригодность его для долговременного использования из-за затухания восстановления иммунитет со временем и высокой цены лечения.^{15, 16}

Т.к. для большинства PIDs трансплантации аллогенных гематопоэтических стволовых клеток (HSCT) могут предоставить лечебную терапию с очень высокой долей жизнеспособности в контексте использования HLA-совпадающих семейных доноров; однако, исторически исходы минимальны при использовании неродственных доноров или несовместимых доноров.¹⁸ Плохие исходы после использования HSCT с неидентичными по HLA трансплантатами привело к разработке аутологичной ex vivo генотерапии в качестве альтернативного воздействия на пациентов, лишенных пригодных для трансплантации доноров. Использование аутологичных клеток снижает риск аллореактивности и делает менее токсичным режим кондиционирования, предоставляя несколько преимуществ по сравнению с HSCT от несовместимых доноров.

Первая генотерапия при ADA-SCID была фактически стратегией аутологичных ген-модифицированных Т клеток. В 1990s группа из Bethesda, Milan и Japan использовали аутологичные peripheral blood lymphocytes (PBLs) от пациента для ex vivo модификации гена ADA вводимые с первой генерацией гамма-ретровирусных векторов. Миланская группа включила дополнительно предшественники костного мозга с целью улучшить приживление ген-модифицированных донорских клеток, а также один пациент в группе из Bethesda получил откорректированные по гену HSC примерно спустя 2 года после генотерапии с помощью PBL для улучшения эффективности. Данные этих испытаний, при которых не производилось кондиционирование, продемонстрировали сохранение в кровообращении ген-модифицированных T клеток даже спустя более 10 лет после генотерапии^{19, 20} с умеренными улучшениями в отношении реакции на антиген и уровни активности ADA.^{24, 26, 28} Анализ Т клеток пациентов спустя определенное время выявил интересную информацию относительно терапевтического потенциала такого подхода. У большинства пациентов наблюдалось восстановление функции Т клеток путем сравнения продукции цитокина после стимуляции или пролиферативной реакции спустя несколько лет после генотерапии. Более того, у некоторых пациентов продемонстрирован репертуар поликлональных T cell receptor (TCR) Vβ. ретроспективный анализ клеток периферической крови от 4-х пациентов из Миланской группы после генотерапии PBL спустя 10-12 лет после последнего введения выявил обнаружимые количества central memory CD8+ T клеток (CD8+CD45RA+CD62L+) и относительное увеличение T stem cell memory популяции (CD45RA+CD62L-CD95+) , предположительно ответственных за продолжающуюся генерацию и сохранение маркированных по гену T клеток. Эти находки подтвердили идею, что генотерапия Т клеток может использоваться в клинике для получения долговременного эффекта у пациентов в специфических обстоятельствах.^{27, 30, 31}

Последующие клинические испытания генотерапии для ADA-SCID были сконцентрированы на коррекции гематопоэтических предшественников (CD34+ HSCs) с использованием как gamma-ретровирусных, так и лентивирусных векторов для переноса откорректированных копий ADA кДНК.^{32, 33} Такая успешная генотерапия находится в состоянии, когда доступен лицензированный базирующийся на ретровирусе терапевтический продукт (Strimvelis®), при этом идущие сейчас клинические испытания с обеспечиваемой лентивирусной генотерапией обнаруживают многообещающие результаты.^{19, 34-36}

Ряд PIDs возникают преимущественно в результате дефектов в T клеточном компартменте, следовательно, коррекция популяции Т клеток может ослабить клинические проявления при ряде подобных нарушений, таких как дефицит CD40L, IPEX синдром (immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked), X-linked lymphoproliferative disease, CTLA4 дефицит и потеря функции STAT1 и мутации избыточности функции.

CD40 лиганд (CD154) экспрессируется на T клетках вследствие активации TCR и соединение CD40 с антиген-презентирующими клетками, включая макрофаги, приводит к активации макрофагов. Его главное взаимодействие с B клетками, где после распознавания антигена связывание приводит к пролиферации B клеток, к class switch рекомбинации, созреванию антител и генерации долговременной запомнившейся реакции. Дефицит CD40L является главной причиной, вызывающей X-сцепленный гипер-IgM синдром, при котором пациенты страдают от повторяющихся и условно-патогенных инфекций (Pneumocystis jiroveci и Cryptosporidia spp. в особенности), нейтропении, аутоиммунитета, болезней печени и повышенного риска злокачественных опухолей.³⁷ Низкие уровни IgG, A и E обнаруживаются в присутствии нормального или повышенного уровня IgM. Лечение заключается в co-trimoxazole профилактике, иммуноглобулины замещающей терапии и granulocyte colony-stimulating factor (GCSF), чтобы контролировать нейтропению, но HSCT в целом рассматриваются как лечебная. Недавние данные по HSCT сообщили об общем выживании в 78% саустя 5 лет после трансплантации при контрольном уровне в 58%.³⁸ Снова исход улучшался при использовании совпадающих sibling доноров и отсутствии повреждений органов перед HSCT.

Дефицит CD40L стал ранней мишенью для целенаправленного воздействия на T клетки генотерапии в попытке скорректировать гематопэтические предшественники, используя конституитивные промоторы, приводя к T клеточной лимфопролиферации на мышиных моделях.³⁹ Вскоре после этого для восстановления экспрессии в Т клетках использовали ретровирусы и лентивирусы, характеризующиеся вирусными длинными концевыми повторами (LTRs), чтобы управлять экспрессией CD40L, но усиление экспрессии не приводило к улучшению функции Т клеток.¹⁰ Декадой позднее Romero et al. описали успешную трансдукцию CD4+ T клеток с использованием само-инактивирующегося лентивирусного вектора с CD40L кДНК под транскрипционным контролем в 1.3 Kb участка CD40L эндогенного промотора. Трансдуцированные клетки CD4 пациентов демонстрировали почти физиологический паттерн экспрессии CD40L с повышенной экспрессией при активации и последующей редукцией.⁴⁰

Учитывая необходимость в точной экспрессии CD40L, появившаяся техника редактирования генов обеспечила такую точность; способность целенаправленно корректировать нативный CD40L локус д. обеспечить регуляцию откорректированного гена с помощью эндогенного промотора и др. регуляторных элементов. Hubbard et al. использовали transcription activator-like effector nuclease (TALEN) платформу, чтобы целенаправленно воздействовать на вышестоящую точку старта трансляции в экзоне 1 гена, создавая разрыв двойной нити, который будет репарироваться посредством гомологичной рекомбинации с корректирующей копией CD40L кДНК, присутствующей в adeno-associated virus (AAV).⁴¹ Величина редактирования достигает 35% в CD4+ T клетках пациента, которые экспрессируют правильно CD40L после активации T клеток и индуцируют class switch рекомбинацию в B клетках и генерируют IgG in vitro. Откорректированные T клетки стабильно приживляются у diabetic-severe combined immunodeficient (NOD-SCID) gamma (NSG) мышей, демонстрируя восстановление в селезенке CD4+ T клеток с физиологическим профилем экспрессии CD40L. Репертуар TCRVβ не обнаруживает отличий между отредактированными и не редактированными T клетками пациента. При предварительном анализе, не идентифицировано редактирования генов вне мишени. Область редактирования генов продолжает расширяться. После TALEN подхода стали использовать CRISPR/Cas9 систему для этой болезни как в отношении T клеток, так и HSCs. Отредактированные Т клетки пациентов демонстрируют нормальный паттерн экспрессии CD40L и восстановление функции.42 Геномное профилирование и Guide-seq анализ не выявили какой-либо активности вне мишени в K562 клетках. Хотя ни одна из этих стратегий не перенесена в клинику, осуществлена проверка концепции редактирования генов как подходящего лечения у данной группы пациентов.

Regulatory T cells (Treg) являются частью CD4+ T клеток, которые играют основную роль в иммунной модуляции и поддержании толерантности. У пациентов с синдромом IPEX ген, кодирующий в Treg клетках специфически транскрипционный фактор forkhead box P3 (FOXP3) разрушен, что приводит к системным угрожающим жизни поли-аутоиммунным проявлениям из-за дисфункции происходящих из тимуса CD4+FOXP3+ регуляторных Т клеток (tTreg).^{43, 44} Поскольку этот субнабор может присутствовать на периферии у пациентов IPEX в нормальном количестве, то дефектное функционирование FOXP3 приводит к нарушению в периферической само-толерантности и рассматривается как первая и непосредственная причина аутоиммунитета у IPEX пациентов.^{43, 45} Отличительной характеристикой болезни являются энтеропатии с тяжелой диареей, хронический дерматит и аутоиммунные эндокринопатии, обычно включая с ранним началом инсулин-зависимый сахарный диабет, тиреоидит и аутоиммунная цитопения.⁴⁶ Заболевание обнаруживается уже в неонатальный период и ведение их затруднено. Иммуносупрессия является основным лечением, часто требующим множественных подходов к терапии, включая стероиды, ингибиторы calcineurin, ингибиторы mycophenolate mofetil и mTOR.⁴⁶ HSCT могут быть использованы для лечения при вовлечении органов (OI)⁴⁷; наивысшие показатели OI связаны с плохими исходами. В серии их 58 пациентов, получавших HSCT общая выживаемость составляла 73% к 15 годам и были распространены осложнения, связанные с трансплантацией в виде токсичности, множественных инфекций и graft-versus-host disease (GVHD). 8 пациентов нуждались более чем в одной процедуре (пониженной интенсивности кондиционирование было использовано в 53% трансплантаций). Смешанный химеризм описан у 31 из 53 исследованных пациентов, при этом симптом возвращения был связан с низким уровнем химеризма. Однако, у некоторых пациентов со смешанным химеризмом, клетки Treg были на 100% донорского происхождения, демонстрируя присутствие преимуществ выживания в этой популяции и коррекции компартмента Treg, достаточной для контроля над болезнью.^{47, 48} Жизнеспособность пациентов, поддерживаемая с помощью однократной иммуносупрессии составляла 65% к 24 годам, но такой подход не предупреждал прогрессирование болезни или развитие повреждений органов.⁴⁷

Благодаря природе и функции гена, участвующего в патогенезе IPEX, его можно рассматривать как идеальную мишень для базирующейся на Т клетках иммунотерапии. Моногенная природа IPEX, ведущего к аутоиммунитету с одиночным дефектом в популяции клеток открывает путь для более прямого и прицельного терапевтического подхода. Поэтому исследования по adoptive Treg переносу были проведены без использования FoxP3mut (scurfy) мышиных моделей IPEX. Одно из первых исследований сконцентрировалось на патофизиологии синдрома IPEX и коррекции фенотипа scurfy мышей, моделирующих IPEX. Adoptive перенос дикого типа Treg клеток (CD4+CD25+) контролировал симптомы, тогда как перенос CD4+CD25- клеток, нет, подчеркивая важность и иммуно-регуляторную способность популяции Treg. Базируясь на этих результатах разные группы вызывали избыточную экспрессию FOXP3 в CD4+ T клеток от здоровых доноров, чтобы генерировать Tregs de novo посредством добавления гена с помощью лентивирусов.^{49, 50} Женские носительницы с одним мутантным аллелем FOXP3 обычно имели две разные популяции Treg (функциональный и не функциональный FOXP3); однако, они поддерживали полностью функцию Treg, это привело к предположению, что введенные аутологичные откорректированные клетки не должны конкурировать с дисфункциональными клетками.^{51, 52} Чтобы исследовать этот потенциал ex vivo-сгенерированные CD4+FOXP3+ Treg-подбные клетки, группа Stanford (Passerini et al.) изучала эту популяцию в условиях воспаления.⁵³

В отношении пластичности in vitro-сгенерированные Treg клетки обнаруживали риск потери супрессирующей способности in vivo, т.к. они превращались в эффекторные Т клетки. В частности, это составляет большую проблему при IPEX. Однако, продукция цитокинов (Th1 и Th2) остается низкой, а экспрессия FOXP3 стабильной после активации in vitro в условиях воспаления, это подтверждает, что CD4+FOXP3+ Treg клетки удерживают характеристики Treg. Авт. полагают, что стабильный регуляторный эффект происходящих реакций и подтверждают, что нативные сгенерированные CD4+FOXP3+ Treg клетки более стабильны и обладают более выраженной супрессирующей функцией по сравнению с memory CD4+FOXP3+ Treg, указывая на регуляторную функцию, осуществляемую независимо от антигена способом.^{54, 55}

Авт. также продемонстрировали мощную супрессирующую активность in vitro и in vivo, используя xenograft модель GVHD. Они индуцировали летальную GVHD в NSG или у предварительно кондиционированных NOD-SCID мышей с помощью инъекции аллогенных CD4+ T клеток. Совместная инъекция с CD4+FOXP3+ Treg клетками предупреждает развитие GVHD и приводит к выживанию 75% из всех животных. Интересно, что CD4+FOXP3+ Treg клетки, сгенерированные с помощью трансдукции нативных T клеток обнаруживают чрезвычайную стабильность экспрессии трансгена по сравнению с memory-происходящими CD4+FOXP3+ Treg клетками. Обнаруживается существенно сниженная пролиферативная способность T эффекторных клеток, а продукция цитокинов часто ассоциирует с пост-трансплантационной повторной инъекцией. Более того, Treg- подобные клетки были также способны экспрессировать FOXP3 в установившемся состоянии во время активного воспаления, при этом они сохраняют супрессирующую способность и обычный профиль секреции цитокинов.⁵³ Было установлено, что FOXP3-мутантные CD4+ T клетки могут эффективно трансдуцироваться с помощью двунаправленного лентивирусного вектора, управляемого конституитивным промотором (LV-EFIa-FOXP3) и успешно трансдуцировать CD4+FOXP3+ Treg клетки, приобретая фенотип, сравнимый с Treg клетками от здорового контроля. Остается большая проблема, действительно ли ген-модифицированные CD4+FOXP3+ Treg будут поддерживать in vivo постоянство и действительно ли эти клетки будут приводить к нежелательной генерализованной иммуносупрессии.^{52, 54} Група Paris исследовала слегка модифицированные scurfy мышиные модели, где использовали иммуносупрессию, чтобы позволить выживание мышей в результате восстановления с помощью переносимых Tregs. Они сходным образом использовали двунаправленнные лентивирусные векторы с FOXP3, управляемым с помощью EF1 промотором в CD4+ T клетках. Предварительные in vivo исследования показали сходный исход у мышей, получавших ген-модифицированные CD4+ T клетки по сравнению с мышами, получавшими дикого типа Tregs в отношении продолжительности выживания. Клинические оценки также показали улучшения со временем у тестируемых животных после начала болезни. Наиболее важным стало подтверждение устойчивой и стабильной экспрессии FOXP3 в способствующем воспалению контексте.⁵⁵

X-linked lymphoproliferative disease (XLP) возникает в результате мутаций в гене SH2D1A, кодирующем signalling lymphocytic activation molecule (SLAM)-associated protein (SAP), внутриклеточном адапторном белке, экспрессирующимся в T, NK и NKT клетках и являющимся критическим для нормальной иммунной функции. SAP служит в качестве молекулярного переключателя, позволяющего членам семейства SLAM действовать или как активирующие или репрессрующие рецепторы (в присутствии или отсутствии SAP, соотв.)^{56, 57} , действуя тем самым как ключевой регулятор зависимых от Т клеток реакций. Дефицит приводит к аномалиям клеточной токсичности NK, к возникновению клеток NKT и гуморального иммунитета посредством T follicular helper (TFH) к клеточной дисфункции. Клинически пациенты могут обнаруживать ряд проявлений, связанных с нарушениями регуляции иммунитета и цитотоксическими дефектами. До 50% пациентов демонстрируют ряд гуморальных иммунных аномалий от нарушений реакции на вакцину до генерализованной hypogammaglobulinaemia. Почти треть пациентов обнаруживает лимфомы, при этом более распространенные формы имеют абдоминальную B клеточную non-Hodgkin лимфому как у EBV+, так и EBV- пациентов.^{57, 58} Однако, haemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH) является наиболее распространенным и летальным проявлением, обнаруживающим тенденцию появляться в раннем детстве и ассоциировать со значительной летельностью.^{57, 59, 60} Общая смертность редуцируется существенно согласно первым сообщениям с 75% до 29%,⁵⁷ в основном в результате улучшения химиотерапии и протоколов HSCT, также как и улучшения мониторинга и поддерживающего лечения. Однако, диагностированные при рождении всё ещё сохраняют риск значительной смертности, несмотря на тщательный мониторинг. HSCT способствует лечению, но исход зависит от хорошо подобранного донора и контроля за болезнью во время трансплантации, при этом жизнеспособность падает приблизительно до 50% в контексте несовместимого донора и активного HLH.⁵⁷

Проверка концепции генотерапии впервые осуществлена Rivat et al. ⁶¹, использовавшими вторую генерацию лентивирусного вектора, содержащего эндогенный human elongation factor 1 alpha (EFS) промотор для управления экспрессии codon-optimised гена SAP. Мышиная модель SAP-/- была восстановлена посредством переноса откорректированного гена гематопоэтического промотора, что привело к восстановлению NK и к зависимой от CD8+ T клеток цитотоксичности, появлению NKT клеток вместе с формированием зародышевого центра и гуморальной функции после иммунологических проблем.

Хотя не обнаружено побочных эффектов от коституитивной экспрессии SAP в этих исследованиях, SAP тонко регулируется с помощью сигнального белка, которые не экспрессируется вовсе в гематопоэтическом клоне, включая стволовые клетки. Это может быть поэтому предпочтительным во избежание избыточной экспрессии SAP в клонах, где экспрессия ограничена. Дальнейшее исследование проводилось, чтобы оценить пригодность использования клон-специфических промоторов, включая эндогенный промотор SAP, чтобы управлять экспрессией в откорректированном лимфоидном компартменте (не опубл.). Хотя предварительные данные демонстрируют клональные ограничения экспрессии SAP в периферических компартментах, в целом функциональное восстановление гуморального иммунитета и цитотоксичности слабые.

Поэтому были сделаны попытки исследовать непосредственно зависимые от Т клеток клинические проявления XLP1, используя откорректированный по гену adoptive T клеточный перенос SAP-дефицитным мышам вместе с in vitro восстановлением функции Т клеток пациентов.⁶² При этом Panchal et al. продемонстрировали in vivo и in vitro, что коррекция гуморальных и цитотоксических дефектов у SAP-дефицитных модельных мышей достигается с помощью переноса откорректированных по SAP T лимфоцитов. Мы наблюдали полное восстановление функции гуморального иммунитета вследствие зависимо от от Т клеток антигенного вызова посредством образования герминальных центров и реакций специфических антител, отсутствующих у SAP-дефицитных животных. Функциональная коррекция T_FH клеток пациента in vitro также демонстрирует существенное улучшение IL-21 и профиля секреции иммуноглобулина, тогда как поддерживается профиль T_FH клеток с откорректированным геном от XLP1 пациентов, если они культивируются с IL-6, IL-7 и IL-21; цитокины, которые были выбраны, базируясь на их роли в дифференцировке и поддержании T_FH популяции клеток.^{62, 63} Мы выявили восстановление цитотоксичности после лентивирусами-обеспечиваемого переноса SAP гена у пациентов CD8+ CTLs, это может быть существенным для предупреждения и лечения HLH и лимфопролиферативных осложнений. Мы наблюдали функциональные улучшения цитотоксичности in vitro и in vivo в Epstein-Barr вирусом-инфицированных lymphoblastoid cell line (EBV-LCL) , модели лимфомы у NSG мышей. Ген-откорректированные линии пациентов CTLs оказались способными убивать EBV+ клетки мишени и индуцировать регрессию опухоли на том же самом уровне, что и у здоровых доноров CTLs. Итак, эти результаты подтверждают, что терапия T клетками может обеспечивать существенные клинические преимущества XLP1 пациентам как с клеточными, так и гуморальными аномалиями.

Долговременное сохранение аутологичных модифицированных по гену T клеток, а значит и продолжительный клинический успех, еще предстоит установить., Вместе с доказательствами персистенции модифицированных по гену T клеток из предыдущих клинических испытаний,²¹ теперь установлено, что специфические субнаборы T клеток способны поддерживать компартмент T клеток, а именно подобные стволовым клеткам memory T cells (TSCM) и central memory (TCM) клетки.⁶⁴ Panchal et al. сообщили о сохранении ген-откорректированных нативных клеток вместе с TSCM и TCM фенотипами после лентивирусной трансдукции и экспансии, подтверждая мнение, что SAP-откорректированные клетки пациента могут персистировать. И теперь это проверяется в клинических испытаниях.

HLH является угрожающим жизни нарушением, характеризующимся гипер-воспалением, как результат иммунной дисфункции и дисрегуляции. HLH может быть классифицирован как или вторичный, но обе формы приводят к тяжелым, системным воспалительным симптомам и повреждениям ткни из-за бесконтрольной активации и пролиферации лимфоцитов и антиген-презентирующих клеток с массивной избыточной продукцией цитокинов. 5 форм семейной HLH было охарактеризовано (генетические болезни, в которых HLH проявления предоминируют), HLH (FHL) 1-5 и все мутации идентифицированы (FHL 2-5 соотв.), затрагивают белки пути granule-mediated цитотоксичности. Несколько др. генетических болезней обнаруживают HLH в качестве общего проявления. Современное ведение сфокусировано на контроле процесса болезни с помощью тяжелой иммуносупрессии перед запуском HSCT , при которой исход варьирует.⁶⁵ недавно биологические агенты были испытаны и даже лицензированы для воздействия на HLH перед HSCT делая потенциально менее токсичной и более целенаправленной терапию. Аутологичными клетками T клеточная генотерапия исследуется при двух формах FHL, где она может обеспечить переход к окончательной терапии или предоставить долговременный эффект терапии, если сохраняется компартмент откорректированных по гену T клеток.

PRF1 кодирует perforin, белок, содержащийся внутри exocytic гранул, которые после контакта с клеткой мишенью высвобождаются в иммунологических синапсах. Perforin образует поры на поверхности этих клеток мишеней и позволяет проходить granzymes в цитоплазму, приводя к клеточной гибели путем инициации апоптических путей. Мутации в PRF1 объясняют боле 58% случаев FHL в зависимости от этической принадлежности.^{66, 67} Предыдущие работы показали, что защита от HLH и hypercytokinaemia может быть скорректирована с помощью adoptive переноса дикого типа CD8+ T клеток.⁶⁸

Параллельно с использованием стволовых клеток, Ghosh et al. продемонстрировали также, что трансплантации скорректированных по гену CD8+ T клеток приводят к исправлению цитотоксичности in vitro и in vivo.^{69, 70} Они использовали бицистронный гамма-ретровирусный вектор для трансдукции мышиных CD8+ T клеток у модельных мышей prf-/-. Цитокинами обеспечиваемая предварительная стимуляция мышиных prf-/- T клеток, необходима для эффективной трансдукции, она приводит к более дифференцированным CD8+ T клеткам, состоящими из T_CM и T_EM клеток. Однако, эффективное приживление и функциональное восстановление цитотоксичности in vitro наблюдается после внутривенного введения ген-откорректированных prf-/- CD8+ T клеток prf-/- мышам. IFN-γ высвобождение подвергшихся целевому воздействию CD8+ T клетками приводит к снижению уровней IFN-Y у мышей, подвергшихся обработке по сравнению с негативным контролем. Функциональная коррекция in vivo исследована на двух- моделях. При легочной карциноме у модельных мышей , экспрессирующих lymphocyte choriomeningitis virus (LCMV) GP33 эпитоп, ген-откорректированные CD8+ T клети были способны эффективно очищать от опухолевых клеток после инъекции prf-/- мышам , бросая вызов опухоли, тогда как животные, получающие mock-трансдуцированные клетки обнаруживали летальное прогрессирование опухоли. Наконец, в этом исследовании осуществляли перенос CD8+ T клеток модельным prf-/- LCMV, как известно, обнаруживающим клинический фенотип HLH у мышей после инфекции вирусом. Prf-/- мыши, которым трансплантировали откорректированные по гену CD8+ T клетки от prf-/- мышей, обладающих полной защитой от HLH фенотипа после инфекции LCMV. В то время как негативный контроль обнаруживал hypercytokinaemia с высоко поднятыми уровнями IFN-y, то наблюдались экспансия CD8+ , анемия, прогрессивная потеря веса с последующей низкой выживаемостью, то мыши, получавшие м модифицированным геном CD8 T клетки, обнаруживали сходное значительное улучшение клинических проявлений с меньшими нарушениями регуляции иммунитета, выявляемыми при гистопатологическом анализе, т.к мыши получали дикого типа CD8 T клетки. Эти данные были также дополнены с помощью коррекции дефектов цитотоксичности в выборках peripheraI bIood mononuclear ceII (PBMC) от perforin-дефицитного пациента, использующего клинически пригодный лентивирусный вектор, содержащий откорректированную PRF кДНК.⁷⁰

FHL3, который объясняет 30-40% случаев FHL, вызывается мутациями в гене UNC13D (кодирующем белок Munc13-4 ).⁶⁶ В цитотоксических CD8+ T и NK клетках, Munc13-4 способствует формированию perforin-содержащих секреторных гранул в эффекторных клетках перед слиянием с клеточных мембран в иммунологических синапсах. Мутации в гене нарушают секрецию цитолитических белков, таких как granzymes в клетки мишени, приводя в конечном счете к цитотоксическому дефекту с клинической картиной HLH.^{67, 71}

Исследования, проведенные в лаб. Cavazzana в Париже изучали эффективность переноса корректирующего гена в Т клетки от FHL3 пациентов.⁷² После сходной T клеточной генотерапии, как при дефиците perforin, проверка концепции продемонстрировала пригодность как in vitro, так и in vivo моделей для восстановления T клеточной цитотоксичности. Платформа лентивирусного вектора, псевдотипированного с помощью вируса кори H и F гликопротеинов (H/F-LV), была исследована и сравнена с более широко используемой вирусом везикулярного стоматита-G оболочки (VSV-G-LV), содержащего откорректированную копию человеческой Munc13-4 кДНК, чтобы убедиться в эффективности трансдукции в предварительно стимулированных клетках пациента перед adoptive переносом в мышиную модель лимфомы, индуцированную EBV на иммуно-дефицитном NSG фоне.

Более высокие уровни трансдукции были описаны в Т-клеточном компартменте, включающем популяцию TSCM клеток, используя H/F-LV по сравнению с VSV-G-LV, при этом наблюдались повышенные уровни Munc13-4 мРНК в массе трансдуцированных PBMCs. Способность к дегрануляции восстанавливалась у CD8+ T клеток, трансдуцированных Munc13-4-H/F-LV , что выявляется с помощью экспрессии CD107a после TCR стимуляции, и наблюдалась достоверная регрессия опухоли вливания откорректированных по гену Т клеток с использованием EBV-BLCL-xenografted NSG опухолевой модели, демонстрируя in vivo цитотоксичность со средней эффективностью трансдукции в 55%.⁷²

Dettmer et al. исследовали с использованием альтернативной, клинически подходящей платформы вектора для коррекции этой болезни. Они сравнили использование alpharetroviral вектора (происходящего из avian sarcoma leucosis) с gammaretroviral вектором (происходящего из вируса лейкемии мышей). Оба вектора обладали само-инактивацией (SIN) и содержали широко используемый промотора EFS driving кодон-оптимизирующий экспрессию трансгена UNC13D. Они продемонстрировали продукцию сравнимых титров обеими конструкциями; однако, alpha и gamma вирусы инфицировали только делящиеся клетки, поэтому клетки предварительно активировали, используя стандартный протокол активации Т клеток перед трансдукцией, при этом они обнаруживали высокую эффективность трансдукции (74% vs. 93% соотв.) в массе PBMCs от пациентов спустя 3 дня после трансдукции. В целом это приводило к восстановлению экспрессии белка Munc13-4 и к последующей способности дегрануляции Т клеток вместе с in vitro восстановлением EBV-специфической способности CTL цитотоксичности и к нормализованному высвобождению granzyme после CTL стимуляции. В целом оба alpha- и gammaretroviral векторы оказались клинически пригодными и были использованы для клеточной X-SCID и CAR-T терапии^{73, 74} , подтвердив пригодность этого подхода для генотерапии fHLH3 с помощью трансплантации.⁷⁵

Принимая во внимание потенциальные ограничения использования ретровирусных векторов, которые способны только эффективно трансдуцировать делящиеся клетки, исследование Takushi et al.⁷⁶ продемонстрировало лентивирусом-обеспечиваемое восстановление экспрессии Munc13-4 белка и восстановление функции полученных от пациентов T клеток (вместе с HSCs, полученными от эквивалентной Jinx мышиной модели). Имея протестированные разные промоторные элементы, включая мышиный MND вирусный промотор, SIN-LV, содержащий EFS промотор и кодон-оптимизированный трансген UNC13D трансдукция протекала более благоприятно в активированных Т клетках пациента и восстанавливалась дегрануляция in vitron. Цитотоксическая функция FHL3-трансдуцированных клеток оценивалась с использованием двойного протокола трансдукции, который включал трансдукцию популяции одиночных клеток мишеней как с помощью EFS-UNC13D, так и человеческой thrombopoietin (TPO) CAR конструкции. Эта стратегия была проверена на выборках от FLH3 пациентов, которые были EBV негативными, и осуществляли трансдукцию с помощью терапевтической EFS-UNC13D конструкции в результате восстанавливалась цитотоксичность, тогда как TPO CAR конструкция восстанавливала способность распознавать клетки, экспрессирующие thrombopoietin receptor (MPL). Посредством метода competitive repopulation группа установила, что дегрануляция достигает уровня дикого типа с 15% периферических дикого типа клетками в Jinx модели; следовательно, это пригодная мишень для Т клеточной генотерапии и для снижения воспаления перед HSCT.⁷⁶

Остается большой проблемой сбор аутологичных гипер-активированных Т клеток для модификации генов и повторного введения для достижения ремиссии HLH. Важно понять, действительно ли введенные Т клетки сохраняются и избегают истощения в долговременных исследованиях. Современные стратегии целенаправленных анти-цитокинов, таких как emapalumab и ruxolitinib, тогда как сохранение фракции Т клеток, может быть использовано в качестве дополнения для успешности сбора, уменьшения избыточного воспаления и активированных Т клеток. В большинстве генетических нарушений необходимый уровень приживления и коррекции всё ещё устанавливается и может быть определен только при клинических испытаниях. Однако, в исследованиях мышиной perforin модели, приживление в 10-20% восстанавливало функцию perforin или защищало донорские клетки от HLH.⁶⁸ Данные по HSCT подтвердили, что уровни ниже 20% могут защищать клетки и у людей.

TSCM cells are a population of T memory cells with long-term survival capacity accounting for 2-3% of the circulating T cell pool in humans.^{77, 78} They are defined by their expression of CD95 and IL2Rβ within a CD45RA+CD62L+ naive cell compartment and this population has been demonstrated to not only encompass a transcriptional profile of both naive and central memory cells, but is also sustained in a constant state of dynamic flux.^{64, 79, 80}

These cells then continue to display an enhanced proliferative capacity compared to other T cell subsets allowing for rapid proliferation and cellular turnover upon antigenic stimulation along with the capacity to reconstitute a complete spectrum of memory T cells, in both in vivo and in vitro systems.64, 80-82 For this reason, targeting of TSCM for gene modification is desirable as the population offers a potential reservoir of sustained and self-renewing memory T cells, increasing the longevity of a T cell gene therapy approach. Indeed, several studies have now shown persistence of gene?modified T cells over 10 years post infusion across a range of applications including EBV?specific T cells,⁸³ gene?modified CD4+ cells trialled for human immunodeficiency virus (HIV),⁸⁴ tyrosine kinase suicide gene therapy in haploidentical HSCT⁷⁸ and ADA?SCID gene therapy.²¹ Biasco et al. were able to track gene?modified T cells in peripheral blood from patients who had received gene?corrected PBLs for ADA?SCID up to 12 years post infusion and demonstrated that these CD45RA+CD62L+CD95+ IL2Rβ TSCM cells were functional with proliferative capacity. When compared to a population of patients who had received HSC-gene therapy, TSCM cells were more frequent in those receiving PBL?GT, thought to be due to a combination of in vitro enrichment during product manufacture and expansion and maintenance in vivo due to the lymphopenic environment in ADA-SCID. Oliveira et al. identified gene?marked suicide gene T cells up to 14 years post infusion and found that the phenotype of the infused cells positively correlated with early expansion and persistence, as did antigen exposure.⁷⁸ This evidence has led to the development of protocols capable of maintaining a TSCM or na?ve immunophenotype with the aim of improving persistence of modified T cells which could also be applied for T cell gene therapy for PIDs. This evidence has led to the development of protocols capable of maintaining (or even starting with) a TSCM or naive immunophenotype with the aim of improving persistence of modified T cells which could also be applied for T cell gene therapy for PIDs.⁸⁵

Adoptive therapy based on Treg cells has been translated into clinical trials only recently. Several studies have been conducted to investigate the immunotherapeutic potency of Treg cells in the context of solid organ transplantation (to avoid rejection) or HSCT (to prevent GVHD)^{.86, 87} The results of these trials indicated the feasibility as well as the safety and efficacy of the procedure in preventing rejection-related events post transplant without the use of immunosuppression.^{86, 87}

Only a few studies have been conducted to investigate Treg therapy in autoimmune diseases. In T1D, where studies were initially focused on a combination of HSCT and Treg therapy, a phase one trial demonstrated autologous infusion of ex vivo expanded polyclonal Treg cells was well tolerated, associated with sustained Treg longevity and long-term stable C peptide levels.⁹⁰ However, the metabolic outcome was non?suggestive due to the small patient number and is now continuing to a phase two trial.^{90, 91} Although, currently limited in the number of open trials, the results so far have paved the way for a broader application encompassing the use of in vitro expanded alloantigen presenting CD4+CD25+ Tregs for treatment post solid organ transplantation and the use of polyclonal Tregs in autoimmune disorders.^{90, 92} Correction of the Treg compartment may also have a place in future gene therapy approaches for PIDs where Treg correction is paramount, such as CTLA4 haploinsufficiency where there is strong Treg-mediated immune dysregulation leading to lymphoproliferation, autoimmune cytopaenias and lymphocytic infiltration in non-lymphoid organs.⁹³

Adoptive transfer of gene?modified T cells has been used for over two decades as an experimental treatment strategy for malignancy, infectious diseases and immune disorders with promising results in some conditions and a strong safety profile with over 500 years of patient follow-up.⁸⁵ Indeed, licensed CAR=T cell products are now globally available with the next generations already in development trial. T cell gene therapy may offer a therapeutic option for a number of immunodeficiencies where correction of the T cell compartment would ameliorate clinical phenotype but in vivo persistence of corrected cells remains a concern. We have learnt a great deal from previous studies and can now combine optimised manufacture protocols and novel gene-editing tools which could lead to a more sophisticated, efficacious and durable therapy applicable to a range of immune dysregulation disorders and primary immunodeficiencies.