Механизм функционирования CRISPR у бактерий удивительно прост (Fig. 1). Rhulf в бактерию проникает бактериофаг или плазмида, то части проникшей ДНК расщепляются с помощью Cas белков и вставляются в локус CRISPR, создавая “memory” последовательность [4]. Бактерии постоянно транскрибируют локус CRISPR, чтобы продуцировать мРНК, которая содержит все повторы CRISPR и спейсеры между ними. Этот транскрипт наз. pre-crispr-ribonucleic acid (pre-crRNA). Расщепление pre-crRNA с помощью Cas белка дает crispr-ribonucleic acids (crRNAs), каждая из которых содержит одиночный спейсер и одиночный повтор CRISPR [5].

Fig. 1 CRISPR/Cas9 function in bacteria. a Genetic material from a virus, phage, or plasmid enters the bacterium. b Short segments of genetic information from the invading agent are inserted into the CRISPR region interleaved with spacer segments. c crRNA segments consisting of CRISPR repeats and spacers are constitutively expressed in the bacterium. d Invading nucleic acid segments are recognized by crRNAs, leading to assembly of a cleavage complex containing the foreign DNA, crRNA, and Cas9 protein and resulting in cleavage of the invading DNA

Чтобы элиминировать проникшие патогены, сегменты crRNA высвобождаются в цитоплазму, где они распознают и связывают совпадающие последовательности ДНК или РНК. После обнаружения совпадений собирается комплекс расщепления, содержащий crRNA и последовательность ее мишени, Cas нуклеазы и небольшую РНК, наз. trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA). Этот комплекс расщепляет мишень в месте, соседствующем с последовательностью мишени для crRNA, называемым protospacer adjacent motif (PAM) (Fig. 1).

Cas белки от разных видов бактерий обеспечивают расщепление нуклеиновых кислот разными способами. Некоторые Cas белки, подобные Cas9, работают индивидуально, тогда как др. формируют комплексы расщепления, содержащие множественные Cas белки. Независимо от механизма расщепления CRISPR система действует подобно системе защиты микробов, целенаправленно действующей на ДНК и РНК проникших агентов для их деградации и элиминации.

В 2013, Dr. Feng Zhang из Massachusetts Institute of Technology впервые опубликовали базирующееся на CRISPR редактировании генов человека [6]. Работа базировалась на прорывном исследовании Emmanuelle Charpentier и Jennifer Doudna, которые идентифицировали ключевые элементы, необходимые для CRISPR-обусловленного расщепления [7]. Zhang и его группа выявили потенциал системы CRISPR вызывать высоко целенаправленные модификации генов человека и разработали метод экспрессии guide RNAs (эквивалентной crRNAs), tracrRNA и Cas9 расщепляющего белка в клетках человека [6].

Был разрешен один из ключевых вопросов, как репарировать разрезы. ДНК сайта мишени. В отсутствие вмешательства репарация расщепленных концов ДНК возникает благодаря non-homologous end joining (NHEJ) (Fig. 2). Это склонный к ошибкам процесс, часто приводит к инсерциям или делециям небольшого числа нуклеотидов (indels), и приводит часто к непредсказуемым изменениям в генных последовательностях. Как результат, ген мишень может или не может быть инактивированным после репарации. Zhang и его группа предположили, что внесение гомологичной репарирующей матрицы в клетки вместе с системой CRISPR, будет приводить расщепленные концы ДНК к репарации посредством homology-directed repair (HDR), зависимым от матрицы способом. Используя эту стратегию, Zhang с колл. оказались способны индуцировать разрезы и репарацию с помощью HDR в гомеобоксном гене EMX1 в клетках человека [6].

Fig. 2 Mechanisms of CRISPR/Cas9 gene editing. a A construct that expresses a crRNA segment and the Cas9 protein is introduced into the target cell. b The target DNA is bound by the crRNA and Cas9 complex. c A double-strand break is introduced at the target site by the Cas9 nuclease. d The free ends of the DNA are subsequently repaired by the cell’s DNA repair mechanisms, either through error-prone non-homologous end joining (NHEJ) or, with the addition of a homology template, through homology-directed repair (HDR)

Аккуратность редактирования является результатом строгой комплементарности между последовательностью guide РНК (crRNAs) и её мишенью, а также точностью разрезания Cas в сайте мишени [8, 9]. Кроме того, CRISPR обладает преимуществами простоты, которая нуждается в минимуме, только в функциональных наводящей последовательности crRNA, нуклеазе Cas9 (от Streptococcus pyogenes), и в tracrRNA [9, 10]. Усиление функциональности возможно при использовании CRISPR-ассоциированных нуклеаз от разных микроорганизмов, таких как Cas13 белок (от Leptotrichia shahii), который является РНК-специфической нуклеазой [8]. Cas белки могут быть также преобразованы для выполнения др. ферментативных функций, таких как метилирование ДНК и редактирование оснований. Эти модификации повысили потенциал системы CRISPR [11, 12]

Некоторые системы CRISPR были исследованы в клинических испытаниях [13]. Одним из наиболее интригующих приложений технологии CRISPR стала область инфекционных болезней. Незатратные и благонадежные CRISPR диагностические процедуры для вирусов бактерий разрабатываются, как и базирующаяся на CRISPR терапия с целью лечения многих трудных инфекций, включая hepatitis B virus (HBV), human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) и methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). В отличие от традиционных инструментов диагностики и терапии, система CRISPR может быть легко модифицирована и нацелена на новые патогены ил пути резистентности. Это мощный потенциальный инструмент против появляющихся вирусов, когда скорость разработки является наиважнейшей. CRISPR-базирующаяся терапия подвержена побочным явлениям, эффектам “off-target” и “on-target” и эти риски необходимо устранить из технологии CRISPR.

Базирующиеся на CRISPR системы предоставляют улучшение скорости и точности в детекции нуклеиновых кислот вирусов и бактерий [14, 15]. Две аналогичные диагностические системы, известные как DETECTR [16, 17] и SHERLOCK [18, 19], были разработаны, чтобы определять соотв. последовательности РНК и ДНК. На первой ступени вирусная или бактериальная последовательность амплифицируется из клинической выборки, используя recombinase polymerase amplification (RPA). Возникающая в результате ДНК затем смешивается с системой CRISPR/Cas, которая идентифицирует и разрезает интересующую последовательность. Cas эндонуклеаза, используемая в этой реакции, была преобразована, чтобы обладать активностью разрезания в целом только после того, как она активируется путем соединения со своей мишенью. Для RNA (DETECTR), это Cas12a ([16, 17] , тогда как для ДНК (SHERLOCK) это Cas13a ([18, 19]. После разрезания соотв. последовательности мишени Cas12a и Cas13a начинают без разбора разрезать др. ДНК или РНК в растворе. Поэтому, когда вносится подавляющая репортерная последовательность, то Cas12a или Cas13a будут разрезать репортерную последовательность, вызывая флюоресцентный сигнал. Однако, если последовательность мишени отсутствует в растворе, то Cas12a и Cas13a не будут активированы и репортерная последовательность остается подавленной.

SHERLOCK и DETECTR настолько чувствительны, что они способны обнаруживает единственную копию вируса. Более того, ферментативные реакции работают при 37 ^оC, и не нуждаются в дорогостоящих термоблоках для реакций. Они также быстро действуют лишь 1–2 ч. от начала до конца. Поэтому использование SHERLOCK и DETECTR важно в качестве полевого диагностического инструмента для вирусов, таких как Ebola, Zika и Dengue [15, 20]. Недавно было описано использование для диагностики SARS-CoV-2 метода DETECTR, с временем полного оборота в 45 мин. и с 95% позитивными и 100% негативными показателями по сравнению с PCR техникой [21].

CRISPR стратегии могут быть также использованы для облегчения детекции низко-частотных последовательностей в клинических выборках, таких как гены антимикробной резистентности путем улучшения чувствительности Next-Generation Sequencing (NGS). Стратегия Depletion of Abundant Sequences to Hybridization (DASH) использует pre-processing ступень, на которой мишени с высокой частотой, которые снижают чувствительность NGS, такие как гены митохондриальной рибосомальной РНК человека, расщепляются с помощью CRISPR/Cas9 [22]. После удаления этих высоко частотных мишеней, интересующие патогенные последовательности затем могут быть легко амплифицированы. Эта стратегия была использована для амплификации последовательностей грибов и паразитов в выборках спинно-мозговой жидкости с сильно увеличенной чувствительностью [22]. Альтернативная CRISPR-based стратегия, наз. FLASH (Finding Low Abundance Sequences by Hybridization), использует alkaline phosphatase, чтобы блокировать все последовательности в выборке. Система CRISPR/Cas затем используется для выявления интересующих частично переваренных последовательностей, которые связываются универсальными sequencing адаптерами и амплифицируются, при этом очень незначительная амплификация наблюдается для др. последовательностей в выборке [23]. FLASH-NGS было использовано для идентификации генов резистентности к антибиотикам в трахейных аспиратах от пациентов с Staphylococcus aureus пневмонией [23]. Этот подход обеспечивает 5000-кратное обогащение генов мишеней по сравнению с одним только NGS. Он был успешно использован для идентификации генов резистентности к малярии в выборках из сухих пятен крови [23]. И снова метод FLASH-NGS значительно превосходил только NGS.

Эти экстраординарьные техники быстро находят применения в клинических лаб. [21,22,23,24]. В отличие от CRISPR терапии, отсутствуют существенные риски для пациентов.

CRISPR-based therapies in the treatment of acute and chronic viral infections

Вирусные инфекции существуют в трех самостоятельных состояниях: lytic инфекция, латентная инфекция и хроническая инфекция. При литической инфекции вирусы активно реплицируются и продуцируют вирусное потомство или вирионы. После того как вирусный геном упаковывается в белковую оболочку или капсиду, они выспобожздаются посредством лизиса клетки, разрушая тем самым клетку хозяина [25]. Некоторые вирусы могут вызывать латентную инфекцию, при которой вирус входит в состояние покоя, при этом он может оставаться в нем годами. Многие важные патогены человека, включая Herpes Simplex 1 (HSV-1), Epstein–Barr virus (EBV), Cytomegalovirus (CMV), human herpesvirus 6 (HHV-6), Hepatitis B virus (HBV), polyomavirus и parvovirus, могут вызывать латентные инфекции [25, 26]. Наконец, хроническая инфекция представляет собой состояние непрерывной низко-уровневой репликации вируса, приводя к хроническим повреждениям органов. Хроническая инфекция типична для некоторых важных патогенов человека, включая HBV и HIV-1 [27]. Эти две инфекции вызывают огромную заболеваемость и смертность, при этом 250 миллионов человек во врем мире сегодня страдают от хронической HBV инфекции [28] и почти 40 миллионов от хронической HIV-1 инфекции [29].

При латентной и хронической вирусной инфекции вирусный геном сохраняетс бесконечно в клетке хозяине, будучи интегрированным в геном хозяина или в виде свободно плавающей вирусной минихромосомы. Как только вирус находит свое местоположение внутри клетки хозяина, на него очень затруднительно воздействовать. Однако, базирующиеся на CRISPR системы могут быть использованы для воздействия на вирусный геном внутри клетки хозяина, делая его неспособным к транскрипции и репликации (see below).

Существуют однако, логистические проблемы, которые необходимо преодолеть. Во-первых, система CRISPR д. быть доставлена в клетки мишени. Во-вторых, система д. аккуратно целенаправленно воздействовать на вирусный геном, который находится в постоянном состоянии эволюции; это особенно проблематично в случае с HIV-1, из-за его высокой скорости мутирования и существенного генетического разнообразия даже внутри одного хозяина [30]. В-третьих, д. существовать стратегия предупреждения повторной инфекции в только что “cured” клетках из др. резервуаров вируса в теле. Наконец, система не должна индуцировать непреднамеренные эффекты в “off-target” сайтах генома хозяина.

Несмотря на эти препятствия достигнут существенный прогресс в разработке CRISPR терапии для хронических вирусных инфекций. В одном исследовании система CRISPR/Cas9 была использована для нокдауна HBV в клеточной линии гепатоцитов человека и у мышей, моделирующих HBV [31]. Обнадеживает. что даже после 4-х недель непрерывной экспрессии CRISPR/Cas9 у модельных мышей, не было выявлено событий разрезания вне мишени. В др. исследовании использовали модифицированный “base editing” Cas9 белок для целенаправленного воздействия на HBV [32].Вместо разрезания ДНК в сайте мишени, Cas9 белок, редактирующий основания, индуцировал модификации нуклеотидов, приводя к возникновению нонсенс кодонов, которые останавливали трансляцию белка. Путем избегания индукции разрывов двойной никти, эта стратегия редактирования оснований снижала риск хромосомных перестроек в сайте мишени (с их потенциалом вызывать рак), а также ограничивала угрозу возникновения эффектов вне мишени.

HIV-1 является сложным и ускользающим вирусом, а его способность мутировать делает его устойчивым в большинству терапевтических вмешательств [33]. Однако, некоторые исследователи разработали систему CRISPR, которая может целенаправленно воздействовать на HIV-1 гены, интегрированные в ДНК хозяина, устраняя тем самым вирус in situ [33, 34]. В одном исследовании исследователи целенаправленно воздействовали на геном HIV-1 в линии T клеток человека, используя систему CRISPR и или одну guide RNA или две guide RNAs одновременно [33]. Использование single-guide RNA приводит к быстрому возникновению резистентности, но двойное целенаправленное воздействие двух guide RNAs вызывает полную супрессию репликации вирусов, без признаков избегания вирусов [33]. Более того, сохраняющаяся совместная экспрессия CRISPR/Cas9 системы в HIV-1-уничтоженных клетках предупреждает повторную инфекцию [35, 36]. Недавно система CRISPR/Cas9 была использована для уничтожения to eradicate HIV-1 в гумманизированных мышиных моделях болезни [37]. Не выявлено эффектов вне мишени после секвенирования более 100 предполагаемых сайтов вне мишени. Наконец, при ex vivo терапевтическом подходе была использована технология CRISPR/Cas9 , чтобы модифицировать CCR5 рецептор в CD4+ клетках зародышевой линии, делая их резистентными к de novo HIV инфекции [38]. Это открывает возможность лечения ex vivo пациентов HIV-1, у которых их собственные Т клетки извлекаются, амплифицируются вне тела с использованием CRISPR, и затем обратно вводятся пациенту с функционирующей HIV-1-резистентной иммунной системой [39, 40].

CRISPR/Cas9 системы были также использованы для уничтожения porcine endogenous retroviruses (PERVs) у свиней. PERVs которые интегрируются в геном свиней и это служит главным барьером для ксенотрансплантации (т.e., трансплантов органов свиньи в человеческим реципиентам). В попытке сделать органы свиньи свободными от PERV, были использованы CRISPR/Cas9 системы для элиминации PERVs из линий клеток свиней путем целенаправленного воздействия на высоко консервативный ген PERV polymerase. Это привело к 1000-кратному снижению груза PERV вирусов [16]. В последствии перенос ядер соматических клеток был использован для генерации свободных от PERV свиней, которые в принципе могут быть использованы для выращивания органов для ксентрансплантаций [18].

Ряд др. человеческих ДНК вирусов были подвергнуты целенаправленному воздействию с использованием CRISPR/Cas9 системы. Сюда входят herpes simplex virus-1 (HSV-1) [41, 42], Epstein Barr Virus (EBV) [14, 43, 44], human cytomegalovirus (CMV) [41], human papilloma virus (HPV) [45-47 и JC polyomavirus [48]. Однако, многие важные человеческие патогены, включая flaviviruses (Zika вирус, West Nile сирус, Yellow лихорадки и dengue), rotaviruses и coronaviruses (SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2) имеют РНК геном. Недавно две CRISPR системы были разработаны, которые нацелены на последовательности РНК. Одна такая система использует Cas9 белок, который имеет некоторое прирожденное сродство к РНК,и отдельный ДНК олигомер, содержащий PAM последовательность. PAM олигомер соединяется с последовательностью РНК мишени с прирожденной PAM последовательностью, формируя тем самым двунитчатую мишень, необходимую для Cas9 расщепления [4, 49]. Вторая РНК-модифицирующая CRISPR система использует семейство нацеленных на РНК нуклеаз, наз. Cas13 белками [5, 8, 50]. Такая стратегия была предложена в качестве терапевтического подхода для SARS-CoV-2, вируса, вызывающего Coronavirus 2019 (COVID-19) болезнь [51]. Эта концепция связана с внесением системы CRISPR/Cas13 в эпителиальные клетки воздушных путей, вместе с guide RNAs, нацеленных на replicase-transcriptase и гены белка шипов SARS-CoV-2 вируса, всё это под контролем ткане-специфического промотора. Доставка д. осуществляться посредством вдыхания аэрозоли с модифицированным адено-ассоциированным вирусом, не патогенным человеческим вирусом со сродством к эпителию воздушных путей [51]. Недавно эта стратегия была тестирована на эпителиальных клетках воздушных путей, где она успешно разрезала синтезированные фрагменты SARS-CoV-2 РНК [52]. Авт. отмечают, что стратегия это может быть использована, чтобы целенаправленно воздействовать на 90% известных короновирусов, используя только 6 guide РНК, нацеленных на консервативные последовательности. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, действительно ли эта стратегия эффективна против SARS-CoV-2 вирусов и действительно ли она безопасна для использования у пациентов.

Хотя CRISPR для COVID-19 вряд ли будет введена в клиническую практику во время современной пандемии, но она является многообещающим терапевтическим подходом, который может быть быстро использован для будущих вирусных эпидемий.

Традиционная вакцинация использует введение антигенов бактерий или вирусов хозяину, в результате генерируются специфическая реакция антител и/или целенаправленная реакция T клеток [53, 54]. Эти реакция являются специфическими для хозяина, однако, существует значительная вариабельность в количестве и качестве антител, продуцируемых у разных индивидов [53] Более того, некоторые вирусы, такие как HIV-1, генерируют только нейтрализующие антитела у небольшого количества индивидов, делая продукцию вакцины затруднительной.

Альтернативной стратегией является преобразование B клеток пациента, чтобы продуцировать нейтрализующие антитела. Используя CRISPR системы, человеческие B клетки были модифицированы, чтобы продуцировать HIV-1-специфические широкого спектра нейтрализующие антитела (bNAb), которые могут супрессировать HIV-1 вирусемию [55]. В недавнем исследовании, базирующееся на CRISPR разрезание и HDR были использовано редактирование локуса тяжелой цепи в активированных B клетках от человеческих пациентов, чтобы продуцировать bNAbs. Эти B клетки затем переносили мышам, где они продуцировали достаточные количества антител, чтобы вызвать невосприимчивость [55]. Такая стратегия, в принципе, может элиминировать межиндивидуальную изменчивость, ассоциированную с традиционной вакцинацией и может также быть использована, чтобы генерировать иммунитет против вирусов, таких как HIV-1, для которых традиционные вакцины неэффективны.

Хотя CRISPR системы развиты для бактерий, они могут быть также использованы для создания антибактериальной терапии, которые могут доставляться через клеточную стенку, используя бактериофаги, которые являются вирусами, инфицирующими бактерии. Естественно, бактериофаги ранее были использованы для лечения локальных инфекций кожи [56], а также для внтури-абдоминальных инфекций Acinetobacter baumanii [57] и для резистентного к лекарствам Staphylococcus aureus остеомиелита [58]. В этих случаях бактериофаги были отобраны из библиотек фагов скорее, чем искусственно преобразованы [59], однако, использование бактериофагов для доставки преобразованных терапевтических средств является областью, привлекающей все растущий интерес [60].

Бактериофаги, которые могут доставлять CRISPR системы к к патогенным бактериям, описаны для Staphylococcus aureus [61, 62] и Escherichia coli [63]. Мишени для расщепления системой CRISPR включают: (1) бактериальные факторы вирулентности (приводя к снижению вирулентности) [25, 26, 61]; (2) гены резистентности к антибиотикам (приводя к улучшению чувствительности к антибиотикам) [63]; и (3) гены, уникальные для бактериальных видов (приводя к высоко специфической гибели бактерий) [62]. В отличие от антибиотиков преобразованные бактериофаги д. гипотетически обладать чрезвычайно узким спектром действия, убивая интересующие бактерии, слхраняя непатогенные commensal бактерии. Эффектов вне мишени в клетке хозяине также не должно существовать, т.к. CRISPR конструкции транскрибируются только внутри бактерий.

Данные in vivo показывают, что CRISPR бактериофаги очень эффективны против бактерий мишеней [61, 62, 64]. Однако, результаты in vivo оказались более разнородными. Лечение инфекций кожи и мягких тканей у модельных животных было успешным [63, 64], но лечение Staphylococcus aureus остеомиелита у модельных крыс оказалось неудачным [64]. Это может быть результатом плохого проникновения бактериофагов в кость.

Принципиальными рисками при CRISPR терапии являются эффекты “вне мишени”, а именно, модификации ДНК и РНК в несоотв. места, и “on-target” эффекты, а именно, непреднамеренные модификации ДНК или РНК в сайте мишени.

Эффекты вне мишени возникают, когда существует частичная гомология между guide RNA(s) и вне мишени геномными последовательностями, что вызывает нежелательным модификации вдали от сайта мишени [65, 66]. Эти эффекты не всегда предсказуемы, т.к. они зависят не только от степенеи и расположения гомологичной последовательности, но и также от структуры gRNA. Чтобы компенсировать это в дальнейшем, единственный способ идентифицировать все эффекты вне мишени с помощью секвенирования всего генома [67]. Разработан ряд стратегий, чтобы снизить эффекты вне мишени. Сюда входят тщательный отбор последовательности gRNA, чтобы минимизировать гомологию, а также использование укороченной или 5' guanine capped gRNAs, которая обеспечивает более высокую специфичность [68, 69]. Преобразованные Cas нуклеазы с повышенной расщепляющей специфичность также могут ограничивать эффекты вне мишени [70, 71]. Наконец, использование парных Cas нуклеаз, которые разрезают только одну нить ДНК, тем самым нуждаются в связывании двух последовательностей gRNA с противоположными нитями ДНК в тесной близи, тем самым существенно улучшается специфичность связывания [72].

Нежелательные эффекты в мишени представлены неподходящими модификациями последовательности в сайте мишени. Сюда входят инсерции и делеции пар оснований, а также инверсии и рекомбинации [73, 74]. Эффекты в мишенях в основном связаны с генетическими преобразованиями, когда они снижают эффективность и потенциально повреждения гена мишени, но меньше касаются, когда мишенями являются патогенные последовательности. Однако, их нельзя игнорировать, учитывая риск рекомбинационных событий, таких как события между интегрированной последовательностью вируса и генома хозяина. Стратегии по снижению эффектов в мишенях включают использование модифицированных Cas9 нуклеаз, которые увеличивают частоту гомологичной репарации, и оптимизация матрицы для гомологичной репарации, а также подавление негомологичного соединения концов с помощью использования ингибиторов пути NHEJ [75].

CRISPR системы уже проходят фазу 1 испытаний на пациентах. Большинство из этих испытаний использует ex vivo CRISPR терапию, в том смысле, что клетки пациентов (или донорские клетки) собираются, модифицируются в лаб. и затем обратно вводятся пациенту. В 2019 группа из Китая сообщила об успешной трансплантации костного мозга HIV-1-позитивным пациентам с острой лимфоцитарной лейкемией, от которых клетки гематопоэтических предшественников были лишены CCR5, используя CRISPR с целью предупреждения инфекции HIV [76]. Устранение CCR5 было подтверждено процентом Т клеток пациента после приживления трансплантата и с помощью полного секвенирования генома, продемонстрировавших отсутствие эффектов вне мишени. Др. небольшое испытание фазы 1 включало 3-х пациентов с неподдающимся лечению раком (двое с продвинутой миеломой и один с липосаркомой), чьи Т клетки собирали, модифицировали с использованием CRISPR системы, чтобы вызвать экспрессию Т клеточных рецепторов, специфичных для NY-ESO-1 опухолевого антигена, и затем их обратно вводили пациентам [13]. Экспрессия преобразованных T клеток была подтверждена у всех 3-х пациентов, по крайней мере, спустя 100 дней. Спустя 9 мес. два пациента оставались живыми и один помер. Хромосомные транслокации были идентифицированы во всех 3-х популяциях преобразованных T клеток; но они, по-видимому, не получили преимуществ в росте.

Первое испытание in vivo CRISPR генотерапии на пациентах начались в начале 2020. В исследовании пациентов детей с врожденными нарушениями сетчатки, под названием Leber congenital aumaurosis была применена базирующаяся на CRISPR терапевтическая система, которая должна была корректировать мутации одиночных пар оснований, вызывающих болезнь и она доставлялась в сетчатку посредством локальных инъекций с помощью преобразованных аденовирусных векторов [77]. Результаты исследования всё ещё ожидаются.

The discovery of CRISPR repeats in bacteria was initially considered of minor importance outside the field of microbiology. However, CRISPR technology has emerged as a landmark discovery in the field of genetic engineering and is poised to have a major impact in many areas of clinical medicine. In this review, we have outlined potential applications for CRISPR technology in infectious diseases, including the development of rapid, low-cost diagnostics, the treatment of acute and chronic viral infections, and the treatment of resistant bacterial infections. CRISPR-based diagnostics and therapeutics will likely appear in clinical practice in the near future, and clinicians should be aware of their extraordinary potential, as well as their potential risks.