Посещений:
печеночные болезни



Новые векторы и подходы к генотерапии

Novel vectors and approaches for gene therapy in liver diseases
Sheila Maestro, Nicholas D.Weber, NereaZabaleta et al.
https://doi.org/10.1016/j.jhepr.2021.100300

Abbreviations

AAT a1-antitrypsin AHP acute hepatic porphyrias AIP acute intermittent porphyria AAV adeno-associated virus Ad adenovirus ASGCT American Society of Gene and Cell Therapy ALAS1 aminolevulic synthase 1 APCs antigen-presenting cells ASOs antisense oligonucleotides apoB/E apolipoprotein B/E ASGPR asialoglycoprotein receptor CRISPR clustered regularly interspaced short palindromic repeats CN Crigel-Najjar CRISPR/Cas9 CRISPR associated protein 9 CBS cystathionine Я-synthase dCas9 dead Cas9 DSBs double-strand breaks ERT enzyme replacement therapy FH familial hypercholesterolemia FSP27 fat-specific protein 27 GalNAc N-acetyl-D-galactosamine GT gene therapy GSD1a glycogen storage disorder 1a GO glycolate oxidase GUSB β-glucuronidase HDAd helper-dependent adenovirus HemA/B haemophilia A/B HT hereditary tyrosinemia HDR homology-directed repair IDS iduronate 2-sulfatase IDUA a-L-iduronidase IMLD inherited metabolic liver diseases ITR inverted terminal repetition LDH lactate dehydrogenase LV lentivirus LNP Lipid nanoparticles lncRNA long non-coding RNA LTR long terminal repeat LDLR low-density lipoprotein receptor MMA methylmalonic acidemia miRNAs microRNAs MPR metabolic pathway reprograming MPS mucopolysaccharidosis MPS type I MPSI MPS type VII MPSVII NASH non-alcoholic steatohepatitis NHEJ non-homologous end joining NHPs non-human primates OLT orthotopic liver transplantation OTC ornithine transcarbamylase PKU phenylketonuria PB piggyBac PEG polyethylene glycol PEI polyethyleneimine PH1 Primary hyperoxaluria type 1 PFIC3 progressive familial cholestasis type 3 PA propionic acidemia PCSK9 proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 RV retrovirus SB Sleeping Beauty siRNA small-interfering RNA S/MAR scaffold matrix attachment regions STK25 serine/threonine protein kinase 25 SRT substrate reduction therapy TALEN transcription activator-like effector nucleases TTR transthyretin UCD urea cycle disorders VLDLR very-low-density lipoprotein receptor WD Wilson’s disease ZFN zinc finger nucleases
The liver is a very attractive organ for gene therapy because of its role in many essential metabolic functions, the natural hepatic tropism of many gene therapy vectors, and its capacity to act as a protein factory for distribution to the whole body. • In this rapidly advancing field, an extended toolbox has become available for liver-directed gene delivery, including non-viral and viral vectors with high transduction capacity and specificity for hepatocytes. • The use of RNA-mediated gene silencing and AAV-mediated gene delivery is transforming the potential therapeutic options for patients with inherited metabolic liver diseases. • The combination of genome editing with viral and non-viral vectors is a powerful approach that may potentially represent a curative solution to many inherited disorders. • The management of liver toxicity caused by the induction of an inflammatory response to gene transfer vectors is essential. • New strategies to circumvent the inhibitory action of humoral and cellular immune responses against gene therapy vectors are under development, and their clinical testing will occur in the near future.
Согласно последнему определению American Society of Gene and Cell Therapy (ASGCT) в 2019, генотерапия (GT) является "внесением, удалением или заменой в содержимом генетического кода личности с целью воздействия или лечения болезни".1 (Fig. 1). Fig. 1. Gene therapy strategies currently being used for the treatment of liver diseases can be divided into 3 main categories.
Репарация генов связана с коррекцией существующих мутаций для восстановления экспрессии исправленной версии белка. Добавление (или дополнение) является простой доставкой исправленного гена, экспрессирующего отсутствующий или дефектный белок. Замалчивание гена требует элиминации или снижения экспрессии белка, чтобы уменьшить токсические метаболиты.
Однако, GT страдает от важных недостатков, включая неожиданную гибель юного пациента во время клинических испытаний лечения дефицита ornithine transcarbamylase (OTC) и возникновение лейкемии у некоторых пациентов с тяжелым комбинированным иммунодефицитом при лечении гематопоэтическими стволовыми клетками с использование ретровирусных векторов.4,5 В последние 5 лет разработано несколько GT продуктов: antisense oligonucleotides (ASOs: Mipomersen, Nusinersen, Etaplirsen, Golodirsen), RNA interference (Patisiran, Givosiran, Lumasiran), lentiviral-transduced cells (Autologous CD34+ cells transduced with a lentiviral vector containing the human ADA gene, Axicabtagene Ciloleucel, Tisagenlecleucel, brexucabtagene autoleucel) или recombinant adeno-associated viral (AAV) векторы (Alipogene tiparvovec, voretigene neparvovec-rzyl, Onasemnogene abeparvovec).[6-8]
При ex vivo GT, клетки пациента выделяют, культивируют, размножают и модифицируют и c помощью определенного вектора вводят обратно пациенту. При in vivo GT, терапевтический агент вводится непосредственно пациенту с использованием системного или локального воздействия (Fig. 2). I

Fig. 2. Gene therapy strategies.

Печень является критическим органом для большинства метаболических путей и является источником многих наследственных метаболических болезней (IMLDs). Обычная enzyme replacement therapy (ERT) доступна лишь для ограниченного числа IMLDs и единственным радикальным средством является orthotopic liver transplantation (OLT), которая ограничивается доступностью органа донора и требует в течение всей жизни иммуносупрессии. Далее, substrate reduction therapy (SRT) или metabolic pathway reprograming (MPR) являются привлекательными стратегиями для некоторых метаболических нарушений с накоплением токсических метаболических продуктов.12,13 Обнаруживает преимущества и технология small-interfering RNA (siRNA) или мишень-специфического редактирования генов с целью подавления ключевых метаболических энзимов, и новые молекулярные подходы, такие как следующего поколения подходы SRT или MPR, находящиеся в разработке.12,13
Печень является факторией белка, секретирующей большинство из огромного количества белков, присутствующих в кровообращении. Печень является потенциальным биореактором для продукции рекомбинантных белков.14 Поэтому базирующиеся на GT лечение используется при наследственной кровоточивости, такой как haemophilia A (HemA) или B (HemB), а также ERT-лечения болезней лизосомного накопления.15,16
Существуют два крупных семейства векторов: вирусные и не вирусные. Большинство не вирусных векторов состоит из полимерных или липидных частиц, которые упаковывают и защищают генетический материал внутри и облегчают его проникновение в клетки. (Fig. 3).

Fig. 3. Non-viral and viral vectors used most frequently in liver-directed gene therapy.

Administration of naked genetic material


Эта стратегия характеризуется очень низкой эффективностью проникновения в клетки. Одним из методов является гидродинамическая инъекция относительно большого объема раствора, это вызывает очень высокое венозное давление в печени и облегчает проникновение генетического материала в гепатоциты.17,19 Хотя гидродинамические инъекции трудно использовать у людей, внутрисосудистые гидродинамические процедуры с частичной катетеризацией используются с успехом у крупных животных, таких как свиньи, овцы и не человеко-образные приматы (NHPs).19,20
Введение голой ДНК может быть усилено с помощью нескольких технологических методов, таких как электропортация или ультразвук. Электропортация ДНК в печень крыс впервые была проведена в 1996.21 Недавно электропортация была применена для экспрессии α1-antitrypsin (AAT) у AAT-дефицитных мышей, что привело к уменьшению легочной эмфиземы.22 Воздействие ультразвука через кожу было эффективно опробовано для доставки генетического материала в печень мышей и свиней.23,24
Однако, главным препятствием к использованию голой ДНК является быстрая потеря экспрессии трансгена из-за потери генетического материала делящимися клетками или эпигенетического замалчивания. Предложено использование стабилизирующих последовательностей, транспозонов и эндонуклеаз для редактирования генов (Fig. 4).

Fig. 4. . Examples of several strategies that have advanced the field of gene therapy.

Administration of naked genetic material


Голая плазмидная ДНК, плазмидная ДНК, содержащая S/MAR последовательность, транспозоны и нуклеазы для редактирования генов (напр. CRISPR/Cas9). dsDNA, double-stranded DNA; S/MAR, scaffold matrix attachment regions; ssDNA, single-stranded DNA; ssRNA, single-stranded RNA.
Использование стабилизирующей последовательности является потенциальным выходом. Scaffold matrix attachment regions (S/MAR) являются геномными последовательностями ДНК, которые соединяют хроматин с ядерным матриксом во время интерфазы и участвуют в репликации и транскрипции ДНК.25 DNA векторы, содержащие последовательности S/MAR могут обеспечивать постоянную митотическую стабильность в делящихся клетках и избегают эпигенетического замалчивания, обеспечивая тем самым устойчивую экспрессию трансгенов. Несмотря на первоначальный успех этой стратегии в достижении устойчиво2й экспрессии трансгена в печени мышей и свиней,14,26 S/MAR ещё не дошли до клинических испытаний.
Открытые Barbara McClintock в 1940s,27 транспозоны являются последовательностями ДНК, которые перемещаются с одного места в др. в геноме. Последовательности транспозонов фланкированы terminal inverted repeats (TIRs), которые распознаются и вырезаются ферментом transposase, делая возможной их перемещение в др. место генома. Система транспозонов была модифицирована, чтобы они интегрировали терапевтические последовательности в геноме хозяина.28 На сегодня наиболее обещающими транспозоны для GT происходят из Sleeping Beauty (SB) или piggyBac (PB) систем.[29-32] Система SB транспозонов, как было установлено, эффективна на мышах, моделирующих дефицит HemA, HemB, AAT, дефицит β-glucuronidase (GUSB) (mucopolysaccharidosis (MPS) type VII, MPSVII), дефицит α-L-iduronidase (IDUA) (MPS type I, MPSI), и при наследственной tyrosinemia (HT).29,30 Недавно доставка SB транспозонов с помощью гидродинамических инъекций в печень собак привела к высоким уровням активности IDUA и GUSB в кровообращении. PB транспозоном обеспечиваемая доставка factor VIII- или factor IX-кодирующей комплементарной ДНК в мышиных моделях HemA и HemB приводила к стабильной экспрессии в кровообращении факторов каогуляции.31,32 необходимо тщательно оценить потенциальный риск инсерционного мутагенеза.
Три основных платформы используются для редактирования генов: zinc finger nucleases (ZFN), transcription activator-like effector nucleases (TALEN) и clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9).33 Сегодня проводятся два клинических испытания с использованием ZFN редактирования генов для лечения MPSI и MPSII на базе интеграции терапевтического гена в локус albumin гепатоцитов.34,35 Однако, CRISPR/Cas9 является предпочтительным выбором для редактирования генов.[36-39] Несколько клинических испытаний используют CRISPR/Cas9 , но большинство из них базируется на редактировании генов ex vivo для лечения рака и очень немногие для воздействия на генетические болезни. На пре-клинической ст. использования CRISPR/Cas9 целенаправленное воздействие на печень осуществляли при HemA и HemB посредством целенаправленной интеграции терапевтического гена и при glycogen storage disorder 1a (GSD1a) и дефиците AAT за счет прецизионной коррекции генных мутаций.38 Редактирование генов может быть также использовано в качестве MPR или SRT стратегии, как это было осуществлено при лечении familiar hypercholesterolemia (FH), primary hyperoxaluria type 1 (PH1) и tyrosinemia путем элиминации экспрессии proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9), glycolate oxidase (GO)/lactate dehydrogenase (LDH) и hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPD), соотв.[39-41]

Chemically modified siRNA and antisense oligonucleotides


Некоторые IMLDs приводят к накоплению токсических метаболитов. Пациенты с такими нарушениями могут получить облегчение посредством SRT или MPR, для которых siRNA или ASOs могут служить в качестве инструментов. Конъюгаты N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc) и siRNAs были использован для in vivo целенаправленного воздействия на гепатоциты, благодаря специфическому связыванию asialoglycoprotein receptor (ASGPR).42,43 Одной из наиболее продвинутых терапий является использование GalNac-siRNA, целенаправленно воздействующих на мРНК aminolevulic synthase 1 (ALAS1) для лечения острой печеночной порфирии (AHPs).44 ALAS1 является первым энзимом пути синтеза гема, а его подавление снижает накопление токсических метаболитов и количество атак острой порфирии. Та же самая стратегия была использована для лечения пациентов с PH1, с пониженными уровнями oxalate в моче на 75%. Продукты, Givosiran и Lumasiran были недавно одобрены FDA.44,45 GalNAc-модифицированные siRNAs также были разработаны для лечения hyperlipidaemias, хронической HBV инфекции, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), GSD1a и наследственного haemochromatosis.42,43
Химически модифицированные ASO уже были одобрены FDA для лечения гомозиготного FH (Mipomersen). Мишенями для Mipormersen является мРНК apolipoprotein B (APOB), он снижает в крообращении уровни холестерина.46 GalNAc-модифицированные ASOs разрабатываются для лечения NASH путем целенаправленного воздействия на экспрессию serine/threonine protein kinase 25 (STK25) или fat-specific protein 27 (FSP27). Они также были разработаны для подавления репликации HBV.47 Интересно, что ASOs, как было установлено, являются многообещающими инструментами для модуляции экспрессии long non-coding RNAs (lncRNAs), которые, как было установлено, играют важную роль при разных патологиях печени. 48

Polycationic and lipid nanoparticles


Катионовые полимеры формируют наночастицы с нуклеиновыми кислотами посредством электростатических взаимодействий, делающих возможным транспорт нуклеиновых частот в клетки. Одним из наиболее часто используемых является polyethylenimine (PEI), которые может обеспечивать высокую эффективность трансдукции.49 Более того, использование galactosylated PEI для целенаправленного воздействия на ASGPR является очень эффективным в трансдукции линии печеночных клеток человека, печени мышей и крыс. PEI наночастицы и производные были использованы экспериментально для доставки разных лекарств, включая siRNA и microRNAs (miRNAs), для лечения злокачественных новообразований в печени, но клинических испытаний пока не проводилось.50
Липидные наночастицы (LNPs) очень сходны по составу с клеточными мембранами. Они формируются с помощью amphiphilic липидов, которые спонтанно диспергируют в жидком окружении, образуя сферические структуры с гидрофильным содержимым. LNPs пригодны в качестве переносчиков нуклеиновых кислот благодаря чрезвычайной биосовместимости, биодеградации, низкой токсичности и иммуногенности, структурной гибкости и легкости крупно-масштабного приготовления. Использование LNPs было использования для восстановления для GT в качестве устройств для siRNA и mRNAs.51
Однако, основным препятствием при разработке базирующейся на LNP генотерапии является обнаружение эффективных, ткане-специфичных стратегий доставки.52 Традиционно целенаправленное воздействие достигается физической или химической конъюгацией лигандов со специфическими рецепторами на поверхности наночастиц. Целевой подход был разработан путем связывания мультивалентного GalNAc-кластера с LNP. Такие наночастицы, как было установлено, пригодны для доставки молекул мРНК в гепатоциты с высокой эффективностью, исправлением мышиной модели генетических болезней, таких как methylmalonic acidemia (MMA), PH1, GSD1a, citrin deficiency, acute intermittent porphyria (AIP), maple syrup urine disease, arginase deficiency, OTC deficiency, and progressive familial cholestasis type 3 (PFIC3).[53-59] Продолжительность действия одной дозы mRNA-LNP составляет 2-3 недели, необходимо повторное применение для пролонгации лечебного эффекта. Эти обнадеживающие результаты получены при клиническом испытании фазы I/II в отношении лечения MMA (Table 1).

Table 1. Liver-targeted gene therapy clinical trials.
Интересный случай целенаправленного воздействия на печень с использованием LNPs это Onpattro, LNP, состоящий из способного к ионизации катионового липида, фосфолипида, холестерола и polyethylene glycol (PEG)-липида, несущего siRNA, нацеленную на transthyretin (TTR), для лечения TTR-обусловленного амилоидоза.60 Этот LNP покрыт apolipoprotein E (ApoE) хозяина, которые запускает его транспорт в гепатоциты посредством low-density lipoprotein рецептором (LDLR)-обусловленного эндоцитоза. Воздействие супрессирует отложение амилоидных фибрилл и разрешено в качестве первого siRNA лекарства (patisiran) FDA в 2018 для лечения TTR-типа семейной амилоидной полинейропатии.61 Сходная стратегия находится на клиническом испытании по лечению повышенного LDL-cholesterol и hypercholesterolemia с помощью использования siRNA-LNPs, нацеленных на PCSK9 и ApoB, соотв.62 siRNA-содержащие LNPs также были использованы для лечения hepatocellular carcinoma (HCC) и хронического вирусного гепатита. siRNAs, нацеленные на онкоген MYC и polo-like kinase-1 (PLK1) , были тестированы в фазе I/II клинических испытаний и хорошо переносились, вызывая ограниченный противоопухолевый эффект.63 Недавно была закончена фаза II клинического испытания на базе подавления репликации HBV с использованием LNPs, содержащих 3 химически модифицированные siRNAs, которые подавляли экспрессию антигена HBV и его репликацию в пре-клинической модели HBV инфекции.64
Кроме того, LNPs теперь используются для доставки молекул отредактированных генов, таких как ZFNs и Cas9 мРНК вместе с single guide (sg)RNA. mRNA, кодирующие ZFNs превращенные в LNP, вызывали более 90% нокаута экспрессии генов у мышей путем целенаправленного воздействия на гены TTR или PCSK9 для лечения TTR амилоидоза и FH, соотв.65 Важно, что LNPs были также использованы для доставки ZFNs вместе с вирусным вектором, несущим лишенную промотора последовательность ДНК, способную к гомологичной рекомбинации, что приводит в результате к высоким уровням интегрированных последовательностей.34,35 Эта стратегия была использована для лечения MPS I и II (Table 1).

Viral vectors


Чтобы создать вирусный вектор для GT, вирусные гены нуждаются в репликации а те, что вызывают патологию, обычно удаляются вирусного генома и замещаются генетической последовательностью, которую нужно доставить. Поддержание способности к репликации вируса является обязательным для некоторых приложений, таких как для oncolytic или убивающих опухолевые клетки вирусы. Вирусные векторы, которые были использованы для целенаправленного воздействия в основном включали векторы, базирующиеся на AAVs, аденовирусах (Ads), ретровирусах (RVs) и лентивирусах (LVs) (Fig. 3).[9-11]

Vectors based on AAVs


Геном AAV записан на одной нити ДНК в 4.7 kb, который содержит 2 гена, rep (кодирующий белок, участвующий в репликации) и cap (кодирующий вирусную капсиду). Фланговые концы генома являются inverted terminal repeats (ITRs), уложенными в вилко-подобную вторичную структуру, содержащую последовательности инициации репликации и её окончания и сигнал укладки. AAVs обладают некоторыми характеристиками, которые делают их идеальными векторами для GT: дефект репликации, не существует патологии у человека, вызываемой этой инфекцией и потребность в сопутствующей инфекции с др. вирусом, таким как аденовирус для завершения его жизненного цикла. В отсутствие одновременной ко-инфекции др. вирусом, геном AAV интегрируется в хромосому 19, в т.наз. AAV локус, где он остается в дремлющем состоянии.66
Чтобы получить рекомбинантные AAV (rAAV) векторы, гены rep и cap удаляются из вирусного генома и замещаются терапевтической последовательностью с единственным ITRs.66,67 Во время процесса получения rAAV, оба гена rep и cap переводятся в транс-положение. Отсутствие rep приводит вирус к потере способности интегрироваться и находясь внутри ядра вирусный геном остается в основном эписомным, это снижает риск инсерционного мутагенеза. Более того, используя разные cap гены, или естественно возникшие или созданные искусственно, можно получить AAV капсиды с разными свойствами в терминах их серо-реактивности (serotypes) и тропизма к разным тканям или типам клеток. Особенно важны для животных моделей AAVs, едва индуцирующие какую-либо иммунную реакцию, это заставляет инфекцию протекать незамеченной и трансдуцировать клетки к, оставляя невредимую и длительную экспрессию терапевтического трансгена. rAAVs могут эффективно трансдуцировать покоящиеся клетки, такие как гепатоциты.68 Однако, у пациентов после использования rAAV происходит активация Т-клеточного иммунного ответа против капсидного белка, это требует применения стероидов, чтобы избегать элиминации трансдуцированных гепатоцитов.69
AAV векторы почти всех серотипов накапливаются в печени вследствие внутривенного введения из-за их естественного тропизма к печени.68 Однако, степень накопления векторных частиц не обязательно коррелирует с уровнем экспрессии трансгена.70 Более того, печеночный тропизм каждого серотипа отличается в зависимости от вида и эффективности трансдукции, наблюдаемой на модельных мышах, что не всегда также происходит на др. видах. Фактически, исследования предпринятые на NHP и на печени гуманизированных мышей выявили важные отличия в эффективности трансдукции у разных AAV серотипов между людьми и NHP и мышиными гепатоцитами.71 Чтобы идентифицировать новые капсиды с повышенной способностью трансдуцировать печень человека, используют разные стратегии по преобразованию вирусных капсид. Простейшая, это использование прикрепляющихся лигандов, которые, как известно, вирусные капсиды соединяются со специфическими рецепторами, присутствющими на поверхности гепатоцитов.71,72 Химическое соединение GalNAc лигандов с лизиновыми остатками на поверхности AAV капсид, как было установлено, усиливает связывание AAV с гепатоцитами.72
AAV варианты капсид также могут быть созданы посредством библиотеки капсид, содержащих случайные модификации.73,74 Для этого метода капсидные библиотеки, могут быть созданы с помощью инсерций случайных пептидов в специфических доменах капсиды или путем перетасовывания капсид. Использование "humanised" мышиных моделей является предпочтительным для оптимизированных AAV векторов для целенаправленного воздействия на печень человека, хотя пока не изучены реакции человека хозяина на AAV. Такая система скрининга привела к созданию AAV-LK03,75 варианта с улучшенным in vivo тропизмом к гепатоцитам человека, который теперь тестируется в клинических испытаниях при HemA (Table 1). Капсидный белок AAV-LK03 имеет 98.9% последовательностей, идентичных естественно возникшему AAV3B, который первоначально был отклонен от дальнейшей разработки из-за низкой эффективности трансдукции у мышей.76 Недавно несколько групп стали работать по изменению AAV капсид, исходя из AAV3B серотипа.[77], [78], [79] Одним из результатов такой попытки стала идентификация AAVS3, серотипа, который теперь находится в фазе I/II клинических испытаний при HemB и болезни Fabry.
Благодаря множеству своих преимуществ, AAV векторы стали ведущими кандидатами для нацеленной на печень GT. Напр., терапия HemA и HemB, при которой печень используется в качестве фактории для продукции отсутствующих факторов каогуляции. С момента первого клинического испытания с использованием вектора AAV серотипа 2, чтобы экспрессировать фактор каогуляции IX для HemB, было осуществлено несколько клинических испытаний с разными с естественно возникшими или синтетическими серотипами, включая AAV5, AAV8, AAVrh10, AAVS3, AAV-Spark100, и AAV-Spark200 для лечения HemA и HemB, с разными результатами (Table 1).[79-84] Пока устойчивая экспрессия белка была достигнута лишь в некоторых испытаниях, др. испытания были прекращены из-за ненадежности или низкой эффективности, подчеркивая тем самым важность собственно выбора серотипа и экспрессирующихся кассет. Во всяком случае эти исследования показали, что долговременная трансдукция печени с использованием AAV возможна и идут поиски использования rAAVs для лечения IMLD.[9-11],66,67
Первой IMLD экспериментально леченной с помощью AAV вектора стала FH путем вливания AAV вектора, несущего ген рецептора липопротеина очень низкой плотности (VLDLR), в кровобращение через портальную вену при FH мышей, это привело к 40% снижению в сыворотке холестерина и триглицеридов. Важно, что снижение было стабильным в течение длительного времени. Затем ряд исследований подтвердил терапевтическую эффективность при IMLD у животных моделей, которая растет экспоненциально в исследованиях по проверке концепции для AIP, PH1, Wilson's disease (WD), MMA, propionic acidemia (PA), PKU, HT1, PFIC3, Crigler-Najjar (CN), GSD1a и urea cycle disorders (UCDs). Хотя использование разных серотипов AAV способствует и раскрывает маршруты доставки, в целом, все исследования показывают долговременную терапевтическую эффективность при отсутствии крупных проблем с безопасностью. [9-11],66,67 в
Первым клиническим испытанием с использованием AAV при IMLD стало лечение AIP. Данные фазы I показали удивительный профиль безопасности, но только умеренный терапевтический эффект.86 Теперь проводятся разные клинические испытания для лечения IMLD или начинаются, включая PKU, OTC deficiency, CN, FH, Fabry, MPS type VI, Pompe, GSD1a и WD (Table 1).
Одно из ограничений AAV векторов связано с их эписомной природой, которая - после снижения их мутагенного потенциала - приводит к потере генома векторов и последующей потере терапевтического эффекта, если он применяется к растущей или регенерирующей печени.87 Это особенно важно для лечения детской популяции. Чтобы избежать такой пропажи геномов терапевтических векторов, предлагаются несколько стратегий, такие как использование rAAV геномов, содержащих гомологичные плечи для безопасной интеграции в клеточный геном, отбор AAVs со способностью к интеграции, транспозоны, несущие AAVs, или AAV-обеспечиваемая доставка системы редактирования генов.
Простейшей стратегией являются AAVs, которые индуцируют спонтанно целенаправленную интеграцию в локус последовательности без промотора, несущей терапевтический ген, фланкированный гомологичными плечами альбумина.88,89 С использование этого подхода, терапевтический ген помещается выше стоп-кодона для гена альбумина, приводя в результате к продукции мРНК, которая транслируется в химеру из альбумина и терапевтического белка. Эта стратегия была проверена на эффективность на животных моделях гемофилии, CN, дефицита AAT и MMA,[90-92] , а также было осуществлено клиническое испытание по лечению пациентов с MMA. Однако, только ~1% гепатоцитов оказался исходно отредактированным, так что эта стратегия оказалась действенной только при низких уровнях трансдуцируемых гепатоцитов и этого достаточно или просто отредактированные гепатоциты обладали избирательным преимуществом и могли занимать печень. К сожалению, этого не наблюдается при большинстве IMLDs. Такая низкая эффективность рекомбинации была повышена при совместном применении AAV-несущих специфические CRISPR-Cas9, которые вносят разрывы двойной нити в локусе альбумина.92
Альтернативно, выделены новые AAVs из человеческих CD34+ гематопоэтических стволовых клеток (наз. AAVHSCs); они высоко эффективны по обеспечению гомологичной рекомбинации в отсутствие любых ассоциированных нуклеаз. Было показано, что обеспечиваемая с помощью AAVHSC инсерция генов может корректировать болезненный фенотип у мышей, моделирующих PKU.93 Фаза I/II клинического испытания с использованием AAVHSC15 начата недавно на пациентах с поздно начинающейся PKU (Table 1).
Использование AAV векторов для доставки гена редактируемых нуклеаз и донорской матрицы lkxz коррекции гена с помощью homology-directed repair (HDR) привлекает интерес.94 Базирующаяся на HDR коррекция точковых мутаций была достигнута на гуманизированных модельных мышах с дефицитом OTC .95 AAV-обеспечиваемое редактирования генов может также использоваться для снижения экспрессии специфических белков, напр., при MPR или SRT стратегиях. Этот подход был успешно применен на животных моделях FH и PH1 путем супрессии PCSK9 и HO-белков, соотв.40,96 Недавно, AAVs несущие последовательности для системы транспозонов были опробованы в качестве стратегии для постоянной коррекции трансдуцированных клеток. Использование AAV-PB транспозоновой системы показало индукцию значительной экспрессии генов и терапевтическую эффективность на мышах, моделирующих PFIC3 и UCDs.97,98 Система AAV-PB была также успешно использована для доставки инсулинового гена мышам, моделирующим диабет, в результате были достигнуты normoglycaemia и толерантность к глюкозе.99

Adenoviral vectors


Adenoviruses (Ads) являются более сложными, чем AAVs, с 36 kb линейной из двух нитей геномной ДНК, кодирующей разные структурные и не структурные гены. Они я. вирусами, не покрытыми оболочкой и наиболее часто используемыми серотипами являются человеческие серотипы 2 и 5. Однако, в последние годы Ads, изолированные от разных видов были использованы для преодоления пред-существующей гуморальной иммунной реакции против этих серотипов. У иммуно-компетентных индивидов человеческие Ad вызывают лишь умеренную и само-ограничивающуюся болезнь. Ad обладают очень привлекательными характеристиками для доставки генов в печень, такими как заметные печеночный тропизм, высокие уровни экспрессии генов в широком круге клеток, легкость и рутинность процедуры достижения высоких функциональных титров, высокой способностью к упаковке и низкой генотоксичностью.100 Первый, базирующийся на Ad, рекомбинантный вирус, лишенный генов репликации, но сохраняющий большую часть генома, позволяет вносить экзогенный генетический материал до 8.5 kb. Эти т. наз. Ad векторы первой генерации оказались высоко эффективны по трансдукции гепатоцитов; однако, манипуляции по предупреждению репликации вируса оказались неспособны элиминировать экспрессию ряда структурных белков, что вызвало существенные воспалительные и иммунные реакции.100 Этот иммунный ответ привел к элиминации инфицированных клеток в довольно короткое время и тем самым достигался лишь временный терапевтический эффект. Первая генерация Ad векторов, как было установлено, являлась эффективной для разработки вакцин и противоопухолевого лечения, включая опухоли печени, но не для лечения наследственных болезней. Чтобы достичь долговременной экспрессии создана третья генрация Ad векторов или helper-dependent adenovirus (HDAd).101,102 В HDAd, все вирусные последовательности удалены, за исключением терминальной и упаковочной сигнальной последовательности, это позволило доставлять крупные последовательности (до 36 kb) и обеспечивать долговременную экспрессию трансгена, это было продемонстрировано на мышах и NHPs. HDAd, экспрессирующие LDLR для лечения FH, как было установлено, улучшают липидный профиль и уменьшают атеросклероз аорты у грызунов и NHPs.103 Терапевтическая эффективность HDAd была четко продемонстрирована на животных моделях PH1, CN, AIP, GSD1a и OTC.[100-102]
Несмотря на эти привлекательные свойства, всё ещё существует узкое горлышко главным образом из-за иммуногенности Ad векторов, которая сильно ограничивает эффективность и безопасность использования в клинических испытаниях.104,105 Более того, в случае HDAd векторов, отсутствие подходящей клинической производственной платформы остается основным ограничением для клинического использования.106
Для устранения этих препятствий предложены разные стратегии, чтобы избежать иммунной реакции хозяина: это воздействие на хозяина иммуносупрессирующих лекарств или модифицирование капсид.107 Последнее может быть достигнуто несколькими способами, включая химические и физические модификации Ad капсид полимерами, Ad capsid, обладающие иммунитетом не улавливаемыми белками и генетические модификации Ad капсид. Среди этих различающихся стратегий привлекает огромный интерес покрытие Ad не иммуногенными полимерами, такими как PEG, которые, как было установлено, существенно усиливают трансдукцию печени и снижение продукции воспалительных цитокинов и нейтрализующих антител (NAbs).107
Как и в случае с AAV, геном Ad остается эписомным после инфекции клеток. Чтобы создать устойчивые, вызываемые Ad, генетические изменения, Ad векторы были использованы для доставки CRISPR/Cas9 систем редактирование генов или элементов транспозонов в печень. 2-я векторная система была использования для доставки CRISPR/Cas9 и терапевтической последовательности ДНК, целенаправленно воздействующей на интеграцию в безопасный локус генома при лечении HemB или дефицита AAT.108,109 В обоих случаях достигнута высокая доля HDR с долговременной экспрессией и без очевидных долговременных повреждений в печени мышей. Совместная трансдукция HDAd с SB транспозонами собакам, моделирующим HemB, приводила к устойчивой экспрессии factor IX в течение почти 1,000 дней.110

Retroviral and lentiviral vectors


Ретровирусы (RV) и лентивирусы (LV) это покрытая оболочкой однонитчатая РНК, которая продуцирует свою собственную обратную транскриптазу (RT) это приводит к возникновению провируса с двунитчатой ДНК, который интегрируется в геном клетки. Вирусный геном содержит гены env, gag и pol, ограниченные по флангам длинными терминальными повторами (LTRs), которые несут энхансерные и промоторные элементы, необходимы для интеграции.11,111 Гены env и gag кодируют структурные вирусные белки, тогда как pol кодирует не структурные белки, включая RT. Лентивирусы имеют два дополнительных гена, tat и rev, которые кодируют регуляторные белки.111
Для получения векторов LTRs поддерживаются и вирусные гены элиминируются и замещаются терапевтической последовательностью, с возможностью принять 8-9 kb. RVs неспособны трансдуцировать неделящиеся клетки, это объясняет, почему этот вектор очень часто используется для ex vivo GT. LVs, напротив, способны трансдуцировать делящиеся и митотически молчащие первичные клетки, включая дифференцированные гепатоциты.111
RV и LV векторы в основном используются для коррекции гематологических нарушений. Однако, использование трансдуци рованных с помощью LV клеток костного мозга для лечения болезней лизосомного накопления, таких как adrenoleukodystrophy, обнаруживает впечатляющий результат.112
Ранние экспериментальные подходы для лечения генетических болезней печени использовали эти векторы для трансдукции первичных гепатоцитов и ре-имплантации их после генетической модификации обратно в печень или селезенку. Использование этой стратегии согласуется с экспрессией трансгена у мышей, крыс, собак и NHPs.[113-119] Более того, долговременное улучшение болезни было достигнуто для FH, HT, CN и животных, моделирующих гемофилию, это привело к первым испытаниям на людях.[115-118] У пациентов, базирующаяся на RV GT требовала культивирования гепатоцитов ex vivo, получаемых с помощью биопсии печени, которые затем трансдуцировали с помощью рекомбинантного RV вектора и затем вводили непосредственно в печень. Такая стратегия терапии была использована у пациентов с гомозиготной FH при этом достигалось очень слабое улучшение и только у некоторых пациентов . Ограниченная эффективность была обусловлена очень низким процентом приживления гепатоцитов (Table 1).119 Более того, этот подход нуждается в использовании инвазивных процедур, чтобы выделять и обратно вводить трасдуцированные гепатоциты.
Трансдукция была существенно улучшена с использованием LV векторов с почти 90% трансдукцией клеток.120,121 Трансплантации гепатоцитов, однако, оставались довольно неэффективными и изменчивыми, скорее всего, из-за плохого приживления и ограниченного времени сохранения трансплантированных гепатоцитов, если они не обнаруживали преимуществ в пролиферации. Недавно, нацеленная на печень ex vivo GT использовала LV вектор, чтобы интегрировать исправленный ген Fah и был выявлен лечебный эффект на болезнь печени у модельных свиней HT1, благодаря селективным преимуществам модифицированных гепатоцитов.122
Первоначальные исследования, комбинирующие применение RV векторов с частичной гепатэктомией, гепатотоксическими лекарствами или факторами роста гепатоцитов, чтобы индуцировать деления гепатоцитов и облегчить проникновение вирусов.[123-128] Долговременная экспрессия трансгена была затруднена за счет индукции реакции адаптивного иммунитета против трансгена, что требовало иммуносупрессивного лечения.129,130
Возможность системного применения рекомбинантных LV векторов для лечения болезней продемонстрирована на мышах, моделирующих CN, MMA и GSD1a.[131-133] Риск инсерционного мутагенеза первоначально ассоциировали с тем, что LV уменьшался с развитием самоинактивирующихся (SIN) векторов, в которых элементы энхансера / промотора LTR были удалены. Использование SIN-LV векторов у взрослых мышей и собак приводило к стабильной экспрессии в печени factor IX, индукции толерантности против рекомбинантного белка и отсутствовали указания на генотоксичность.134 Однако, слабая острая токсичность и низкая эффективность наблюдались благодаря коллатеральной трансдукции присутствующих antigen-presenting cells (APCs) в печени (Kupffer клетки и печеночные звездчатые клетки). Предлагаемые стратегии сегодня исследуются в отношении предупреждения потребления векторов клетками APCs, чтобы улучшить трансдукцию гепатоцитов и снизить системную токсичность. Включение человеческого ингибитора фагоцитоза CD47 в LV частицы привело к существенному увеличению экспрессии трансгена и снижению токсичности у обезьян.135
Клинический опыт с системным применением RV и LV к болезням печени пока мал. В 2003, 13 пациентов с HemA получали рекомбинантный RV, экспрессирующий фактор каогуляции VII, которые оказался хорошо переносим, но не давал достоверного клинического улучшения.136 Два клинических испытания заявлены на trials.gov для лечения HemA и HemB с помощью LV вектора, но они пока не подходящие количества пациентов (NCT03217032 и NCT03961243).

Relevant aspects to consider, current limitations and possible future directions in liver-targeted gene therapy


Увеличивается количество публикаций, демонстрирующих терапевтическую эффективность нацеленной на печень доставки генов, существует настоятельная необходимость сфокусироваться на усилиях по преодолению препятствий, наследуемых при переносе этих подходов в клинику. Среди основных затруднений выступают реакции врожденного и приобретенного иммунитета на продукты GT, потенциальная токсичность для печени и ограничения широко-масштабной и клинически значимой продукции векторов.7,10,11,137,138 В случае вирусных векторов для доставки в печень, клинический опыт с Ad пока еще не распространился за пределы лечения рака, т.к. его использование при IMLD сдерживается воспалительными реакциями и низкой продуктивностью, тогда как использование RV или LV векторов для целевого воздействия на печень всё ещё ограничено.
Использование GT векторов не остается незамеченным для иммунной системы. И не вирусные и вирусные векторы индуцируют активацию как прирожденной, так и приобретенной иммунной реакции, которая может ставить под угрозу терапевтический эффект. Более того, индукция воспалительной реакции при использовании рекомбинантных векторов в больной печени может приводить утяжелению печеночной патологии.10,137 Более того, устойчивая экспрессия трансгена, как было установлено, ограничивается активацией адаптивной иммунной реакции, что ведет к элиминации трансдуцированных гепатоцитов. Чтобы предупредить исчезновение терапевтического генетического материала сегодня уже успешно используют в пре-клинических и клинических испытаниях применение иммунно-супрессивного лечения.137,139,140 Однако, все они обладают риском оставить пациента с временно ослабленным иммунитетом и, таким образом, подвергнуться инфекции, и в зависимости от характеристик заболевания, это обратная сторона, которую следует тщательно оценивать . Некоторые альтернативы уже были применены - это использование покрытых полимерами векторов или модификации поверхности векторов, чтобы предупредить потребление клетками APCs и редуцировать активацию иммунного ответа и повысить трансдукцию клеток. Кроме того, эти иммунные реакции могут быть смягчены путем модификации последовательностей CpG в рекомбинантном генетическом материале, чтобы редуцировать путь активации Toll-like receptor 9.141
Более того, совсем недавно была высказана обеспокоенность по поводу гепатотоксичности, связанной с системным введением rAAV, из-за смерти 3 молодых пациентов, страдающих фатальным нервно-мышечным расстройством, которые получили высокую дозу вектора . 3 пациента были старше и более тяжелые, чем др. леченные пациенты и что очень важно, они имели признаки уже существующей hepatobiliary болезни. Особое внимание следует уделять воздействию на пациентов с уже предсуществующими печеночными нарушениями, что довольно обычно для пациентов с w IMLD.142 очень примечательно, что при клинических испытаниях с использованием AAV при дефиците AIP, OTC или GSD1a не отмечено существенных побочных эффектов.85
Кроме того, очень важны связанные с иммунитетом ограничения, а именно, присутствие предсуществующих гуморальных антител и memory T клеток против вирусных векторов, которые могут полностью блокировать печеночную трансдукцию. Большой процент в популяции имеет NAbs против AAV или Ad векторов.140 Кроме того, если пациенты подвергаются воздействию суб-терапевтической дозы вектора или терапевтический эффект снижен, то они не могут эффективно лечиться из-за присутствия NAbs. Это особенно важно, когда популяция педиатрическая, т.к. эффективность лечения может разбавляться со временем из-за роста печени. Разработка стратегий для преодоления этой проблемы находится в фокусе многих групп исследователей. Некоторые очень простые стратегии используют альтернативные серотипы без перекрестной реактивности, разрабатывают менее иммуногенные серотипы или химические модификации капсид. В качестве альтернативы производят физическое удаление NAbs с помощью плазмофереза или или иммунной адсорбции, которые оказались успешными применительно к животным моделям.143 Недавно была описана интересная стратегия элиминации NAbs, базирующаяся на использовании бактериальных протеаз, способных деградировать человеческие IgGs. Эта стратегия используется для предупреждения обусловленного антителами отторжения почек после трансплантации, это позволяет повторное использование вектора у мышей и NHPs.144
Важным аспектом, который д. быть тщательно оценен, является онкогенный потенциал GT. В случае AAV векторов после тревожных результатов, полученных на некоторых животных моделях онкогенной интеграции и некоторых сообщений, указывающих на связь интеграции генома WT AAV с возникновением HCC у людей,145 стало важным знать, что анализ интеграции генома AAV в печени пациентов, подвергнутых действию rAAV, обнаруживает безопасный профиль в течение длительного времени после (12-15 лет после использования вектора) не обнаруживая признаков устойчивой печеночной токсичности или возникновения HCC.146,147 Однако, независимо от используемого вектора для доставки генетического материала, все пациенты должны тщательно отслеживаться в отношении потенциал онкогенной интеграции.

Conclusion


Печень из-за ее центральной роли в метаболизме и ее роли в качестве белковой фабрики является органом-мишенью для лечения многих наследственных и приобретенных метаболических нарушений и представляет собой очень привлекательную платформу для производства циркулирующих терапевтических белков. Было показано, что несколько подходов, направленных на печень, с использованием невирусных и вирусных векторов обеспечивают длительные терапевтические эффекты на клинически значимых моделях животных; однако лишь часть из них дошла до клиники (Таблица 1). Тем не менее, обнадеживающие результаты продолжающихся клинических испытаний, нацеленных на печень, и разрешение на продажу ряда продуктов GT вселяют оптимизм в отношении будущего GT при заболеваниях печени. Несмотря на то, что многие проблемы остаются, продолжающиеся усилия и прогресс позволят добавить еще много неизлечимых в настоящее время генетических заболеваний в список излечимых и даже излечимых заболеваний без необходимости в ОТП в ближайшем будущем.