Митохондриальная ДНК (mtDNA) человека, впервые открытая в 1963, это в 16569 bp циркулярная, двунитчатая, сверхспиральная молекула, которая кодирует 37 генов, существенных для оксидативного фосфорилирования (OXPHOS) и синтеза митохондриальных белков^{1, 2}. Из этих 37 генов, 13 кодируют субъединицы 4 из 5 OXPHOS комплексов из множества субъединиц, расположенных на внутренней митохондриальной мембране: 7 субъединиц из Complex I (ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5 и ND6); 1 субъединица из Complex III (cytochrome b); 3 субъединицы из Complex IV (COXI, COXII и COXIII); и 2 субъединицы из Complex V (ATP6 и ATP8). Все субъединицы Complex II кодируются ядерным геномом (nDNA), вместе со всеми остальными субъединицами и факторами сборки, необходимыми для завершения системы OXPHOS³. Помимо этих 13 субъединиц mtDNA также кодирует 22 tRNAs и 2 rRNAs. Нити mtDNA обозначаются как тяжёлая нить (Hstrand) и легкая нить (Lstrand). Hstrand богата гуанином, а Lstrand богата цитозином.⁴. Существуют 28 генов, кодируемых c Hstrand и 9 генов. кодируемых с Lstrand. Из-за двойного происхождения митохондриальных белков, необходима тонкая координация между двумя геномами для осуществления митохондриальной функции; мутации в любом их белок-кодирующих генов в любом из геномов могут приводить к митохондриальным болезням, гетерогенной группе болезней.

Существует высокое множество генетической информации, содержащейся в mtDNA благодаря относительно малому размеру генома, количеству кодирующих генов и отсутствию интронных последовательностей. Чтобы дополнить эту информацию, некоторые из генов лишены завершающих кодонов терминации или перекрываемости др. с др. ⁵. Др. свойством молекулы человеческой mtDNA является не кодирующий регуляторный регион, обозначаемый как displacement loop (Dloop), два источника репликации (origin of replication of the Hstrand (OH) и origin of replication of the Lstrand (OL)), и две промоторные последовательности (heavystrand promoter (HSP) и lightstrand promoter (LSP))³. OH, HSP и LSP расположены внутри Dloop региона.

В большинстве клеток имеется приблизительно 1000 митохондриальных геномов⁶. В противоположность nDNA, эти mtDNA геномы не организованы в хромосомы с помощью гистонов; вместо этого митохондриальные геномы организованы в ДНК-белок структуру. наз. nucleoid⁷. Большинство нуклеоидов содержит только 1 mtDNA (в среднем каждый нуклеоид имеет 1.4 молекул mtDNA). Эти молекулы mtDNA организованы вокруг стержневого набора белков, включая и TFAM (mitochondrial transcription factor A), POLG (mitochondrial DNA polymerase gamma), mtSSB (mitochondrial singlestranded binding protein), POLRMT (mitochondrial RNA polymerase) и LONP1 (mitochondrial Lon protease homolog)⁸. Др. белок, который часто обнаруживается ассоциированным с нуклеоидом, это ATAD3, который прямо или косвенно, по-видимому, обеспечивает ассоциацию mtDNA нуклеоида с внутренней митохондриальной мембраной^{9, 10}. Уровни молекул mtDNA в целом зависят от потребностей клеток в энергии. Репликация mtDNA не зависит от клеточного цикла и существует немного энзимов, которые участвуют в этих процессах, включая POLG и mtDNA helicase TWINKLE^11-14. Несмотря на это знание энзимов, играющих роль в механизмах, регулирующих количества копий mtDNA, всё ещё недостаточно.

По сравнению с ядерным геномом, где действует Менделевское наследование, характер наследования митохондриального генома является однородительским, наследуется только от матери. Единицей наследования является mtDNA нуклеотид⁷. После оплодотворения происходит потеря митохондрий спермиев, тем самым блокируется передача отцовской mtDNA. Эта потеря может быть активной, посредством деградации митохондрий спермиев с помощью ubiquitination, mitophagy или деградации mtDNA, или пассивной, посредством разбавления отцовской mtDNA пулом материнской mtDNA^{15, 16}. Исторически, только в одном сообщении говорилось о передаче отцовской mtDNA у людей, указывая, что подобная деградация и последующая блокада могут быть преодолены; однако, это не является распространенным явлением1⁷. Недавно были идентифицированы три неродственные семьи с несколькими поколениями, у которых было выявлена передача mtDNA от обоих родителей, т.е. сходное с аутосомым доминированием наследование¹⁸. Такая интерпретация была оспорена из-за обнаружения крупных ядерных псевдогенов (следствие эволюционной миграции фрагментов mtDNA в ядро), что могло бы объяснить наследование отцовской mtDNA последовательности^19-22.

По сравнению с nDNA, mtDNA обнаруживает более высокую скорость эволюции (примерно в 10-20 раз выше), что может частично объяснить 100 - 1000-кратное увеличение скорости мутаций в mtDNA^23-25. Эти мутантные молекулы mtDNA обнаруживают тенденцию к спорадическому образованию и благодаря этому большое число копий мутантных и дикого типа mtDNA молекул может сосуществовать в одной клетке (mtDNA гетероплазмия)²⁶. Из-за репликации mtDNA в клетке независимо от клеточного цикла mtDNA может сегрегировать во время репликации, а уровни и динамика гетероплазмии могут меняться в течение жизни как в митотических, так и пост-митотических клетках и тканях¹¹. Вместе с природой мутаций процент гетероплазмии является главным фактором, предопределяющим клиническую тяжесть митохондриальных болезней. Существует биохимический порог, ассоциированный с процентом мутантной mtDNA, который может быть преодолен для снижения функции OXPHOS и начала фенотипических проявлений ²⁷. Этот порог зависит от типа мутации, типа клеток и типа ткани и может варьировать между 60 и 90% мутантной mtDNA для проявления фенотипический отклонений²⁸. Разные ткани обладают разными биохимическими порогами и поэтому дефекты биоэнергетики обнаруживаются в определенных тканях раньше, чем в др. у пациентов. Кроме того, процент гетероплазмии может сдвигаться митотических и мейотических делений клеток, приводя к ряду биоэнергетических дефектов, в зависимости от клеточной или тканевой репликативной способности.

Понимание митохондриальной дисфункции может быть трудной задачей из-за сложных взаимодействий между ядерным и митохондриальным геномом. Тот факт, что mtDNA может сегрегировать с помощью материнской зародышевой линии и в соматических тканях, увеличивает сложность. Для понимания изменчивости гетероплазмии в материнской линии, наиболее важно распознать, что индивидуальные ооциты могут иметь разные уровни гетероплазмии. В первом исследовании, 82 ооцита от матери давали m.3243A>G (18.1% гетероплазмии в quadriceps и 7.2% в лейкоцитах)²⁹. Эти ооциты имели пределы гетероплазмии 0-45% для m.3243A>G мутации, со средним значением в 12.6% и median в 8.2% гетероплазмии, тогда как 8 ооцитов оказались лишенными каких-либо обнаружимых уровней мутаций mtDNA²⁹. Авт. этого исследования моделировали распространение гетероплазмии между ооцитами в виде binomial распределения, исходя из предположения, что частота инициального материнского мутантного аллеля была средней для проанализированных ооцитов. Во втором исследовании мать, обладающая m.8993T>G (50% гетероплазмии в крови) мутацией, гиперовулировала и возникли в результате 7 ооцитов были проанализированы на уровни гетероплазмии³⁰. Один ооцит был определен как не содержащий мутации, тогда как остальные 6 обнаруживали более 95% гетероплазмии для точковой мутации m.8993T>G³⁰. Интересно, что дети от этих матерей обнаруживали свою собственную изменчивость изменчивость гетероплазмии, при этом мать с мутацией m.3243A>G (из первого исследования) имела сына с 11.7% m.3243A>G мутацией в крови, тогда как мать только с мутацией m.8993T>G (из второго исследования) имела трех сыновей, один с 98% мутации в quadriceps и фибробластах (умер от синдрома Leigh (митохондриальной болезни)), один с 95%в крови (умер от синдрома внезапной смерти ло года), и один с 87% в крови, который страдал синдромом Leigh^{29, 30}. Этот широкий спектр сдвигов гетероплазмии между поколениями ставит вопрос, как (и если) определенный патогенный вид mtDNA сегрегирует в ооцитах.

Изменчивость гетероплазмии у детей может быть приписана частично сегрегации mtDNA после оплодотворения, т.к. эмбрион генерируется из ооцита, который гетероплазмичен по патогенному виду mtDNA, и будет обладать разными уровнями гетероплазмии mtDNA в разных развивающихся тканях и органах в зависимости от расхождения mtDNA после оплодотворения. Частично это обусловлено mtDNA "узким горлышком", которое возникает как только ооцит будет оплодотворен. Теория генетического узкого горлышка базируется на доказательствах от Holstein коров, у которых только лишь существенная редукция количества копий mtDNA может быть ответственна за большие сдвиги в гетероплазмии mtDNA в течение нескольких генераций³¹. Дальнейшие исследования генетического узкого горлышка у мышей оказались противоречивыми, при этом разные исследования обнаруживали, что величина редукции количества копий mtDNA варьирует. Некоторые показали, что эта редукция числа копий от уровня 100000 mtDNA копий в оплодотворенном ооците до 200 в примордиальных зародышевых клетках (PGC) (около 40 митохондрий с 5 копиями mtDNA каждая), тогда как др. продемонстрировали редукцию числа копий, но только до 1500 молекул mtDNA на клетку^32-35. Недавно было показано, что эти различия в редукции количества числа копий во врем узкого горлышка в зародышевой линии могут быть объяснены различиями ядерных генотипов у инбредных линий мышей, используемых для исследований³⁶. Методологии изоляции PGCs из эмбрионов человека всё ещё недостаточно успешны, но протоколы по изоляции PGCs человека на ст. Carnegie 12 и далее были разработаны и позволили исследовать зародышевую линию людей^{37, 38}. Используя adjacentsection электронные микрографии и получение изображений целых клеток с высоким разрешением для PGCs, изолированных in vivo от здоровых женских эмбрионов, Chinnery группа наблюдала выраженную редукцию содержания mtDNA, определяемую в ~5 mtDNA молекул на митохондрию, которая не изменяется между Carnegie стадиями 12 и 20-21³⁷.

Дальнейший анализ mtDNA в этих PGCs показал, что эти здоровые женские эмбрионы обладают низким уровнем гетероплазмии mtDNA, большинство из вариантов были нуклеотидными переходами. Кроме того, в PGCs на Carnegie стадиях 12 - 20-21 снижалась пропорция несиндромальных вариантов в белок-кодирующих генах и снижалась скорость мутаций на основание для tRNA генов - это указывало на отбор против потенциально вредных вариантов mtDNA. Сюрпризом для авт. стало доказательство отбора против вариантов в регионе Dloop mtDNA, который является некодирующим. Этот процесс отбора возникает рано во время развития, подставляя потенциально вредные варианты mtDNA для отбора, предупреждая накопление мутаций mtDNA; однако, мутации, которые избегают этого процесса отбора, скорее всего, вызывают экстремальный сдвиг в гетероплазмии, который может наблюдаться от одной генерации к др. Недавно было сообщено, что сегрегация гетероплазмии может распространяться в виде спектра в пределах от случайного дрейфа до направленного отбора в зависимости взаимодействий между митохондриями и ядром, при этом цель заключается в достижении максимальной митохондриальной приспособленности³⁶. В дополнительном исследовании были использованы мышиные модели с двумя отличающимися гаплотипами mtDNA, было установлено увеличение вариабельности гетероплазмии зародышевой линии в ооцитах и сегрегация mtDNA между зародышевой линией и исследуемой тканью по мере увеличения возраста матери³⁹.

Хотя известно, что генетическое узкое горлышко возникает во время развития, но механизмы остаются неизвестными. Предполагается существование трех возможных механизмов: (i) пассивное уменьшение mtDNA; (ii) фокальная репликация mtDNA; и (iii) упаковка mtDNA в крупные сегрегирующие единицы (rev.40). Все эти механизмы (вместе или в отдельности) д. приводить к существенным изменениям гетероплазмии внутри одного поколения (Fig 1).



Figure 1. Mechanisms of mtDNA depletion during genetic bottleneck resulting in daughter cells with varying heteroplasmy

During the genetic bottleneck that occurs during germline development, there is a reduction in mtDNA levels in the fertilized oocyte and the resulting daughter cells have a wide range of heteroplasmy levels. Some possible mechanisms of the reduction in mtDNA that can explain the bottleneck during germline development include (A) the passive but marked reduction in mtDNA levels during each cell division in early development, followed by stochastic segregation of mtDNA into daughter cells; (B) mtDNA packaged into homoplasmic clusters which are reduced in discrete segregating units during each cell division; and (C) focal mtDNA replication where only a selected population of mtDNA molecules are replicated. All of these possible mechanisms would result in daughter cells with varying heteroplasmy.

В дополнение к митохондриальной сегрегации в зародышевой линии, отбор на митохондриальном уровне такж может отвечать за изменчивость гетероплазмии. Используя секвенирование всего генома у почти 13000 индивидов, было установлено, что в зависимости от расположения варианта гетероплазмии, вероятность трансмиссии изменяется²². Варианты гетероплазмии в регионе Dloop с большей вероятностью будут переданы, чем варианты, обнаруживаемые в rRNA генах, тогда как передача вариантов белок-кодирующих генов и tRNAs оказывается между ними. Если анализировать белок-кодирующие гены, и если вариант является синонимичным вариантом, то, скорее всего, он будет передаваться сравнимо с не синонимичными вариантами. Проанализировано более 1500 пар мать-потомок и гетероплазмичные варианты были установлены в пределах 1 из 3-х категорий: (i) передается и наследуется (если вариант найден у матери и ребенка); (ii) теряется (если вариант присутствует тольк у матери); или (iii) возникает de novo (если вариант найден только у потомка). Анализ этих вариантов показал, что и матери и потомка фракция потерянных или возникших de novo вариантов достоверно ниже, чем передача или наследование вариантов. Интересно, что гетроплазмические варианты, которые были проанализированы, те, которые ранее были описаны (в 1000 Genomes datasets and Single Nucleotide Polymorphism Database) были, скорее всего, передаваемыми и наследуемыми.

Точковые мутации mtDNA могут возникать из-за неэффективности системы репарации mtDNA, ошибок репликации или индуцируемых реактивными видами кислорода (ROS) оксидативных повреждений^41-43. Точковые мутации или наследуются от матерей или возникают спорадически. Большинство патогенных mtDNA точковых мутаций существуют гетероплазматически. Появление точковых мутаций mtDNA находится в пределах 1:5000 и 1:500000^{26, 44}. В последние 30 лет идентифицировано свыше 330 патогенных точковых мутаций mtDNA человека и это количество растет³.

Первое сообщение о наследственном нарушении, базирующемся на mtDNA было связано с Leber's hereditary optic neuropathy (LHON)⁴⁵. Вдоль mtDNA имеется множество точковых мутаций, ассоциированных с LHON, но три из них наиболее распространены, они стремятся предстать гомоплазмическими мутациями, это m.11778G>A (ND4), m.3460G>A (ND1) и m.14484T>C (ND6)^{46, 47}. Точковые мутации, которые стремятся к гетероплазмии при LHON это m.14459G>A и m.14600G>A (обе в ND6). Для мутаций, которые обнаруживают гетероплазмию, имеет место высокий мутационный груз (более 80%) , что сказывается на клинических проявлениях⁴⁸. LHON рассматривается как одна из наиболее превалирующих митохондриальных болезней. Она в первую очередь обнаруживается у юношей и пациенты обнаруживают острую или субострую двухстороннюю потерю зрения⁴⁷.

Leigh синдром (LS) является уникальным клиническим проявлением, но оно может быть приписано мутациям mtDNA или nDNA⁴⁹. Многие из точковых мутаций mtDNA, ассоциированные с LS, находятся в генах Complex I, включая m.3697G>A (ND1), m.10191T>C (ND3) и m.13513G>A (ND5); др., ассоциированные с mtDNA точковыми мутациями являются m.9176T>C и m.8993T>G/C (обе в ATP6) ^50-53. Для патогенных фенотипов уровни гетероплазмии могут быть более 80% для этих точковых мутаций²⁷. В первую очередь пациенты с LS характеризуются субострой дегенерацией нервов базального ганглия, приводя к гипотонии, спастичности, нарушениям движений, мозжечковой атаксией и нейропатией периферических нервов^{49, 54}.

Нейропатия, атаксия и retinitis pigmentosa (NARP) чаще всего ассоциированы с точковой мутацией m.8993T>G/C (ATP6), которая также ассоциирует с LS, если присутствуют высокие уровни (более 80%)⁵⁵. Пациенты с NARP обнаруживают симптомы слабости проксимальных нейрогенных мышц вместе с сенсорной нейропатией, атаксией и пигментной ретинопатией⁴⁹.

80% пациентов с митохондриальной миопатией, энцефаломиопатией, lactic acidosis и инсульто-образными эпизодами (MELASs) имеют m.3243A>G (tRNALeu(UUR)) ⁵⁶. Уровни гетероплазмии, превышая 60%, могут приводить к патогенному фенотипу²⁷. MELAS пациенты обладают прогрессирующей энцефалопатией и инсульто-образными эпизодами^57-59. Помимо MELAS, та же самая мутация, как было установлено, также вызывает широкий спектр клинических проявлений, от изолированной миопатии до изолированного диабета, потери слуха, мигреней или мультисистемынх энцефалопатий^{57, 60, 61}.

Др. митохондриальное нарушение, характеризующееся точковой мутацией в гене tRNA, это миоклональная эпилепсия с неровными (ragged) красными волокнами (MERRFs). MERRF наиболее часто ассоциирует с m.8344G>A (tRNALys) mtDNA мутацией и с более, чем 70% гетероплазмии для этой мутации, что и может приводить к патогенезу^{27, 62, 63}. MERRF пациенты обладают миоклонаьной эпилепсией, а также генерализованными судорогами, потерей слуха, птозом век и множественным липоматозом^{64, 65}.

Делеции mtDNA являются повреждающими, поскольку они удаляют многие белок-кодирующие гены, а также гены tRNA и rRNA. Эти делеции могут варьировать по размеру от 1.8 до 8 kb, и могут существовать в любом месте mtDNA, хотя имеются некоторые области в mtDNA, которые наиболее чувствительны к образованию делеций и являются источниками репликации, необходимой для консервации^66-68. Молекулярные механизмы, лежащие в основе образования делетированных mtDNA (mtDNA), активно исследуются. Многие точки разрывов делеций mtDNA имеют на флангах прямые или несовершенные повторы в интактной mtDNA (Class I делеции), указывая, что делеции mtDNA могут возникать из репликационного slippage^{15, 69, 70}. В 2017, анализ одиночных молекул mtDNA продемонстрировал остановку репликации на месте соединения концов делеции, подтверждая, что нарушения репликации могут быть механистической основой образования делеций Class I mtDNA⁷⁰. Недавно было продемонстрировано, что неправильное спаривание (mispairing) во время синтеза Lstrand во время репликации mtDNA, скорее всего, ответственно за вовлечение в делеции прямых повторов⁷¹. С др. стороны, делеции mtDNA не используют прямых повторов (Class II делеции) и, по-видимому, формируются за счет разрывов двойной нити и повторного соединения своодных концов ДНК. Это было четко показано на мышиных моделях, экспрессирующие целевые митохондриальные рестрикционные эндонуклеазы^{72, 73}.

Формирование делеций обычно спорадично и они обычно не передаются от матери⁷⁴. Однако, в проведенном в 2004 на 226 семьях идентифицированы одиночные виды делеций mtDNA, это может указывать на то, что в действительности риск передачи их потомству приблизительно 1 на 24 родов⁷⁵. Эти крупные делеции или перестройки mtDNA, как полагают, участвуют в гетероплазмии^{76, 77}. Если гетероплазмия особенно высока для делеции mtDNA у молодых пациентов, то превалирует теория, согласно которой делеции возникают рано в развитии, вскоре после прохождения узкого горлышка и достижения высокого уровня гетероплазмии с потенциалом повреждения многих тканей⁷⁶. Накопление делеций mtDNA в пост-митотических тканях также наблюдается во время обычного старения^78-82.

Наиболее распространенные делеции, обнаруживаемые у пациентов, являются обычными. Распространенная делеция это делеция в 4977bp (4977), чьи точки разрывов имеют на флангах прямые повторы с 13bp^{67, 74, 83}. Распространенные делеции также обнаруживаются на низких уровнях в пост-митотических тканях у большинства старых индивидов, но на более ни зких уровнях, чем при настоящих митохондриальных болезнях. Это приводит к потере 12 важных митохондриальных генов, включая OXPHOS гены (ATP8, ATP6, COXIII, ND3, ND4L, ND4 и ND5) и tRNAs (G, R, H, S2 и L2). Три наиболее ассоциированных синдромов с общераспространенной делецией являются Pearson's syndrome (PS), Kearns-Sayre syndrome (KSS) и progressive external ophthalmoplegia (PEO). PS характеризуется sideroblastic анемией с вакуолизацией клеток предшественников костного мозга и с рано начинающейся дисфункцией поджелудочной железы^{84, 85}. PS обычно является фатальным у детей, но пациенты, которые выжили в детстве часто обнаруживают KSS. KSS является мультисистемным нарушением с началом до 20 лет. Пациенты с KSS страдают от oculocraniosomatic нарушения, характеризующегося миопатией, пигментной ретинопатией и мозжечковой атаксией и дефектами проводящей системы сердца⁶⁶. PEO - это миопатия, воздействует на способность пациентов двигать глазами и веками⁸⁶. Не существует определенного возраста начала, но PEO может возникать в ходе 5-15 лет и такие пациенты обычно обнаруживают признаки генерализованной миопатии.

Сегодня не сущетвует лечения митохондриальных болезней, только паллиативное лечение, лишь облегчающее проявления болезни. Митохондриальные болезни могут возникать благодаря мутациям или делециям в mtDNA или nDNA, а с появлением инструментов генотерапии были предприняты попытки фиксировать или замещать мутантные гены для лечения пациентов. Гетероплазмическая природа большинства нарушений, базирующихся на mtDNA, создает уникальную возможность для терапии, которая вместо воздействия, чтобы фиксировать поврежденный ген, нацелена на всю мутантную молекулу, чтобы её деградировать и позволить молекулам дикого типа восполнить и восстановить количество копий. В течение последних 20 лет, использование разрывов двунитчатой ДНК (DSBs), чтобы сдвинуть гетероплазмию mtDNA, было оценено на ряде разных моделей. Нацеленные на митохондрии рестрикционные эндонуклеазныe (mitoREs) были использованы, чтобы генерировать DSBs разрезы специфических последовательностей mtDNA, чтобы быстро истощить один из видов mtDNA iin vitro ex vivo и in vivo в мышиных моделях гетероплазмии mtDNA^87-91. Мутация m.8993T>G , ассоциирующая с NARP, генерирует SmaI/XmaI сайт, который не обнаруживается у дикого типа. Когда mitoSmaI/mitoXmaI доставляется в cybrids (цитоплазматические гибриды) обладающие более 90% мутации, то происходит уменьшение мутантных молекул и соотв. увеличение молекул дикого типа mtDNA^{92, 93}. Будучи эффективным по сдвигу гетероплазмии mtDNA, этот метод зависит от присутствия естественно возникшего уникального сайта ограничения, который соответствует точковой мутации или делеции, который не очень распространен.

Ключом к изменению гетероплазмии mtDNA с помощью специфических нуклеаз является тот факт, что митохондрии не обладают системой репарации DSB. Фактически вследствие DSB mtDNA быстро деградирует⁸⁷. Недавно было установлено, что эта деградация обеспечивается энзимами, ассоциированными с репликацией mtDNA, включая активность экзонуклеаз из polymerase gamma и нуклеазы Mgme1^{72, 94}. Контроль количество копий mtDNA плохо изучен, но после истощения mtDNA, оставшиеся молекулы обнаруживаю усиление репликации для нормализации количества копий^{72, 90, 95-99}. Поскольку оставшиеся молекулы преимущественно дикого типа после деструкции мутантной mtDNA, такое восстановление количества копий приводит к повышению соотношения дикого типа mtDNA и улучшает митохондриальную функцию (Fig 2A).



Figure 2. Mechanism of mtDNA heteroplasmy shift following DNA editing enzymemediated DSB

Targeting pathogenic mtDNA for degradation is one method of shifting mtDNA heteroplasmy below the biochemical threshold. (A) Staring with a cell with high levels of heteroplasmy, mitoREs, mitoTALENs, mitoTEVTALEs, and mitoZFNs can be used to selectively or preferentially cleave the pathogenic mtDNA molecules, resulting in a transient depletion of total mtDNA levels. Mechanisms associated with copy number control will return mtDNA to pretherapeutic levels but with a lower load of the pathogenic mtDNA. (B) Architecture of the DNA recognition elements and DNA editing enzymes used to shift mtDNA heteroplasmy. mitoREs are enzymes that bind to and cleave mtDNA at a specific, but short recognition sequence. mitoTALENs are comprised of two monomers, each with a DNA recognition element and one FokI monomer, when two FokI monomers are sufficiently close together they will dimerize and cleave the mtDNA. mitoTEVTALEs are comprised of a single monomer, with a DNA recognition element and the ITevI nuclease which can cleave mtDNA at a CNNNG sequence. mitoZFNs are similar to mitoTALENs in architecture, where there are two DNA recognition elements and two FokI nucleases that need to dimerize to cleave the mtDNA sequence. The difference between the DNA recognition elements in mitoTALENs/mitoTEVTALEs and mitoZFNs is the number of nucleotides recognized by each element (1 versus 3 nucleotides).

Недавно внимание было сконцентрировано на разработке нуклеаз, таких как TALENs или ZFNs, которые могут быть нацелены на митохондрии и преобразовывать связывание со специфичными, но более длинными последовательностями ДНК, наделяя их преимуществом по сравнению с mitoREs^{95-97, 99-101}. Наша лаб. разработала нацеленный на митохондрии TALEN (mitoTALEN), чтобы воздействовать целенаправленно на точковые мутации mtDNA, ассоциированные с LHON и дистонией (m.14459G>A), а mtDNA с "common deletion" (m.848313459del4977) у пациентов происходит из цибридов⁹⁶. Последующее изучение пациентов, происходящих от цибридов, несущих используемую mitoTALEN, будет проверено, действует ли она на др. точковые мутации, включая и m.8344A>G и m.13513G>A, которые ассоциированы с MERRF и MELAS/LS, соотв.¹⁰⁰.

mitoTALENs представлены сиквенс-специфическим модулярным ДНК-связывающим доменом и они могут содержать сиквенс-независимый эндонуклеазный домен из FokI (Fig 2B). FokI был разработан, чтобы действовать как облигатный гетеродимер, так что два mitoTALEN мономера должны были бы находиться в тесной близости к FokI, чтобы димеризовать и вызывать DSBs в mtDNA ¹⁰². Сиквенс-специфические TALE ДНК-связывающие домены в TALENs являются повторами модулярных ДНК-связывающих доменов (наз. repeat variable diresidue или RVDs), которые может быть преобразованы, чтобы распознавать специфические нуклеотиды^{103, 104}. Тогда как архитектура, нацеленных на митохондрии ZFN (mtZFN или mitoZFN) , очень сходна с mitoTALEN, с двумя основными отличиями: (i) Каждый ДНК-распознающий домен может распознавать 3 нуклеотида и (ii) ZFNs нуждаются в сигнале экспорта в ядро помимо нацеленной на митохондрии последовательности (MTS) , чтобы целенаправленно воздействовать на белок вне ядра и в митохондриях¹⁰⁵. Также обычно включаемая в mitoTALEN из mitoZFN архитектура является иммунологической меткой на N- конце каждого мономера (или HA , или FLAG), после MTS выбирается и независимый флуоресцентный маркер (или eGFP или mCherry) для экспрессии. Временно трансфицированные клетки, экспрессирующие eGFP и mCherry отбираются с помощью клеточной сортировки, а изменения в уровнях гетероплазмии и mtDNA могут быть оценены. Figure 2B суммирует общую структуру разных ДНК редактирующих платформ, использованных для элиминации мутантной mtDNA.

В случае точковой мутации mtDNA, один ДНК-связывающий домен (или мономер) из mitoTALENs или mitoZFNs д. распознать последовательность mtDNA, которая несет точковую мутацию, а др. д. распознать последовательность mtDNA дикого типа, которая находится в тесной близости к FokI нуклеазе, чтобы димеризовать и расщепить мутантную молекулу mtDNA. В дикого типа mtDNA, только один из мономеров ("дикого типа" мономер) д. соединяться с mtDNA, и поэтому не нужен второй FokI домен для создания функционального димера, DSB не должны возникнуть. В случае делеции mtDNA, каждый мономер д. распознавать последовательность ДНК, которая будет по флангам ограничивать (flanking) каждую из сторон от точек делеции, в достаточно тесной близости одна от др. для вызываемых FokI DSB, чтобы расщепить mtDNA. В молекуле дикого типа mtDNA эти мономеры д. соединяться с достаточным расстоянием др. от др., что не приводит к расщеплению mtDNA.

mitoTALENs и mitoZFNs были использованы для сдвига гетероплазмии в отношении количества разных, возникающих у пациентов патогенных mtDNA (Table 1). В модели m.14459G>A, клетки, которые были временно трансфицированы с помощью специфических mitoTALEN мономеров и отсортированы с помощью экспрессии eGFP и mCherry, показали, что происходит не только существенный сдвиг в гетероплазмии в направлении дикого типа mtDNA, но и также любое истощение mtDNA, которое обнаруживается спустя 48 ч. после трансфекции , возвращается обратно к статусу до трансфекции спустя 14 дней после трансфекции⁹⁶. Когда использовали mitoTALEN, которая неспецифична у модели к точковой мутации m.14459G>A, то не возникает ни истощения mtDNA, ни сдвига в гетероплазмии. У модели m.8993T>G клетки, которые были временно трансфицированы специфическими mitoZFN мономерами и отсортированы по экспрессии GFP и mCherry, также обнаруживали достоверный сдвиг в направлении дикого типа mtDNA , а истощение, наблюдаемое спустя 24 ч возвращалось к уровням до трансфекции к 28 дням после трансфекции⁹⁸. Далее наша группа и группа Minczuk оказались способны использовать mitoTALEN и mitoZFN, чтобы эффективно сдвигать гетероплазмию mtDNA в клеточных моделях одной из распространенных делеций^{96, 99}. mitoTALENs были также использованы в двух разных моделях мутаций iPSC, ассоциированных с MELAS, при этом трансфекция mitoTALENs приводила к снижению специфического мутантного гаплотипа^{106, 107.}



Table 1. Engineered mitonucleases used in human mtDNA mutation/deletion models

Недавно mitoTALEN и mitoZFN были использованы для воздействия in vivo на модели точечных мутаций mtDNA, m.5024C>T у мышей^{95, 97, 108}. Эти модельные мыши обнаруживают умеренную кардиомиопатию с возрастом, но наиболее выразительными биохимическими фенотипическими отклонениями стали снижение уровней динамического равновесия митохондриальной tRNA^Ala и снижение organello белкового синтеза. В обеих группах использовали рекомбинантный AAV9, обеспечивающий доставку каждого из мономеров к их соотв. инструменту редактирования ДНК против мутантной молекулы mtDNA. Использованный AAV9 серотип обладает высоким тропизмом к скелетным мышцам^{109, 110}. Внутримышечные инъекции mitoTALEN в tibialis anterior (TA) выявили достоверный сдвиг в гетероплазмии mtDNA в сторону дикого типа на 10, 12 и 24неделях после инъекции по сравнению с любым AAV9-GFP или одиночным AAV9-mitoTALEN мономером, инъецированным в TA⁹⁵. Подобный сдвиг в гетероплазмии сопровождался соотв. увеличением уровней митохондриальных tRNA^Ala. Более важно, что системные инъекции mitoTALEN посредством retroorbital sinus (систематическая венозная доставка) также давала достоверный сдвиг в гетероплазмии в сердце спустя 6 и 12 недель после инъекции и в quadriceps 12 недель после инъекции. Инъекции в хвостовую вену mitoZFNs обнаруживали достоверный сдвиг в гетероплазмии mtDNA в сердце в направлении дикого типа спустя 65 дней после инъекции. Интересно, что с повышением количества AAV9 этот сдвиг сопровождался истощением числа копий mtDNA в сердце, указывая тем самым, что имеется дозовая зависимость этого энзима, редактирующего ген и что более высокие титры могут вызывать неспецифическое расщепление дикого типа mtDNA (помимо расщепления мутантной молекулы mtDNA)⁹⁷.

Успешная системная доставка mitoTALEN и mitoZFN in vivo для сдвига гетероплазмии mtDNA и восстановления уровней tRNA является главным узким местом при продвижении метода в клинику и использования генотерапии у пациентов. Др. препятствие, которое может быть минимизировано для более эффективной генотерапии, это поиск путей доставки нуклеаз, которые не нуждаются в димеризации, чтобы расщеплять mtDNA, снижает тем самым сложность рекомбинантных вирусов, необходимых дя доставки. Наша лаб. опубликовала использование ITevI нуклеазы для сдвига гетероплазмии mtDNA¹¹¹. В конструкции mitoTevTALE домен TALE сцеплен с ITevI нуклеазой вместо эндонуклеазы FokI. ITevI действует как мономер и создает DSB в сайте CNNNG в mtDNA. Целенаправленное воздействие mitoTevTALE на MERRF m.8344A>G мутацию может существенно сдвигать гетероплазмию в направлении дикого типа и восстанавливать митохондриальную функцию в cybrid клеточной модели¹¹¹ (Fig 2B).

Попытки использования технологии, такой как CRISPR пока безуспешны из-за трудностей целенаправленного воздействия guide RNA на митохондрии1¹², хотя отдельные сообщения объявляет, что это работает¹¹³.

При переносе инструментов генотерапии с in vitro и in vivo моделей гетероплазмии mtDNA на пациентов, следует гарантировать отсутствие эффектов вне мишеней для DSBs как в митохондриальном, так и ядерном геноме. Как упоминалось выше, после генерации разрывов двойной нити в mtDNA, возникает временная деплеция mtDNA. Эта деплеция обнаруживается при использовании mitoREs, mitoTALENs и mitoZFNs, но после достаточного времени на восстановление (от дней до недель) эта деплеция больше не обнаруживается^{90, 95-100, 111}. Хотя большинство mtDNA деградирует после разрывов двойной нити, редкие фрагменты mtDNA могут формировать делетированные типы, обнаруживаемые на очень низких уровнях^{73, 114}. Присутствие на этих очень низких уровнях делеций не является негативным для главной митохондриальной функции, запускаемой элиминацией мутантных mtDNA в условиях гетероплазмии.

Минимизация любых эффектов вне мишени mitoTALENs oили mitoZFNs в nDNA является очень важным, поскольку имеется только две копии каждого гена в клетке по сравнению с mtDNA. Даже если принять во внимание присутствие множественных механизмов репарации ДНК в ядре, разрывы двойной нити в nDNA могут тем не менее создавать большие проблемы для пациентов. Наилучший способ предупредить их возникновение является использование анализа in silico одинаковых последовательностей в nDNA (mtDNA псевдогены) и выбор соотв. последовательностей для целенаправленного воздействия, которые специфичны для mtDNA. Gammage et al установили, что две потенциальные ядерные мишени не затрагиваются после воздействия mitoZFN in vivo⁹⁷.

Помимо успехов митохондриальной генотерапии, существует митохондриальная заместительная терапия и техника, привлекшие мало внимания, это замещение митохондрий в ооцитах и эмбрионах. Если женщина имеет высокие уровни патогенной mtDNA, то донорская яйцклетка со здоровой mtDNA может быть энуклеирована и ядерный геном может быть заменен у женщин с патогенной mtDNA до оплодотворения. В теории эта техника д. элиминировать передачу патогенной mtDNA следующему поколению, если только остается менее 2% патогенной mtDNA после переноса (из-за небольшого количества цитоплазмы, окружающей ядро кариопласта, используемого для переноса)^{115, 116}. Препятствием для такой митохондриальной заместительной терапии является обеспечение донорской mtDNA, сравнимой с ядерным геномом реципиента. Расхождение в митохондриальном-ядерном геноме может привести к снижению митохондриальной биоэнергетики, возникновению иммунного ответа или влиять на др. процессы, такие как старение^{117, 118}. Перенос веретена приводит к более чем 99% донорской mtDNA оказывается в ооцитах и в большинстве случаев, эта донорская mtDNA стабильно поддерживается в эмбриональных стволовых клетках, генерируемых из этих ооцитов¹¹⁹. Однако, около 15% из таких ES клеток демонстрируют постепенную потерю донорской mtDNA полное возвращение к патогенному материнскому гаплотипу^{115, 116, 120}. Чтобы предотвратить подобную реверсию, возникающую в эмбрионах после оплодотворения, митохондриальная генотерапия д. использоваться после переноса веретена или пронуклеуса, чтобы полностью элиминировать патогенные типы mtDNA. И mitoRE, м mitoTALEN были использованы у эмбрионов и было показано, что происходит элиминация специфических mtDNA гаплотипов ⁹¹.

Mitochondrial diseases are a heterogeneous group of diseases that can manifest at any age, affect almost any tissue, and have varied clinical pathologies. In recent years, advances have been made to understand how mtDNA can segregate in the germline, during development, and in cells and tissues to affect the phenotypic outcome in a patient. In addition to gaining a better understanding of the basis of mitochondrial diseases, therapeutic approaches including gene therapies and mitochondrial replacement have been explored and expanded upon. Together, the understanding of both how mitochondrial diseases arise from pathogenic mtDNA variants and methods to safely and effectively remove/replace the pathogenic mtDNA will aid in the ongoing fight against mitochondrial diseases.