Выдающиеся успехи достигнуты в области генотерапии и техники редактирования генома, такой как CRISPR, которая вскоре позволит лечить широкий круг генетических нарушений. В самом деле, недавно одобрены некоторые подходы по замещению генов, включая Leber congenital amaurosis type 2 (LCA2),¹ spinal muscular atrophy type 1 (SMA1),² и β-thalassemia.³ Последний результат оказался наиболее впечатляющим, т.к. β-thalassemia одним из наиболее распространенных наследуемых нарушений крови в мире, затрагивает приблизительно 1 га 100000 человек.⁴ Ясно, что ген-заместительная терапия, согласно High and Roncarolo⁵ является прекрасной стартовой точкой для обзора состояния в данной области.

Несмотря на этот удивительный прогресс, генотерапия для наследственных митохондриальных болезней может представить уникальный и пленительный набор вызовов, которые неполностью оценены из-за не столь глубоко изученной биологии митохондрий. Митохондрии являются, конечно, обязательными участниками функционирования клеток, продуцируя массу энергии (в форме АТФ), необходимой клеткам для процессов oxidative phosphorylation (OXPHOS). Следствия мутаций в митохондриальном геноме (mtDNA) и в связанных с митохондриями ядерных генах часто тяжелые и прогноз у таких пациентов обычно очень плохой. В настоящее время существует способность корректировать такие генные дефекты у пациентов. Генотерапия и CRISPR редактирование генов открывают возможности в области медицинской генетики, но существуют определенные ограничения в лечении митохондриальных болезней, которые д. учитываться.

Большинство белков. необходимых для функционирования митохондрий кодируется геномом ядра (nDNA), при этом более 1500 генов в nDNA участвуют в структуре и функции митохондрий. Эти гены транскрибируются и транслируются вне митохондрий и затем транспортируются в митохондрии посредством специализированных путей импорта (see Fig. 1). Т.к. митохондрии обладают двухслойной липидной мембраной - обозначаемой как наружная (OMM) и внутренняя (IMM) митохондриальные мембраны - то пути импорта д. использовать сигнальные пептиды, чтобы локализовать белки в соотв. им месте расположения в митохондриях, где они осуществляют биохимически отличающиеся функции. Серии белковых комплексов в OMM и IMM кооперируются для трафика каждого митохондриального белка в соотв. место.⁶ Большинство митохондриальных белков, кодируемых в nDNA импортируется в OMM посредством TOM (translocase of the outer membrane) комплекса, но ряд белков импортируется др. способом (напр. β-barrel белки, которые импортируются в OMM посредством Sorting and Assembly Machinery Complex). Последующая локализация в межмембранном пространстве, внутренней митохондриальной мембране или матрикса базируется на разных путях, таких как MIA (mitochondrial intermembrane space import and assembly) путь или TIM (translocase of the inner membrane) комплексах. Собственно доставка и локализация критических функций каждого из этих кодируемых в ядре митохондриальных белков и представляет существенное затруднение для стратегии замещения генов.

Fig. 1: Expression of a putative nuclear-encoded mitochondrial protein using a recombinant viral vector.

The majority of the proteins required for mitochondrial function (~1500) are encoded by the nuclear genome (nDNA), while a small subset of proteins (13), 22 tRNA and 2 rRNA are encoded by the mitochondrial genome (mtDNA). In the case of proteins encoded by the nuclear genome, restoration of protein function will involve transduction of the recombinant viral vector, transcription of the transgene, and translation of the protein in the cytosol (a), followed by transportation of the protein into the mitochondria through specialized import pathways (b). Most nuclear-encoded proteins are imported as precursors through the general "translocase of the outer membrane" (TOM) complex, which is located in the outer membrane. Subsequent import mechanisms differ based on the structure and function of the mitochondrial protein, as well as its ultimate destination. In the case of the example shown here, which is a protein destined for one of the respiratory complexes of the IMM, a "translocase of inner membrane" complex such as TIM23 (not shown) will interact with the TOM complex to facilitate insertion of the respiratory complex protein into the IMM. In contrast, mtDNA-encoded proteins are synthesized inside the matrix, and co-translationally inserted into the inner mitochondrial membrane to form complexes with their nDNA-encoded partners. By default, any proteins encoded by gene therapy vectors such as AAV will also be translated in cytosol like any other nDNA-encoded protein. Thus, in order to allotopically express an mtDNA-encoded protein from the nucleus, additional modification of a mtDNA-encoded protein will be required to make sure that it is imported to its proper location inside the mitochondria. Abbreviations: OMM (outer mitochondrial membrane), IMM (inner mitochondrial membrane), IMS (Intermembrane space), mtDNA (mitochondrial DNA), AAV (adeno-associated Virus).

В противоположность ядерному геному, митохондриальный геном (известен также как митохондриальная ДНК, или mtDNA) является циркулярной молекулой ДНК приблизительно 16.5 kilobases в длину, которая обычно содержится в митохондриальном матриксе (внутри IMM) (Fig. 1b). mtDNA кодирует небольшой, но критический субнабр генов, включая 13 белок-кодирующих генов, необходимых для OXPHOS, а также 22 tRNA и 2 rRNA генов, необходимых для трансляции этих 13 белок-кодирующих генов.^7-9 Белок-кодирующие гены являются компонентами респираторных комплексов во IMM, которая также содержит белки, кодируемые геномом ядра. Однако, в противоположность путям импорта, используемым для доставки кодируемых ядром белков в митохондрии, mtDNA-кодируемые белки синтезируются внутри матрикса и одновременно с трансляцией вставляются непосредственно в IMM (Fig. 1b) с помощью митохондриальных рибосом, посредством insertase Oxa1, белка внутренней мембраны Mba1,и разнообразных др. факторов.^10-13

Митохондриальная ДНК наследуется исключительно от матери. Поэтому женщимны с мутантной mtDNA могут передавать болезнь непосредственно через потомков женского пола, приводя к наследственным генетическим нарушениям, которые могут передаваться в течение многих поколений по материнской линии. Кроме того, большинство клеток тела содержит сотни митохондрий, которые постоянно сливаются и делятся др. с др., чтобы сформировать динамичную, филаментозную сеть органелл, при этом каждая индивидуальная митохондрия несет до 10 копий mtDNA.¹⁴ Когда молекулы mtDNA внутри клетки почти идентичны на нуклеотидном уровне, то их обозначают как гомоплазмия (homoplasmy). Напротив, любая ситуация приводящая к дивергентным последовательностям mtDNA за счет ли мутаций de novo или вариантов, передающихся от предка, обозначается как гетероплазмия.^15,16 Несколько факторов - таких как реактивные виды кислорода, которые возникают как побочные продукты OXPHOS, или невысоко-качественной продукции специфической для митохондрий DNA polymerase gamma - приводят к накоплению новых и потенциально вредных мутаций mtDNA с возрастом.^17-19 На вершине этих существенных изменений в уровнях гетероплазмии для пред-существующих вариантов mtDNA могут со временем появляться по мере пролиферации клеточных линий,²⁰ варианты, отличающиеся у матери и их детей.²¹ Последний феномен гетероплазмии сдвига между детями и матерью, по-видимому, возникает в результате генетического "bottleneck" в зародышевой линии, при этом только субнабор молекул mtDNA реплицируется во время ключевой фазы развития ооцита.^22-24 Это может приводить к драматическим и непредсказуемым изменениям в частотах гетероплазмии в поколениях. Поскольку многие варианты mtDNA могут быть доброкачественными или иметь ограниченные эффекты на индивиды, то др. варианты могут приводить к разрушительным последствиям для здоровья пациента за счет нарушения функции митохондрий. Часто тяжесть проявлений зависит процента мутантного варианта, присутствующего у индивидов с гетероплазмией, которые обычно обозначаются как пороговый эффект.^25,26 Порог может также варьировать в зависимости от ткани или органа; энергетических затрат органов, таких как головной мозг или сердце, которые могут оказаться ниже порога , чем у органов, потребляющих меньше энергии, таких как почки.²⁷

Методы идентификации болезнь-вызывающих вариантов в ядерном геноме, такие как секвенирование целого генома или целого экзома, составляют рутинную часть современной клинической практики. Сходным образом, идентификация патологических вариантов в mtDNA становится и передовой и рутинной с появлением секвенирования следующего поколения. Сегодня золотым стандартом секвенирования mtDNA в выборках крови пациентов является избирательная амплификация mtDNA с помощью PCR и затем использование NGS для секвенирования возникающих в результате amplicons.^28-30 Т.о., в одном тесте могут быть определены гаплогруппа пациента, присутствие како-либо болезнь вызывающего варианта и уровень гетроплазмии упомянутых вариантов.

Поскольку методы детекции mtDNA-обусловленных митохондриальных болезней улучшаются, но превентивные стратегии для этой группы болезней остаются субоптимальными. В случае моногенных нарушений, передаваемых через ядерный геном, пренатальная диагностика и пре-имплантационная генетическая диагностика, использующие биоптаты от эмбрионов, оказываются ценными для предупреждения передачи генетических нарушений от несущих нарушение родителей к детям. Такие методы, конечно, также могут быть использованы эффективно для диагностики митохондриальных болезней, несущих митохондриальные белки, кодируемые в ядре. Однако, пренатальная диагностика для болезнь-вызывающих вариантов mtDNA совсем др. история. Для матери, несущей гомоплазмическую мутацию, нет нужды в пренатальной диагностике; все её потомки будут гомоплазмическими также. Однако, для женщин, несущих гетероплазмические мутации, осложнения часто могут возникать из-за различий в уровнях гетероплазмии между матерью и потомками^31-33 и различий в уровнях гетероплазмии в разных тканях плода.³⁴ Амниоцентез будет ограничен в таких случаях, т.к. он в основном будет определять клетки кожи плода и клетки мочи плода, что затрудняет определение уровней гетероплазмии в др. тканях, таких как головной мозг. Даже для большинства оптимистических сценариев пренатальная диагностика будет лишь способна предотвратить лишь небольшую часть передачи патогенной mtDNA и главным образом у женщин с низким уровнем гетероплазмии. Поскольку женщины с таким низким уровнем гетероплазмии часто не обнаруживают симптомов и многие будут избегать обнаружения, пока не выявится один ли несколько признаков у потомков. Поэтому улучшение технологии секвенирования позволит выявлять все больше пациентов в обозримом будущем.

Базируясь на характеристиках биологии митохондрий, могут быть решены некоторые вопросы для успешного использования генотерапии для лечения митохондриальных болезней.

Предыдущие испытания генотерапии были в основном сконцентрированы на лечении состояний, затрагивающих специфические ткани, такие как глазные¹ или нейродегенеративные нарушения,^2,35,36. которые нуждаются лишь доставке трансгена в очень специфические места. К сожалению, большинство митохондриальных нарушений затрагивают мульти-органные системы и поэтому необходим вектор, экспрессирующийся по всему телу, чтобы продуцировать какое-либо достоверное улучшение у пациентов. Это повышает риск иммунного ответа на поставляющий вектор, среди др. тканей. Это также требует практического рассмотрения того, как достигнуть такого широкого паттерна экспрессии. Во-первых, в надежде достичь системных эффектов, необходимы большие количества вирусных частиц, которые будут увеличивать цену лечения. Во-вторых, вирусные частицы с исправленным тропизмом д. выбирать ткань, которая нуждается в целенаправленном воздействии. В большинстве случаев необходима системная доставка по многим тканям. Более того, поскольку ЦНС является наиболее широко распространенной мишенью при митохондриальных болезнях, то вирусные частицы также д. быть способны пересекать гемато-энцефалический барьер. Модифицированный серотип AAV (AAV-PHP.B) был недавно разработан с использованием базирующейся на Cre целенаправленной эволюционной стратегии, обладает удивительным тропизмом к тканям ЦНС у C57BL/6 мышей, даже при внутривенном введении.³⁷ Однако, этот особый серотип, как было установлено, лишен такого тропизма после внутривенного вливания у др. линий мышей,³⁸ а также у не человекообразных приматов.³⁹ Было также показано, что он причина острой токсичности у этих приматов при использовании высоких доз, которые необходимы, для восстановления митохондриальной функции у пациентов.³⁸ эти факты ставят серьезные вопросы к его использованию у людей. Несмотря на эти ограничения AAV-PHP.B сам по себе, однако, является, скорее всего, даже более очищенным вектором доставки, разработанным для использования у людей.

Любой митохондриальный белок, кодируемый nDNA д. быть импортирован в митохондрии посредством серии сложных белков импортирующих каналов (Fig. 1). Т.к. митохондриальные белки, кодируемые с помощью mtDNA обычно не содержат подобных сигналов (т.к. они синтезируются внутри митохондрий) (Fig. 1), то необходимо найти способ, чтобы импортировать их в митохондрии, когда они экспрессируются из вирусного вектора. Это можно было бы обеспечить добавлением mitochondrial targeting signal (MTS) к белкам, кодируемым с помощью mtDNA, эффективно воспроизводя естественную импортную систему такого белка в правильно место митохондрий. Для mtDNA-кодируемых RNAs (22 tRNA и двух rRNA), это значительно более затруднительно, т.к. их доставка происходит в митохондриальный матрикс. В то время как импорт малых некодирующих РНК осуществляется у вех эукариот, процесс недостаточно изученный, как путь импорта митохондриальных белков.⁴⁰ Однако, получены обнадеживающие предварительные результаты в этой области, включая открытие РНК в 20-bp , которая, по-видимому, облегчает импорт как некодирующих РНК. так и мРНК.⁴¹

К сожалению, для mtDNA-кодируемых белков, даже усиление импорта allotopically-экспрессируемой версии белка не является простым решением, как казалось. Недавно было продемонстрировано, что избыточная продукция митохондриальных белков (кодируемых с помощью mtDNA или nDNA) может сама по себе вызывать тяжелые дефекты функции и метаболизма митохондрий. Продукция дефектных и/или неправильно упакованных митохондриальных белков. кодируемых с генома ядра, может приводить к продукции токсических митохондриальных белков предшественников в цитозоле (процесс, обозначаемый как стресс от избыточного накопления митохондриальных предшественников или mPOS), также как дисфункция внутри самих митохондрий (включая нарушения OXPHOS, proteotoxic стрессы, и истощение mtDNA), обусловленные накоплением неправильно упакованных белков.⁴² Важно, что имеются также указания на то, что избыточная экспрессия в общем-то дикого типа, кодируемых в ядре митохондриальных белков, может запускать mPOS в клетках человека из-за избыточной тесноты.⁴³ Если это так, то это будет представлять основное препятствие по использованию генотерапии по замещению дефектных митохондриальных белков, кодируемых их геномом, поскольку высокие уровни экспрессии обычно необходимы для получения достоверного улучшения состояния пациента.

Даже если предположить, что избыточная экспрессия кодируемых nDNA митохондриальных белков осуществляется нормально, остается возможность, что избыток белка будет мешать функционированию митохондрий, поскольку компоненты цепочки транспорта электронов д. присутствовать в точно сбалансированном соотношении для эффективного осуществления OXPHOS. Если один из компонентов избыточен или представлен недостаточно, что в цепочке транспорта электронов, то реактивные промежуточные образования будут возникать, а уровни интактных комплексов могут быть редуцированы. Конечным результатом будет избыточная продукция реактивных видов кислорода, которые будут длительно повреждать клетки. Принимая во внимание, что разные ткани могут иметь разные уровни гетероплазмии, то такая ситуация обладает потенциалом стать действительно сложной: нормальные ткани могут в конечном итоге экспрессировать избыточные количества интересующих митохондриальных белков даже если фенотип "восстановлен" в болезненной ткани.

Заместительная генотерапия, базирующаяся на AAV2 векторе, как было установлено, умеренная. но многообещающая, успех на мышах достигнут для разных кодируемых в ядре митохондриальных болезненных генов.^44-46 Однако, только первичные митохондриальные болезни сегодня участвуют в активных клинических испытаниях заместительной генотерапии, Leber's hereditary optic neuropathy (LHON), вызываемой мутациями митохондриями кодируемого гена MT-ND4. Множественные проводимые сегодня испытания по лечению LHON с использованием AAV2 векторов и MT-ND4 кодирующей последовательности, модифицированной, чтобы нести сигнал MTS. В целом эти испытания выявили некоторые улучшения зрительной функции у пациентов, страдающих от LHON, особенно у тех, болезнь у которых продолжается менее двух лет до начала лечения.⁴⁷ Однако, следует отметить, по крайней мере, в одном из испытаний (NCT02652780), что инъекции вирусного вектора в один газ также восстанавливало функцию и второго глаза. Базирующийся на qPCR анализ может объяснить такой результат, показав, что вирусный вектор может обнаруживаться в тканях, извлеченных из обоих глаз. Это может указывать, что вирусный вектор переносится из инъецированного глаза в не инъецированный глаз. Это может указывать на то, что вирусный вектор передается посредством зрительного нерва в зрительном перекресте, хотя такой механизм ещё не полностью подтвержден. В целом однако, результаты эти х испытаний обнадеживают и есть причина надеяться, что и др. гены митохондриальных болезней могут быть пригодны для заместительной генотерапии. Пока мало клинических испытаний проведено с митохондриальными болезнями, вызываемыми в nDNA.

В свете затруднений, связанных с использованием традиционной генотерапии для лечения патогенных вариантов mtDNA, митохондриальная заместительная терапия (MRT) в общем рассматривается как наиболее эффективная техника. доступная для предотвращения наследственных мутацй mtDNA.^48-50 При таком подходе ядерный геном матери, несущей вредную мутацию mtDNA физически передается посредством техники микроманипуляций в энуклеированный ооцит от др. здоровой самки с отсутствием мутации mtDNA. Существует огромный интерес к этой технике в области репродуктивной медицины, т.к. обусловленное возрастом снижение митохондриальной функции рассматривается как главная причина снижения качества ооцитов и плодовитости у женщин после 35.^51,52 По этой причине имеется огромный интерес к использованию, MRT, чтобы позволить пожилым женщинам передавать свой ядерный геном ооциту от молодых женщин и тем самым получать генетически-родственное потомство. Однако, существуют споры относительно этической законности использования таких крайних вмешательств в вопросы мирской плодовитости. Напротив, этические причины использования MRT для предупреждения передачи серьезных мутаций mtDNA вполне понятны.

Существует несколько подходов, используемых для MRT, включая перенос полярных ядрышковых тел,^53,54 pronuclear перенос,55,56 и перенос комплекса веретено-хромосомы.^57,58 Каждый подход отличается по времени переноса (т.e., до или после оплодотворения), а также составом переносимого материала и продолжаются дебаты относительно достоинств каждого подхода. Все подходы дают потомков, генетически родственных пациентке (матери) и отцу на уровне ядерного генома, но которые будут нести mtDNA от ооцита донора и не будут страдать от мутации mtDNA пациентки.⁵⁹

Помимо новых этических вопросов, возникающих в связи с мнением, такой "three-parent" ребенок, подвергается практически опасности, связанной с MRT относительно количества мутантной mtDNA от пациента во время процесса передачи ядерного материала. Нет понятия, как в точности сделать, чтобы защитить от переноса митохондриального материала от пациента во время переноса ядерного материала. Давно предпринимаются попытки минимизации переноса цитоплазматического материала (в большинстве оптимизированных методов менее, 2%),⁵⁹ , поэтому возникающая в результате гетероплазия очень низкая.⁶⁰ это также возникает в сообщениях об индивидах, которые были рождены в результате ooplasmic трансплантаций (более ранняя и менее сложная альтернатива MRT), которые давали в основном нормальных в смысле здоровья и познавательных способностей детей.^61,62 Однако, остается возможность, что частота мутантной mtDNA может увеличиваться по мере взросления ребенка или в более поздних поколениях.60 Однако, тщательное планирование и отбор совместимых донорских гаплогрупп сможет сильно уменьшить это и отбор только мужских эмбрионов для манипуляций эффективно устраняет риск последнего. Определенно, случаи первых детей, полученных с помощью MRT в 2016 обнадеживают,⁶³ , дети оказываются свободными от болезни и какого-либо достоверного сдвига в уровне гетероплазмии.

MRT является мощным, но ограниченным подходом. Он может быть использован только предупреждающей остановки передачи патологической mtDNA и ничем не может помочь уже имеющимся пациентам. Это заставляет искать способы более эффективной инкорпорации отредактированного генома для их терапии.

Наиболее подходящим подходом д. быть использование хорошо известной техники CRISPR редактирования генов. Однако, он может оказаться не столь уж эффективным подходом, т.к для него требуется два компонента чтобы внести разрывы двойной нити в геноме: Cas9 нуклеаза для разрезания ДНК, и гид РНК (gRNA) , которая определяет последовательность ДНК, которая является мишенью. Кроме того, если специфические альтерации возникают в последовательности mtDNA, то должна присутствовать гомологичная матрица для репарации, соответствующая Cas9 белку и gRNA. Т.к. mtDNA расположена внутри митохондрий, то все три компонента д. быть импортированы в митохондрии, чтобы произошло редактирование. Это сильно осложнено в ооците и зиготе, которые по подсчетами содержат свыше 100000 митохондрий. Это означает, что эффективность процесса импорта разных компонентов CRISPR, а также энзимов в редактируемые мутантные молекулы mtDNA сами по себе д. быть чрезвычайно эффективными по своей способности влиять на уровень гетероплазмии ооцита или только что оплодотворенной зиготы. Итак, эти факторы создают дополнительный набор логистических осложнений, которые отсутствуют при CRISPR редактировании ядерных генов.

Единственное сообщение 2015 объявило, что система CRISPR/Cas9 может быть использована для избирательного редактирования mtDNA в культивируемых клетках человека,⁶⁴ , но механизмы, делающие возможными эти процессы, остались неясными. Очевидно, что Cas9 белок, который уже модифицирован для прикрепления MTS, соединяется с gRNA в цитоплазме и помогает транспортировать её в митохондрии, аккуратно решая проблему импорта gRNA. Gammage с колл. тщательно рассмотрели эту работу и др. родственные в своем обзоре 2018 и пришли к выводу, что доказательства, подтверждающие CRISPR/Cas9 редактирование mtDNA остаются неоднозначными.⁶⁵

В недавней работе на рыбках данио также было продемонстрировано, что нацеленная на одиночную ДНК кассета, содержащая гомологичные плечи, специфичные для митохондриального генома, была способна генерировать события гомологичной рекомбинации в комбинации с системой CRISPR/Cas9. Это может оказаться настоящей меняющей игру находкой, т.к это может позволить менять любые желаемые нуклеотиды, индуцируемые в mtDNA скорее, чем просто манипуляции с уровнями гетероплазмии существующих популяций mtDNA посредством избирательной деградации. Чтобы помочь объяснить этот неожиданный результат, авт. предоставили данные, показывающие, что система CRISPR/Cas9, по-видимому, существенно усиливает регуляцию нескольких главных белков, участвующих в репарации ядерной ДНК.⁶⁶ И опять, однако, точный механизм остается неясным. Важно, что не было четко продемонстрировано, что энзимы репарации ядерной ДНК также импортируются в митохондрии, ни то, что они могут эффективно собираться в ансамбли и оперировать соотв. образом внутри митохондриального матрикса, что является обязательным предварительным механистическим условием для любой гомологичной рекомбинации, способной возникнуть. Определенно существует мало доказательств, что гомологичная рекомбинация mtDNA происходит с какой-либо достоверной частотой у млекопитающих,⁶⁷ даже при неприятных состояниях, которые могли бы прибегать к таким событиям.^68,69 Более того, когда события рекомбинации происходят, то они, по-видимому, в большинстве случаев внутримолекулярные по природе,⁷⁰ лишь в редких случаях межмолекулярные обмены происходят в последовательностях ДНК между молекулами mtDNA. Т.о., независимо от верификации необходимо с аккуратностью определять эти претензии. Однако, даже предполагая, что аппарат гомологичной рекомбинации может оперировать эффективно внутри митохондриального матрикса, избыточная экспрессия гомологичной репарации и энзимов репарации ДНК может приводить к нестабильности генома^71-73, что может существенно навредить пациенту. Т.о., если CRISPR/Cas9 в самом деле вызывает усиление экспрессии энзимов репарации ДНК, как полагают авт., то это необходимо учитывать при будущем использовании репарации генома, базируясь на CRISPR/Cas9.

Учитывая чреватую природу редактирования mtDNA, базируясь на гомологичной репарации, наиболее популярной и эффективной опцией для редактирования мтДНК в данный момент является использование рестрикционных экзонуклеаз, которые избирательно разрезают мутантные молекулы mtDNA, оставляя дикого типа молекулы mtDNA интактными. Потенциал такого подхода базируется на чистке (proofreading) активности экзонуклеаз из митохондриальных полимераз gamma, которые, как было установлено, агрессивно удаляют linearized молекулы mtDNA как части их прирожденной активности.^74,75 При нормальных условиях, эта активность экзонуклеаз, по-видимому, снижает образование делеций mtDNA, частоты которых увеличиваются, если присутствуют линейные молекулы mtDNA.⁷⁵ В контексте базирующегося на эндонуклеазах редактировании mtDNA, оно делает возможным эффективную и избирательную элиминацию мутантной mtDNA, независимо от механизмов гомологичной репарации. Как только мутантная mtDNA элиминируется таким способом, то дикого типа mtDNA свободно замещает её в митохондриях клеток до гомоплазмии или почти. Подходы с использованием нуклеаз, не нуждающиеся в gRNA, такие как TALENs⁷⁶ и ZFNs,⁷⁷ оказались успешными у мышей и являются единственным подтвержденным способом изменения гетероплазмии mtDNA в лаб. По этой причине они также, скорее всего, могут быть предложены для клиники в будущем.

Recent successes in the field of gene therapy are truly encouraging and are likely only a glimpse of the progress to come in the near future. It is our belief that these cutting-edge genetic techniques can also significantly improve the lives of many of the patients and families who currently suffer under the burden of mitochondrial disease. However, caution must be taken to properly account for the unique qualities of the mitochondrial organelle in order to fully realize the potential of this technology in the treatment of mitochondrial disorders. For example, the current literature clearly demonstrates that mtDNA editing via protein-only nucleases such as TALENs or ZFNs is a much more effective approach than CRISPR/Cas9-based editing, and that the former approach must be prioritized for any near-term clinical trials. Furthermore, the delivery approach must take into account the relevant properties of each mitochondrial protein in question, in particular their localization within the mitochondrial organelle and how they will be properly targeted to that location without overwhelming the mitochondrial import machinery. The preliminary success enjoyed by the recently published clinical trials suggest that these challenges, while significant, are far from insurmountable.