Существуют разные формы редактирования генов с высокой точностью разных болезней, включая генетические нарушения и некоторые типы рака [1,2]. Редактирование генов в качестве альтернативного подхода к лечению многих болезней сильно продвинулось, особенно в аккуратности и обоснованности редактирования генома эукариотических клеток [3,4]. Геномное редактирование разрезает специфическую двунитчатую последовательность ДНК в соотв. месте генома и использует разные пути репарации ДНК клеток. 4 класса нуклеаз используются для разрезания специфических последовательностей ДНК, включая meganucleases, zinc-finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) и clustered regulatory interspaced short palindromic repeats, ассоциированные с RNA-guided Cas9 (CRISPR/Cas9) [5,6]. Геномное редактирование, базирующееся на системе CRISPR/Cas9 является эффективным инструментом, который служит превосходной альтернативой традиционным методам и приносит пользу генотерапии [4].

Система CRISPR/Cas9 редактирования генов и искусственно созданный инструмент для регуляции экспрессии или репарации генов в геноме человека [[9-12]]. Эта система в комбинации с single-guide RNA (sgRNA) для идентификации расположения мишени и Cas9 нуклеазы для рассечения ДНК. CRISPR/Cas9 имеет несколько типов; один тип - это дикого типа (wt) CRISPR/Cas9 и Cas9 nickase (nCas9), которые участвуют не только в редактировании генома. Wt-CRISPR/Cas9 система состоит из нуклеазы, наз. Cas9, которая генерирует разрывы двойной нити ДНК (DSB), и sgRNA. HNH и RuvC являются каталитическими доменами wt-CRISPR/Cas9 и эти две части ответственны за DSBs в гене мишени. Однако, с помощью перепрограммирования и искусственной инактивации любой из этих двух частей, wt-Cas9 превращается в nCas9 и приводит к разрывам одиночной нити (SSBs), пара nCas9 может быть использована для генерации двух nicks, чтобы снизить разрывы вне мишени [13]. Дуплексная РНК, используемая в системе CRISPR/Cas9 укорочена и сцеплена вместе, чтобы сформировать структуру stem-loop для прикрепления к месторасположению мишени [11]. С помощью наводящей sgRNA, которая состоит из CRISPR-derived RNA и trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA), которые формируют two-RNA структуру sgRNA, Cas9 может в точности вызывать нокаут с маркированных генах мишенях [12,14]. sgRNA имеет простую и прямую структуру, которую легко синтезировать. Cas9-based структура может легко соединяться с почти любой позицией генома, которую комплементарно выбирает sgRNA [15]. Система CRISPR/Cas9 целенаправленно воздействует на каждые 20 пн последовательности геномной ДНК, которая сопровождается 5'-NGG-3' последовательностью protospacer adjacent motif (PAM) и Cas9 нуклеаза разрезает стоящую на 3 пн выше PAM последовательность внутри гена мишени и создает DSB с помощью nonhomologous end-joining (NHEJ) или homologous recombination (HR) [14,15]. Специфичность и эффективность системы CRISPR/Cas9 в основном диктуется с помощью последовательности PAM и 17-20 нуклеотидной последовательности на 5' конце gRNAs [15] (Fig. 1).

Fig. 1. The schematic representation show CRISPR/Cas9 system functions in gene editing and beyond genome editing. (A) wt-Cas9 consist of two catalytic domains (RuvC and HNH) that cleaving target DNA strand and generating double strand breaks (DSBs). (B) Inactivation of these two nuclease domains, Cas9 turned into dCas9 and dCas9 can be fused with epigenetic effectors. (C) CRISPR/Cas9 can target single strand RNA in this new system PAMmer is essential element that recognize RNA, dead Cas9 (dCas9) can fused with multiple effectors and mediate diverse function on RNA.

Генетические изменения, вызываемые CRISPR/Cas9, ограничиваются специфическими сайтами мишени и не затрагивают последовательности вне мишени [10]. Если оба домена HNH и RuvC инактивированы, то wt-CRISPR/Cas9 система превращается в dead Cas9 (dCas9), которая затем может действовать как инструмент связывания ДНК с высокой специфичностью и чувствительностью, но без эндонуклеазной активности. Эта система может быть сопряжена о многими модификаторами, подобными эпигенетическим факторам для модификации экспрессии генов [16]. Также однонитчатая РНК (ssRNA) может быть подвергнута целенаправленному воздействию новой Cas/sgRNA, чтобы распознавать и разрезать ssRNA мишень. Это новый инструмент, наз. RNA-targeting Cas9 (RCas9), и искусственная инактивация Cas9 в dCas9 в этой новой системе могут приводить к созданию системы dead RNA-targeting Cas9 (dRCas9), которая затрагивает функцию РНК, такую как сплайсинг, трансляция и редактирование РНК с помощью слитых с ней эффекторов [17]. С улучшением методов целенаправленной детекции местоположения в системе CRISPR/Cas9, и с помощью идентификации модифицированных Cas9 энзимов, риск активации вне мишени CRISPR/Cas9 системы снижается [10] и система CRISPR/Cas9 может также идентифицировать многие места мишени за счет использования множественных gRNAs [15].

Несмотря на значительные возможности, эта система имеет и неудобства, такие как связывание генов, не являющихся мишенями, приводя к возникновению мутаций, несовпадений или делеций вне сайта мишени и вызывая в конечном итоге рак и др. генетические нарушения [12].

Пожилые индивиды более склонны страдать от нейродегенеративных болезней из-за накопления атипических белков или пептидов, таких как β-amyloid пептиды и фосфорилированные tau белки при AD, α-synuclein при болезни Паркинсона и мутантный huntingtin при болезни Хантингтона. Старения является большим фактором риска при этих заболеваниях, поскольку ослабляется способность к детоксикации или активации механизмов самозаживления. Из-а отсутствия эффективного лечения новый подход CRISPR привлекает большое внимание.

Увеличивается популяция пожилых людей, страдающих от прогрессирующих ментальных нарушений, таких как болезнь Альцгеймера (AD), для которой характерно зависимая от возраста диффузная потеря холинергических нейронов и накопление пептидов amyloid-beta (Aβ) в ЦНС вскоре после того, как происходит накопление гиперфосфорилированного белка tau во нейрофибриллярных узелках внутри нейронов [18]. С этого момента нейропатологической характеристикой AD становится отложение Aβ, поэтому большая часть стратегии генотерапии при AD сфокусирована на подавлении накопления нейротоксических видов Aβ путем индукции избыточной экспрессии или anti-Aβ антител для достижения пассивной иммунизации, или энзимов, деградирующих Aβ. В этой связи, исследование Hanseul Park с колл. привело к эффективному целенаправленному воздействию на гены в пост-митотических нейронах в головном мозге взрослых мышей, разработав новые CRISPR/Cas9 нанокомплексы. Их исследование показало, что добавление sgRNA к CRISPR/Cas9 nano-комплексу позволит целенаправленно воздействовать на гены в пост-митотических нейронах тела. Помимо этого в эти наночастицы был добавлен amphiphilic R7L10 пептид (состоящий из 7-arginine и 10-leucine) к Cas9-sgRNA, чтобы повысить эффективность и продуцировать постоянно R7L10-Cas9-sgRNA nano-комплекс. Поскольку beta-secretase 1 (Bace1) необходима для продукции Aβ пептидов, то целенаправленное воздействие на Bace1 является потенциальной стратегией лечения болезни Альцгеймера. Соотв. эти авт. пытались воздействовать на ген Bace1 и путем супрессии экспрессии этого гена ингибировать ассоциированную с Aβ патологию в двух мышиных моделях AD, используя эту систему [19].

Другой мишенью для генотерапии при AD является крупный внутримембранный белковый комплекс, известный как γ-secretase protease, которая регулируется с помощью γ-secretase activating protein (GSAP), а имеющиеся данные показывают, что снижение экспрессии GSAP достоверно снижает уровни Aβ. Тем не менее оценки показывают, что количество Aβ снижается у GSAP RNAi мышей, скрещиваемых с двойными трансгенными AD модельными мышами, это означает, что GSAP является новой терапевтической мишенью при AD [20]. Для дальнейшего исследования функции GSAP в регуляции γ-secretase впервые была использована CRISPR/Cas9 система, чтобы вызывать нокаут гена GSAP в линии клеток HEK293, которые обычно экспрессируют amyloid precursor protein (APP) и затем Wong. E. et al. установили, что отсутствие GSAP в клетках прямо снижает активность γ-secretase и тем самым продукцию Aβ. Эти находки подготовили почву для изучения модуляций γ-secretase и в конечном итоге для улучшения инструментов для лечения AD [21].

Принимая во внимание терапевтическую роль инструментов редактирования генов, Gyorgy. B. et al., чтобы подтвердить эти находки осуществили новое исследование. Они исследовали APPswe (Swedish) мутацию в гене APP, которая является главной причиной наследуемой болезни Альцгеймера. Их результаты показали, что количество патогенных Aβ снижается, когда аллель APPswe избирательно разрушается с помощью CRISPR/Cas9 из Streptococcus pyogenes in vivo и ex vivo. Следовательно, возможна генотерапия AD, вызываемая APPswe и до. мутациями, ассоциированными с увеличением Aβ [22].

Более того, потенциал защитного эффекта делеционной мутации в 3'-UTR гена APP был оценен Nagata. K. et al., которые редактировали ген APP посредством CRISPR/Cas9 у мышиных зигот. Затем они измеряли количественно Aβ и экспрессию APP в отредактированной мышиной модели и получили данные, объясняющие смягчение накопления Aβ в головном мозге из-за уровней экспрессии APP, которые снижаются делецией APP в 3'-UTR [23].

Кроме того, одним из важных генетических рисков при спорадических AD является apolipoprotein E4 (APOE4). Этот аллель варьирует от аллеля с нейтральным риском E3 посредством single nucleotide polymorphism (SNP). Наиболее преобладающими SNPs в гене APOE в качестве фактора риска при спорадических AD являются аллели rs7412 и rs429358 и APOE-ε2, APOE-ε3 и APOE-ε4 (Наиболее распространенные факторы риска для болезни Альцгеймера). Induced pluripotent stem cells (iPSCs) являются прекрасной перспективой модели AD, поскольку эти клетки обладают потенциалом дифференцироваться в любой необходимый тип клеток. CRISPR/Cas9 технология может быть применена к iPSCs от здоровых индивидов с APOE-ε3/ε4 генотипом с целью получения изогенных APOE-ε2/ε2, APOE-ε3/ε3 и APOE-ε4/ε4 линий вместе с APOE-нокаутной линией [24]. В др. исследовании на пациентах, страдающих от AD и несущих аллель E4, iPSCs были получены и их генотип E3/E3 был изменен с помощью CRISPR/Cas9 инструмента и они были дифференцированы в монокультуру из возбуждающих нейронов переднего мозга. Генетически отредактированные E3 нейроны оказались менее чувствительными к ionomycin-индуцируемой цитотоксичности по сравнению с не отредактированными E4 нейронами. Было установлено, что возможно использование этого метода для продукции E4 нейронов на высоком уровне из фосфорилированных tau внеклеточно посредством heparin sulfate proteoglycan-зависимого механизма зависимым от изоформы способом [25].

В отношении важной роли хронического воспаления нейронов в патогенезе AD, способствующая воспалению молекула, наз. glia maturation factor (GMF) значительно усиливает свою активность в разных частях головного мозга при AD. Помимо этого, реактивные глиальные клетки, окружающие амилоидные бляшки (APs) в головном мозге AD оказываются центральным местом экспрессии GMF. Воспалительные факторы, такие как GMF и способствующие воспалению цитокины в основном секретируются микроглией. Активация клеток микроглии (макрофаги головного мозга) инициирует каскад событий, которые в конечном итоге приводят к нейродегенерации и патофизиологии AD. Исследователи подтвердили гипотезу, что CRISPR/Cas9-обусловленное редактирование гена GMF управляет элиминацией активации микроглии, приводя к заметным результатам. Было подтверждено, что редактирование гена GMF вызывает подавление пути передачи воспалительных сигналов с супрессией MAPK, которая, как было установлено, усиливает свою активность у AD пациентов [26]. В целом редактирование гена GMF с помощью CRISPR/Cas9 безусловно является новой терапевтической стратегией для AD [27] (Table 1).

Table 1. The novel designed CRISPR/Cas9 for treatment of Alzheimer disease.

Parkinson's disease (PD) является прогрессирующим, связанным с возрастом многофакторным нейродегенеративным заболеванием и одной из наиболее распространенных болезней нервной системы, характеризующиеся не моторными и моторными симптомами [28]. Из-за присутствия неправильно упакованных белков, которые наз. тельцами Lewy и их главного компонента α-synuclein и возникает патология PD, и одним из основных генов, связанных с PD является ген SCNA который кодирует α-synuclein.

Ученые полагают, что существует корреляция между SNP вариантами SNCA и симптомами болезни Паркинсона. Более того, постепенная деградация допаминергических нейронов в substantia nigra (SN) рассматривается как основное патологическое свойство у пациентов, страдающих PD. Однако, комплекс взаимодействий между внешне-средовыми факторами и генетикой человека, которая может вызывать PD, и базовыми механизмами путей и белков, ассоциированных с ними, могут быть идентифицированы с помощью CRISPR/Cas9 [29]. Soldner et al. анализировали варианты SNP в SCNA гене, используя CRISPR/Cas9 и документально установили, что уровень экспрессии SCNA увеличивается благодаря присутствию распространенного варианта в не кодирующем дистальном энхансерном элементе, который действует посредством зависимого от последовательностей связывания транскрипционных факторов [30].

Поскольку инструменты редактирования генома могут вносить вклад в анализ фенотипов PD, соотв., предполагалось, что RISPR/Cas9 является пригодным инструментом, позволяющим исследователям PD генерировать изогенные клеточные линии для моделирования PD. В этом отношении, Arias-Fuenzalida et al. использовали CRISPR/Cas9 и флуоресцентные маркеры, чтобы определить процедуру достижения биаллельных отредактированных по геному популяций клеток. Они обозначили этот метод FACS-assisted CRISPR/Cas9 editing (FACE) и использовали его для получения набора изогенных клеточных линий, представляющих ассоциированные с PD мутации в α-synuclein [31].

Более того, большинство распространенных генетических причин спорадической и семейной PD заключается в присутствии мутаций в leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2), которые индуцируют токсичность в допаминергических нейронах. Величина сложности нейритов допаминергических нейронов снижается в результате использования CRISPR/Cas9 инструментов и редактирования мутантного LRRK2 с помощью CRISPR/Cas9, что снижает показатель семейных и спорадических форм PD [32].

Среди мутаций в гене LRRK2 наиболее распространенной является p.G2019S. Qing et al. , использовали систему CRISPR/Cas9 с нуклеазой обусловленным редактирование генов в LRRK2-G2019S мутации в происходящих от пациентов iPSC (hiPSCs) и использовали piggyBac transposase технологии. Их наблюдения показали, что процент позитивных по tyrosine hydroxylase (TH) нейронов достоверно снижается в LRRK2-G2019S допаминергических нейронах [32].

CRISPR также предоставляет более широкое восприятие взаимодействий разных PD гена , а также распознавание новых апоптических путей, сцепленных с нейродегенеративными процессами при PD. В предыдущем исследовании, THAP11 один из регуляторов гена Parkin, постоянно привлекал большое внимание в CRISPR/Cas9 нокаутных исследованиях с использованием разных типов клеток, чтобы обнаружить ранее не открытые регуляторные сети [33].

Более того, CRISPR/Cas9 была использована для исследования путей воспаления нейронов, участвующих в патогенезе PD, напр., путь передачи сигналов PKCδ, основной менханизм внутриклеточной передачи сигналов, оперирующий с индуцированной с помощью Mn-апоптической гибелью клеток с использованием активации protein kinase C δ, чтобы лучше понять нижестоящий путь передачи сигналов PKCδ , нижестоящий путь, управляющий апоптозом, использована система CRISPR/Cas9, чтобы вызвать нокдаун экспрессии PKCδ в DA нейронах (клетки допаминергических нейронов), и продемонстрировать, что подавление PKCδ существенно задерживает Mn-индуцируемую фрагментацию ДНК [34].

Недавно Gordon et al. показали, что элиминация хемокина, наз. Prokineticin 2 (PK2), которая осуществляется посредством Prokineticin receptor 2, с помощью CRISPR/Cas9, усиливает уязвимость нейронов к нейротоксинам, вызывающим гибель клеток, которые сходны с др. путями воспаления нейронов при болезни Паркинсона. Они также подтвердили, что передача сигналов PK2 возрастает в PD головном мозге после гибели и служит в качестве компенсаторной реакции против нейродегенерации у животных моделей PD и культурах клеток [35].

Хотя CRISPR/Cas9 широко используется для создания сходных клеточных и животных моделей болезней людей, разработка техники CRISPR/Cas9 в качестве терапевтического инструмента для редактирования генов может проложить путь к лечению и нарушений у людей. Можно предположить, что CRISPR/Cas9 система будет корректировать или инактивировать мутации, вызывающие моногенные рецессивные и доминантные негативные нарушения. Инактивация и истощение мутантного гена в допаминергических нейронах PD животных моделей, которые экспрессируют мутантный α-synuclein благодаря конструированию CRISPR/Cas9, действие которой опосредуется с помощью NHEJ [36]. В этом контексте ген SNCA в эмбриональных стволовых клетках людей (hESCs) делетируется с использованием CRISPR/Cas9 и согласно Chen et al. эти клетки дифференцируются (в допаминергические нейроны), и затем замещаются рекомбинантными α-synuclein предварительно сформированными фибриллами (PFFs), чтобы заронить семя формирования Lewy-подобной патологии, как демонстрируют измерения фосфорилирования serine-129 в α-synuclein (pS129-αSyn). Дикого типа нейроны оказались целиком чувствительны к pS129-αSyn-позитивному белку, патологической характеристике телец Lewy при synucleinopathies, тогда как SNCA+/- и SNCAβ/- нейроны обнаруживали значительную резистентность к развитию таких патологических результатов [37].

Имеются в головном мозге специфического типа клетки, наз. микроглиальными клетками, которые действуют как профессиональные фагоциты иммунных клеток и играют жизненно важную роль в обусловленной воспалением нейродегенерации, особенно при PD. В головном мозге, вызывающий воспаление нейронов белок, наз. GMF, экспрессируется обильно и выявляется, что уровень экспрессии этого белка усиливается в SN головного мозга PD [38].

Важность редактирования GMF с помощью CRISPR/Cas9 технологии в клетках микроглии в условиях оксидативного стресса и erythroid 2-related factor 2 (NRF2)/Hemeoxygenase1 (HO-1)-зависимой активации ferritin, было изучено с помощью Selvakumar, Ahmed et al. Нокаут GMF в клетках микроглии ослабляет оксидативный стресс путем понижения притока calcium и продукцию ROS. Более того, отсутствие GMF снижает транслокацию в ядро NRF2, который регулирует активацию ferritin и HO-1, экспрессию nitric oxide synthase 2 (NOS2) и cyclooxygenase 2 (COX2) в нормальных клетках микроглии и в конечном итоге предупреждает микроглию от активации и вызывает снижение медиаторов, способствующих воспалению в головном мозге [39] (Table 2).

Table 2. Overview of the studies on CRISPR/Cas9 editing strategies and Parkinson's disease.

Болезнь Хантингтона является аутосомным нейродегенеративным нарушением, вызываемым экспансией CAG повторов в гене huntingtin (HTT) , который продуцирует аномальный HTT белок. Этот HTT белок является более длинным, чем его нормальная версия из-за добавления нескольких повторов CAG сегментов к этому гену, это приводит к добавлению глютаминовых остатков к белку. Повторы в количестве более 50 остатков глютамина могут становиться причиной. Хотя имеются определенные терапевтические возможности для HD, однако, нет определенного лечения до сих пор [40].

Генотерапия является многообещающим подходом к лечению HD, которые сегодня активно изучаются, а транскрипция ДНК мишени имеет целью понизить уровень аномального HTT белка или использовать не кодирующие РНК для снижения трансляции РНК. CRISPR/Cas9 и zinc finger белки, являются двумя такими подходами генотерапии, которые супрессируют экспрессию мутантного HTT гена путем прямого взаимодействия с ДНК [41]. Исследователи разрабатывают подход с помощью CRISPR/Cas9 лечения болезни Huntington's. Было установлено, что CRISPR/Cas9 -обусловленная инактивация экспрессии эндогенного мутантного HTT (mHTT) в полосатом теле mHTT-экспрессирующих мышей может эффективно снижать mHTT [19]. В др. исследовании, распознаны SNPs, которые являются причинными или облают разрушительным эффектом на PAM мотивы, критические для выбора одного из аллелей для CRISPR редактирования, тогда как др. используется для усиления эффективности Cas9 нуклеазы и использования CRSPR стратегии в терапевтических целях [42]. Было установлено, что присутствие мутации в гене HTT приводит к сенсибилизации type 1 inositol 1,4,5-triphosphate receptor (InsP3R1) и соотв. к утечке кальция в эндоплазматический ретикулум (ER) и к компенсаторному подъему проникновения в neuronal store-operated calcium (nSOC) хранилища. В конечном итоге это приводит к повреждениям синапсов MSNs нейронов в полосатом теле у HD животных моделей [43]. Недавно ученые исследовали потенциальную роль подавления Transient receptor potential canonical 1 (TRPC1) (который является одним из nSOC компонентов) при лечении HD с использованием CRISPR/Cas9 техники и результаты показали улучшение моторной функции и спасение MSN шипов in vitro и in vivo после нокаута гена TRPC1, так что подавление TRPC1 с помощью CRISPR/Cas9 может служить в качестве нейро-защитного тактического воздействия у таких пациентов [44].

Недавнее исследование подтвердило, что 5' untranslated region (UTR) является важным для регуляции синтеза HTT белка. 5' UTR содержит вышестоящую открытую рамку считывания (uORF), которая кодирует потенциальный полипептид из 12 аминокислот, который в uORF внутри 5' UTR может влиять на трансляцию нижестоящей ORF. Присутствие этой uORF, как было установлено, оказывает негативный эффект на экспрессию huntingtin мРНК [45]. Базируясь на этом факте др. исследование показало, что разрушение uORF в 5'UTR мРНК посредством CRISPR-Cas9 может приводить к снижению трансляции продукта с мутантного huntingtin гена в мезенхимных стволовых клетках (MSCs), происходящих от мышиных HD моделей. Kolli N, et al. исследовали ингибирование mHTT , используя двух типов системы CRISPR/Cas9, одна из которых nicks ДНК нетранслируемого региона uORF, а др. система nicks ДНК границы exon1-intron. В этом исследовании, Kolli N, et al. вводили плазмиду в мезенхимные стволовые клетки (MSCs) , выделенные их костного мозга YAC128 мышей, которые несли человеческий mHTT трансген у HD мышиных моделей. Было установлено, что CRISPR/Cas9 системой обусловленное замалчивание mHTT существенно снижает продукцию mHTT в происходящих из костного мозга (BM) MSCs и разрушает границу exon1-intron, это влияет на трансляцию mHTT [46].

Помимо терапевтического использования CRISPR/Cas9 рассматривается также как аккуратный диагностический метод. PCR амплификация повторяющихся элементов, являющихся типичной для Huntington Disease является методом детекции, который , как известно, имеет существенные ограничения в ситуации, когда содержание guanine-cytosine чрезвычайно высокое в регионах, ассоциированных с HD. С целью улучшения метода детекции HD, ученые использовали CRISPR/Cas9 систему, чтобы разработать новый протокол. В этом отношении был использован метод не связанный с амплификацией целенаправленного обогащения, позволяющий изучать повторы тринуклеотидов в HTT в клинических случаях HD [47] (Fig. 2) (Table 3).

e Fig. 2. Schematic diagram of genome editing with CRISPR/Cas9 system. (A) Two different gRNA guide cas9 to designed (guideRNA1 and guideRNA2) induce DNA cleavage at exon1-intron boundary the mutant huntingtin gene (mHTT). (B) CRISPR/Cas9 system. (C) Inhibiting the open reading frame region of the mHTT gene by using the CRISPR/Cas9 system lead to blocking the transcription and decreases the production of mHT.

Table 3. Overview of the studies on CRISPR/Cas9 editing strategies and Parkinson's disease.

Overview of investigation on CRISPR/Cas9-mediated gene editing and Huntington's diseases.

Сегодня редактирование генов с помощью CRISPR/Cas9 становится рутинным методом для всех растительных и животных моделей. Уникальные преимущества CRISPR/Cas9 системы многогранны, связаны с одновременной экспрессией Cas9 со многими sgRNAs [48]. Главным преимуществами системы CRISPR/Cas9 являются простота в организации, легкость в использовании, способность к редактированию множественных генов, умеренность затрат и техника, подходящая к разным способам применения с терапевтическими целями [49]. Потенциальными преимуществами системы CRISPR/Cas9 являются способность к мултиплексному редактированию геном путем использования множественных sgRNA одновременно и параллельно во многих сайтах мишенях, хотя ZFNs и TALENs могут быть использованы одновременно в паре и могут функционировать подобно CRISPR/Cas9 системе [50]. Но ZFNs и TALENs требуют построения белков с использованием большого ДНК фрагмента в 500-1500 пн для каждого нового сайта мишени, тогда как CRISPR/Cas9 легко адаптируется к любой последовательности мишени генома за счет изменения protospacer из guide RNA (20 bp) [50] и ещё одним потенциальным преимуществом системы CRISPR/Cas9 является то, что только один фактор нуждается в специфическом и очень аккуратном преобразовании - это sgRNA, которая значительно снижает время и цену эксперимента, и, наконец, процесс мультиплексного редактирования генома прост и целостен [51,52].

Главным неудобством системы CRISPR/Cas9 является проблема с эффектами вне мишени, которые вызывают геномную токсичность, канцерогенез, геномную нестабильность, нарушения функции генов и эпигенетические нарушения [53]. Недавно сообщалось, что хотя каждый нуклеотид в protospacer играет ключевую роль в специфичности Cas9 и её связывании с сайтом мишенью, однако, одиночное несовпадение часто допускается, а если имеют место многочисленные несовпадения, то иногда и они допустимы и это зависит от их расположения в protospacer, их количества и их нуклеотидов [50,53]. Принимая во внимание, что геномные изменения, вызываемые с помощью CRISPR/Cas9 системы, являются неизменными, эффекты вне мишени д. быть тщательно идентифицированы [49,53]. Используется несколько методов для снижения эффектов вне мишени: величина эффектов вне мишени зависит от композиции и структуры sgRNA, так что sgRNA, которая является уникальной последовательностью в геноме и довольно короткой последовательностью, которая снижает толерантность к несовпадениям, д. быть достаточной [49,54]. Выбор сайта мишени, который не имеет гомолога в остальной части генома, является эффективным способом снижения эффектов вне мишени. Др. способ, который редуцирует эффекты вне мишени - это укорочение sgRNA на 2 - 3 нуклеотида (части protospacer) , поскольку более короткая sgRNA снижает толерантность к возникающему несовпадению и поэтом редуцирует эффекты вне мишени и может оказывать эффект только на мишень [49,50]. Др. важным фактором в снижении эффектов вне мишени является контроль дозы CRISPR/Cas9, которая д. быть тщательно выверена [53]. Инструменты, используемые для внедрения sgRNA и Cas9 в клетки, также влияют на величину активности редактирования гена и величину эффектов вне мишени. Инструменты доставки внутрь клетки включают cell-penetrating-peptide-mediated инструмент доставки, аденовирусный или лентивирусный векторы и не вирусные физические методы (систему инъекции ДНК или РНК). Иммунная реакция на вирусный вектор является важным препятствием для CRISPR/Cas9 System [49,50,53]. Др. проблемами для CRISPR/Cas9 системы являются нежелательные insertions and deletions (INDELs) (<20 bp) , которые редко возникают и если INDELs слишком длинные (свыше 600 bp или 1.5 kb) то они могут приводить к патологическим дефектам [10]. Более того, размер белка Cas9 является ключевой помехой, который больше, чем TALEN мономер и значительно крупнее, чем ZFN мономер и делает доставку Cas9 с помощью вирусных векторов затруднительной [50].

Наконец, с дальнйшим развитием технологии CRISPR/Cas9, исследователи открыли возможность осуществлять сложные модификации генов, сходные с точечными мутациями, инсерции тегов, двойные нокауты и крупные делеции. Чтобы повысить эффективность системы CRISPR/Cas9 важно понять детали этой системы, такие как кристаллическая структура белка Cas9 [55].

Aging and age-related disease by disturbing homeostasis over time increase the risk of many chronic disorders and degenerative conditions, eventually ending with death. Also, epigenetic changes have a key role in age-related disease. In another hand, the accumulation of abnormal proteins and peptides in CNS is one of the most important characters in neurodegenerative diseases such as Alzheimer and Parkinson. Thus, gene therapy by correcting gene sequences, and therefore the proteins involved in these diseases is a suitable strategy for the treatment of neurodegenerative diseases. Studies have shown that the CRISPR/Cas9 system could be a potential tool for genome editing in targeting age-related diseases. It is essential to develop and improve the efficiency of in vivo CRISPR/Cas9 gene-editing before it can be used clinically. As a result, the CRISPR/Cas9 modification tool has several advantages over other methods and tools for improving and treating cell lines or animal models for neurodegenerative disease, infectious diseases, monogenic diseases, cancer, and age-related diseases.