Посещений:
НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫЕ БОЛЕЗНИ



Терапевтические подходы

Published: 01 February 2021 Gene-based therapies for neurodegenerative diseases
Jichao Sun & Subhojit Roy
Nature Neuroscience (2021)

Прошло 20 лет с момента смерти Jesse Gelsinger- относительно здорового 18-летнего добровольца, согласившегося на испытание генотерапии, получившего фатальную иммунную реакцию, запущенную аденовирусным вектором1. За прошедшие годы наблюдался общественный резонанс, переоценка ценностей, нормативные реформы и даже профессиональный отказ исследователей и сторонников генной терапии. Тем не менее, работа в этой области продолжалась, в том числе и стратегии по смягчению вызванной вирусным вектором активации иммунных ответов, которая в конечном итоге унесла жизнь Джесси. Сравнительно недавние успехи по доставке генов и по манипуляциям с генами возобновили интерес к этой области (see timeline in Fig. 1a). Примером такого терапевтического вмешательства стал AVXS-101 (также наз. onasemnogene abeparvovec), генотерапевтический препарат для spinal muscular atrophy (SMA), при этом дети, обреченные на инвалидное кресло и раннюю гибель, обнаруживают удивительные улучшения в жизнеспособности и двигательной функции после единственной внутривенной инъекции adeno-associated virus 9 (AAV9), несущего ген SMN1 2. Однако, необходимо преодолеть значительные препятствия перед генотерапией нейродегенеративных болезней, чтобы она стала широко доступной.

Fig. 1: Timeline of marquee events in the gene-therapy field.

a, Milestones in the development of gene-therapy tools. b, Timeline of key clinical trials in gene-based therapies for neurodegenerative diseases.



Promises and challenges of gene-based therapies for neurodegenerative diseases


Перспективы генотерапии всегда покоятся на двух столпах: способности целенаправленно воздействовать на этиологию и способности "достижения устойчивой коррекции"3. Одиночное и длительно длящееся вмешательство (one and done) особенно привлекательно для болезней, затрагивающих ЦНС в отличие от др. органов, для которых повторные дозы могут быть вполне приемлемы для достижение эффективных терапевтических концентраций, большинство периферически применяемых агентов неспособно пересекать гемато-энцефалический барьер или делают это очень плохо. Напр., человеческая цереброспинальная жидкость (CSF) по отношению к сыворотке содержит BAN2401-a моноклональных антител лишь ~0.04%4. Несмотря на это, малые молекулы и антитела продолжают оставаться главной опорой в клинических испытаниях при нейродегенеративных болезнях и лишь горстка кандидатов на роль генотерапии протестирована (see timeline in Fig. 1b). Проблемы, окружающие генотерапию в ЦНС кратко представлены в Table 1, и недавних обзорах5,6.

Table 1 Comparing gene-therapy strategies for neurodegenerative diseases

Поскольку коррекция одного гена при моногенном заболевании является традиционным взглядом на генную терапию, ее целесообразность при заболеваниях сложной этиологии, таких как нейродегенеративные заболевания, иногда ставится под сомнение. Однако, почти все терапевтические стратегии, базирующиеся на генах или нет, сконцентрированы на одиночной мишени; напр., почти все испытания при AD нацелены или на amyloid- β (A β) или tau7. Более того, путем модулирования уровней гена или белков или др. физиологических свойств эндогенных белков, базирующиеся на генах терапии применяются к спорадическим нейродегенеративным болезням. Постоянство некоторых базирующихся на генах терапий имеет как преимущества, так и риски. Однажды осуществленные геномные модификации, закрепленные в ДНК, они могут оказаться необратимыми, особенно в пост-митотических нейронах. Каждая генотерапия должна осуществляться со своими собственными предосторожностями, напр., эффекты вне мишени при редактировании ДНК или РНК , и персистенция экзогенных белков, таких как бактериальная Cas9. Тщательное рассмотрение рисков и преимуществ и будет определять их клиническое использование, как и в случае с др. относительно устойчивыми вмешательствами, таким как хирургические процедуры.
Безопасность, эффективность и избирательность доставки генных продуктов в ЦНС остаются проблемой. Хотя стратегии невирусной доставки, такие как наночастицы и рибонуклеопротеиновые комплексы, используются6, до сих пор, их пригодность для ЦНС остается неясной. AAV векторы безусловно наиболее подходящие кандидаты на этой арене, со строгим тропизмом к нейронам, широким распространением и с желаемыми профилями безопасности у многих видов, включая не человеко-образных приматов (NHPs)5 - хотя и имеются определенные предостережения. Развитие преобразованных AAV капсид, чтобы усилить нейротропизм, также быстро возникло на арене8. Многие генотерапии ЦНС требуют устойчивой доставки экзогенного трансгена в течение всей жизни, а AAVs были подходящими для этого. В отличие от митотически активных клеток, в которых трансдуцированные AAVs постепенно теряются, т.к. они неспособны интегрироваться в геном хозяина, экспрессия AAV может сохраняться декадами в пост-митотических клетках, подобных нейронам9, хотя лежащие в основе механизмы всё ещё неясны. Наша способность определять экспрессию трансгена у живых пациентов также ограничена из-за отсутствия биомаркеров и затруднений, связанных с достижением тканей головного мозга.
Хотя AAVs были использованы в более чем 200 исследованиях людей с участием тысяч пациентов10 и оказались в общем безопасными, но все же некоторые проблемы возникли, в основном связанные с активацией иммунного ответа хозяина на вирусные белки. Во-первых, капсидные белки рекомбинантных AAV частиц напоминают капсиды натуральных вирусов, которые постоянно атаковали людей и к которым были выработаны нейтрализующие антитела у хозяина, которые могли ослаблять эффективность трансдукции11. Напр., в первом испытании AVXS-101 16 пациентов были отобраны и 1 был исключен из-за повышенного титра антител anti-AAV9 (более1:50)2. Экзогенные AAV капсиды также могут активировать цитотоксические T лимфоциты, которые могут устранять трансдуцированные клетки12 или генерировать нейтрализующие антитела путем запуска гуморального иммунитета, препятствуя тем самым повторному использованию вектора13. Определенные AAV серотипы, такие как AAV1 и AAV5 обладают высоким тропизмом в отношении антигены-презентирующих клеток, могут запускать адаптивные иммунные реакции14. Др. проблема AAVs связана с активацией Toll-like рецепторов, которые воспринимают капсиды или геном вектора и индуцируют реакцию врожденного иммунитета и продуцируют способствующие воспалению цитокины15. Если трансгены, вносимые с помощью генотерапии, кодируют чужеродный белок, такой как не человеческий белок, или замещающий белок, в нулевой геномный фон, то возникают нейтрализующие антитела и цитотоксические T лимфоциты16. Недавно испытание AAV генотерапии при миотубулярной миопатии, два из трех пациентов, получавшие высокую дозу, умерли от тяжелой печеночной токсичности, хотя обнадеживающие результаты наблюдали у пациентов, принимавших низкие дозы17. Др. вызывающий беспокойство аспект, подчеркиваемый недавними исследованиями - это применение AAVs с помощью интратекальных или внутривенных инъекций, которые могут вызывать патологию ганглиев дорсальных корешков, по-видимому, независимо от иммунной реакции18. Сложные взаимоотношения между AAV векторами и иммунной реакцией хозяина интенсивно исследуются вместе с компенсационными мерами19.

Toolbox of gene manipulations20


Кратко обсудим технологию терапии нейродегенеративных заболеваний (Box 1).

Box 1 Gene-editing tools



Canonical DNA editing


Редактирование обеспечивается двумя компонентами - нуклеазой, которая разрезает ДНК и синтетического пептида или последовательности РНК, которая наводит нуклеазу на специфический сайт генома. Эндогенные процессы репарации являются склонными к ошибкам, обычно приводят к нарушению рамки трансляционного считывания, распаду нонсенсных мРНК и эффективному нокауту генов, наз. NHEJ (Fig. 2a). Напротив, в присутствии экзогенной донорской матрицы, HDR может вставлять желательные последовательности или точковые мутации в геном хозяина (Fig. 2b), однако, это неэффективно, особенно в нейронах. ZFNs и TALENs используют искусственно разработанные аминокислоты, чтобы направлять нуклеазы, тогда как базирующаяся на CRISPR система использвет синтетические последовательности для gRNA (Fig. 2c-e).

Noncanonical DNA editing


Хотя редактирование генов обычно приводит к нокауту гена и белка, CRISPRs также использована для изменения одиночных нуклеотидов и доменов ДНК или для модулирования экспрессии гена. Напр., CRISPR-осуществляемая эксцизия домена может удалять патологические мутации или небольшие участки ДНК, если они расположены в регионах, которые, которые обычно освобождают от распада nonsense мРНК (Fig. 2f; see main text for details). Репрессоры или энхансеры транскрипции, прикрепленные к dCas9, могут быть направлены на специфические сайты генома с использованием gRNAs, приводя к ингибированию (CRISPRi) или активации (CRISPRa) (Fig. 3a,b). Одиночные пары ДНК в геноме могут быть изменены с помощью редактирования оснований с использованием deaminase белков, нагруженных на dCas9 и направляемых на специфические сайты с помощью gRNAs (Fig. 3c,d). Простое редактирование расширяет базовое редактирование, позволяя более широкую передачу генетической информации в геном хозяина (Fig. 3e).

RNA editing


В отличие от редактирования оснований ДНКЮ редактирование РНК является временным, снижающим шансы нежелательных долговременных последствий; однако, необходимость повторного использования является препятствием. ASOs являются синтетическими последовательностями, которые соединяются с РНК и влияют на их созревание разными способами (Fig. 4). Cas13d является посторонним Cas энзимом, который соединяется и расщепляет мРНК в клетках млекопитающих, приводя к нокдауну без использования PAM последовательности.

Gene expression


Внесение экзогенных генов в ЦНС является наиболее прямым подходом для генотерапии. Доставляемые гены могут восстанавливать потерянную функцию гена из-за патологической мутации, как в случае гена SMN1 при SMA2. Альтернативно, гены могут доставлять нейротрофные факторы, способствующие жизнеспособности нейронов, как в случае AD и болезни Parkinson's (PD), или метаболические энзимы, чтобы восстанавливать дисбаланс нейротрансмиттеров, как в случае PD.

DNA editing


Инструменты редактирования ДНК могут влиять на экспрессию генов или корректировать патогенные мутации и и начинается перенос их в клинику21. В целом существуют два элемента: домены, связывающие ДНК, которые распознают специфические геномные последовательности, и нуклеазы, которые вызывают разрезы двойной нити ДНК (DSBs). DSBs репарируются с помощью NHEJ, которая является эндогенным склонным к ошибкам механизмом, приводящим к инсерции последовательности или делеции (INDELs) в рамке считывания, это обычно приводит к мутациям сдвига рамки считывания и образованию преждевременных стоп-кодонов (PTCs), приводя в конечном итоге к нокауту гена мишени (Fig. 2a). Альтернативно в присутствии экзогенной матрицы, происходит естественная homology-dependent repair (HDR) , которая может использоваться для инсерции желательной последовательности или точковых мутаций в геном хозяина (Fig. 2b). Три основные редактирующие ДНК нуклеазы - zinc-finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) и CRISPR-associated nucleases.

Fig. 2: Mechanisms of genome editing by engineered nucleases.

a, DSBs (arrowhead) in genomic DNA are repaired by NHEJ, which introduces INDEL mutations (red dash lines) that typically lead to a change in the reading frame, PTC and disrupted gene function. b, Alternatively, in the presence of a donor template, HDR mechanisms lead to the precise insertion or modification of DNA (green lines). c, ZFNs are composed of three to six zinc finger domains (color circles), each recognizing three nucleotides. The zinc finger domains on opposite strands of DNA bring two Fok1 endonuclease domains together, inducing Fok1 dimerization and DSB. d, TALENs have 16-20 TALE monomers, each recognizing a single nucleotide. A pair of TALENs induces Fok1 dimerization and DSB. e, The CRISPR-Cas9 system contains a synthetic gRNA and the nuclease Cas9. The gRNA has two domains: a programmable crRNA sequence recognizing the genomic target and a tracrRNA sequence for Cas9 binding. f, The location of PTCs can determine the transcription fate. Only PTCs residing >50-55 nucleotides upstream of the last exon-exon junction are expected to induce NMD and degradation of the mRNA. The last exon is exempt from NMD, and PTCs in this 'NMD-insensitive region' should effectively lead to protein truncations (see main article for details).

ZFNs and TALENs




Fig. 3: Noncanonical CRISPR tools.

a,b, For transcriptional modulation, a nuclease-deactivated Cas9 (dCas9) is fused to a transcriptional inhibitor (a) or transcriptional activator (b) to inhibit or boost transcription, respectively (RNAP, RNA polymerase). c,d, In base editing, the dCas9 or nCas9 (a Cas9 nickase) is fused to an adenine deaminase (c) or cytosine deaminase (d) that changes A:T base pairs to G:C or C:G base pairs to T:A. e, In prime editing, the nCas9 is fused to a reverse transcriptase that copies the part of pegRNA sequence into the target site (dark red lines).

Fig. 4: Mechanisms of ASOs.

In normal RNA splicing, the newly synthesized precursor mRNA (pre-mRNA) becomes a mature mRNA by RNA splicing, a process whereby introns (thin lines) are removed and exons (colored boxes) are ligated. In splice inclusion, ASOs bind to and block the activity of splicing enhancers on the pre-mRNA, leading to the inclusion of an exon that would normally be excluded, thereby generating a modified protein with additional peptide sequences. In splice exclusion, ASOs bind to the exon-intron splicing junction on the pre-mRNA to skip an exon, leading to a truncated protein. In mRNA knockdown, ASOs bind to mRNAs and activate RNase H, resulting in mRNA cleavage and degradation. In translation inhibition, ASOs bind to the 5' untranslated region or coding regions of the mRNA and block translation.



CRISPR-mediated canonical applications-NHEJ and HDR


...

CRISPR-mediated domain excision


Патологические мутации в интронах могут быть вырезаны двумя gRNAs на каждой из сторон мутации, удаляя тем самым аберрантные нуклеотиды. Эта стратегия была использована в Phase 1/2 клинического испытания при Leber congenital amaurosis 10 (LCA10; ClinicalTrials.gov identifier NCT03872479), который вызывает наследственную дегенерацию сетчатки27. При LCA10, интронная A-to-G мутация в CEP290 мРНК создает сплайс-донорский сайт, который добавляет лишний экзон. Две gRNAs на каждой из сторон мутации вырезают этот дефект, чтобы восстановить нормальный сплайсинг мРНК. Один AAV5 вектор доставляет две gRNAs и более короткую Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) в глаз с помощью субретинальных инъекций21.
Вместо устранения трансляции белка путем запуска NMD с PTC-содержащей мРНК, CRISPR редактирование может использоваться для избирательного прекращения трансляции в PTC сайте, чтобы продуцировать укороченный белок (Fig. 2f). Эта стратегия эксцизии домена может быть использована для элиминации небольших патогенных участков, сохраняя при этом большую часть белка и обеспечивая физиологическую функцию. Это недавно было продемонстрировано с помощью CRISPR редактирования, по крайней мере, путем эксцизии ~36 аминокислот из белка амилоидного предшественника (APP), который участвует в возникновении AD28. Эта стратегия предоставляет транскрипционные правила ведения NMD (rev. 29) путем внесения PTCs в последний экзон, это, как известно, защищает от nonsense распада.

CRISPR-mediated transcriptional modulation


При CRISPRi, каталитически dead Cas9 (dCas9) или никаза Cas9 (nCas9, которая способна только на генерацию разрывов одиночной нити) слита с репрессорами транскрипции, чтобы подавлять транскрипцию гена (Fig. 3a). Репрессия также может быть достигнута с помощью ферментов, которые модифицируют гистоны и изменяют структуру хроматина путем редактирования эпигенома. Т.к. снижение экспрессии генов является логической стратегией для многих нейродегенеративных болезней - избыточности α-synuclein, APP, tau и huntingtin - т.е. обещающий подход. Однако, остаются важные вопросы безопасности и эффективности. CRISPRa является стратегией, аналогичной активации эндогенных генов путем слияния dCas9 или nCas9 в активатором транскрипции или эпигеномными регуляторами (Fig. 3b). Хотя эти крупные Cas9 эффекторные белки в CRISPRi и CRISPRa вызывают проблемы с упаковкой AAV с клиническим использованием, которые можно преодолеть, используя меньшего размера SaCas9 (ref. 30).

CRISPR-mediated base editing and prime editing


Большинство человеческих патологических вариантов - включая наследственные нейродегенеративные болезни - обусловлены точковыми мутациями одиночных пар31. Редакторы оснований ДНК являются химерными белками, состоящими из dCas9 или nCas9, слитой с deaminase белком, способным деаминированию и изменению cytidine или adenine пары оснований. Редакторы оснований cytosine обусловливают конверсию C:G в T:A, тогда как редакторы оснований adenine превращают A:T в G:C32,33 (Fig. 3c,d). Использование редактирования оснований ограничивается доступностью подходящих PAM последовательностей и нежелательными заменами нуклеотидов вблизи места мишени, это обусловлено широким набором активностей деаминаз. Не было получено ни одного Cas9 варианта с более широкой совместимостью с PAM и ни одного варианта cytidine deaminase с более узким окном активности34. Хотя крупные размеры редакторов оснований делают упаковку AAV для доставки in vivo затруднительной, недавнее исследование с использованием двойных AAVs для доставки разделенных редакторов оснований, которые впоследствии восстанавливаются in situ с помощью trans-splicing inteins35. Эффекты вне мишени - особенно нежелательное редактирование РНК -были описаны при редактировании оснований36, но не был описан ни один редактор оснований со сниженной активностью вне мишени37. Prime редактирование расширяет концепцию редактирования оснований благодаря более широкой возможности целенаправленного воздействия на геном, большему количеству возможностей генетического ремоделирования и повышенной точности. Prime-editing gRNA (pegRNA) содержит как обычную нацеленную на ДНК последовательность, так и желательную для редактирования последовательность, чтобы заместить мишень, нуклеотиды геномной ДНК38. Сопровождающая nCas9 слита с обратной трансриптазой, которая запускает (primes) обратную транскрипцию pegRNA, которая переносит кодируемую генетическую информацию с pegRNA - включая инверсии, делеции и превращения оснований - целенаправленно на геном (Fig. 3e).

RNA editing


Базирующееся на РНК редактирование изменяет экспрессию гена на уровне транскрипта. Т.к. РНК преходящее образование, то существует меньший риск устойчивого вредного эффекта, который служит существенным терапевтическим вызовом для этой технологии. Однако, необходимы повторные применения процедуры - обычно посредством intrathecal инъекций - это мешает клиническому использованию. Хотя антисмысловые олигонуклеотды (ASOs) были описаны ещё 40 тому назад, клиническое использование базирующейся на РНК терапии страдает от многочисленных побочных эффектов из-за ограниченной эффективности, отсутствие специфичности и вредных эффектов вне мишени39. Однако, успехи химических модификаций, доставка пузырьков и редактирующих РНК инструментов преобразили эту область, приведя к нескольким терапевтическим агентам, которые подходят для клиники40. Технологии редактирования, базирующиеся на РНК, были недавно рассмотрены в обзорах39-41; здесь рассмотрим только две стратегии, касающиеся нейродегенеративных болезней.

ASOs


ASOs являются последовательностями синтетических нуклеиновых кислот, которые связывают РНК посредством Watson-Crick спаривания оснований и влияют на созревание pre-mRNAs в зрелые мРНК и белки. Сплайсинг pre-mRNA является физиологическим процессом, с помощью которого интроны удаляются, а экзоны соединяются, давая зрелую мРНК, которая транслируется в функциональный белок. Этот процесс регулируется с помощью экзонных и интронных энхансеров и silencers, при этом энхансеры способствуют включению экзонов, а сайленсеры способствуют исключению экзонов. ASOs могут действовать несколькими способами, чтобы повлиять на эти процессы; напр., обычно вырезаемый экзон может быть включен ( splice inclusion) или экзоны, которые обычно транслируются могут быть исключены ( splice exclusion или пропуск экзонов) (Fig. 4).

Cas13d


В отличие от др. Cas белков, которые воздействуют на ДНК, Cas13 является отличающимся энзимом, который соединяется и расщепляет РНК в клетках млекопитающих, приводя к нокдауну генов. Специфичность обеспечивается последовательностью спейсера, комплементарного РНК мишени, и короткой шпилькой, которая рекрутирует Cas13 (ref. 42). Поскольку отсутствует потребность в PAM сайтах, то Cas13 оказывается более гибким, чем др. обычные Cas белки. Из 4-х подтипов - Cas13a, Cas13b, Cas13c и Cas13d - Cas13d является наименьшей и может быть упакована в одиночный AAV для использования in vivo43. Помимо нокдауна РНК, Cas13 энзимы оказались адаптированы к регуляции сплайсинга РНК и редактированию оснований. Каталитически неактивные формы Cas13d (dCas13d) были также использованы для модуляции сплайсинга эндогенных tau транскриптов и коррекции аномального соотношения 4R/3R tau изоформ в iPSCs, получаемых от пациентов с frontotemporal деменцией43. Для редактирования оснований РНК dCas13b сливается с deaminase энзимом для целенаправленных замен нуклеотидов44.

Specific applications of gene-based therapies for neurodegenerative diseases


Проходящие клинические испытания по генотерапии и потенциальное использование базирующихся на генах терапевтических стратегий для избранных нейродегенеративных болезней (Tables 2 and 3).

Table 2 Gene therapy trials for AD and PD

Table 3 Gene therapy trials for HD, SMA and ALS



Spinal muscular atrophy


SMA является прогрессирующей, моногенной болезнью нижних двигательных нейронов и одной из ведущих генетических причин смертности детей. Генетика и клинические фенотипы сложные, но в большинстве случаев SMA вызывается гомозиготной делецией в гене SMN1, кодирующем белок survival motor neuron (SMN)45, лежащие в основе причины уязвимости двигательных нейронов неясны. У людей, ген паралог, наз. SMN2 также продуцирует SMN белок, но на более низком уровне из-за одиночной замены нуклеотида в гене SMN2, которая изменяет сплайсинг и исключает экзон 7 из ~90% транскриптов, это приводит к укорочению мРНК и укорочению SMN белка, который быстро деградирует46. Поскольку пациенты с SMA лишены функционального гена SMN1, то тяжесть симптомов и возраст начала болезни предопределяется числом копий гена SMN2 . SMA типа 1 является наиболее распространенной формой этой болезни, с гипотонией и моторной задержкой до 6 мес. возраста и гибелью или переходом на механическое вентилирование к 2 годам. Такие пациенты обнаруживают тенденцию иметь две копии гена SMN2. пациенты с тремя или 4 копиями SMN2 обладают менее выраженными симптомами, которые возникают позднее (6-18 мес. возрасте для типа 2, и ~3 года для типа 3). Менее 5% пациентов имеют 4-8 копий SMN2 (type 4) и имеют умеренную форму болезни с началом у взрослых. Недавно US Food and Drug Administration (FDA) одобрило три модифицирующие болезнь генотерапии, которые повышают уровни белка SMN, или за счет усиления эффективности SMN2 или за счет внесения функциональных копий SMN1 (Table 3).

Modulating SMN2


При базирующемся на РНК подходе, ASOs были использованы для целенаправленного воздействия на экзон 7 SMN2, предупреждая его исключение во время сплайсинга и впоследствии увеличивая уровни белка SMN47. После успешности Phase 1/2 испытаний с intrathecal доставкой ASOs48, была начата Phase 3 в 2014, показавшая достоверное увеличение двигательной активности у 51% детей с SMA (37 из 73)49, приводя к одобрению SMN2 ASO (наз. nusinersen) FDA. Пациенты с ранним началом лечения переносят его лучше , это подчеркивает важность ранней диагностики49. Фазы 2 испытание также показало обнадеживающее улучшение двигательной активности у детей с начальной симптоматикой SMA50. Эффективность nusinersen у более старших пациентов сегодня исследуется. Потребность в повторных intrathecal введений является ограничением для ASOs в клинических условиях, а недавно разработаны принимаемые орально малые молекулы, предназначенные преимущественно для модуляции сплайсинга SMN2 (risdiplam) также разрешены FDA51. Напротив, базирующиеся на ДНК стратегии, подобные CRISPRs, могут вызвать устойчивые изменения в SMN2, чтобы увеличить экспрессию SMN. Хотя и экспериментальные, недавние исследования использовали стратегию CRISPR-Cpf1 на iPSCs, чтобы преобразовать ген SMN2 в SMN1-подобный ген посредством HDR52.

Expressing SMN1


В важном ген-терапевтическом клиническом испытании 15 детей с SMA type 1 получали однократно внутривенную инъекцию AAV9 вектора, несущего ген SMN1 (AVXS-101). Все пациенты в этом испытании выжили и не имели событий в течение 20 месяцев по сравнению с исторической выживаемостью 8%2. Некоторые пациенты, получавшие более высокую дозу, обнаруживали беспрецедентное улучшение симптоматики, включая способность ходить без помощи, однако они подверглись лечению в очень молодом возрасте2. Последующее 2-летнее наблюдение за когортой, получивших высокую дозу, показало снижение необходимости в поддержке дыхания и кормления и улучшение моторной функции53, и AVXS-101 был одобрен FDA в 2019. Несмотря на этот оптимизм, необходимо с осторожностью обращаться с AAVs, и необходима критическая дальнейшая клиническая разработка этих векторов. Во время испытания у 4-х пациентов выявлено повышение уровня transaminase в печени, хотя не обнаружено дополнительных нарушений функции печени2. Более того, недавнее исследование показало, что внутривенная инъекция AAVhu68, экспрессирующего SMN (AAV вектор, подобный используемому AVXS-101 в испытании) привела к тяжелой печеночной токсичности и к дегенерации ганглиев дорсальных корешков в NHPs и у поросят, потребовавшие эутаназии во многих случаях18. Длительные терапевтические эффекты и осложнения AVXS-101 пока неизве6стны.

Alzheimer's disease


Затрагивается почти каждый из 9 стариков в США при отсутствии болезнь-модифицирующей терапии, AD вообще-то является наиболее выраженным примером нейродегенеративного заболевания с неудовлетворенной потребностью. Современными разрешенными FDA воздействиями удается смягчить симптоматику, в лучшем случае, и многие клинические испытания с малыми молекулами и антителами оказываются неутешительными7. Помимо neurotrophins, три гена сцепленные с AD, могут в принципе стать мишенями для генотерапии: APP, MAPT и APOE. Ген APP кодирует APP, который расщепляется с помощью β- и γ-secretases, чтобы в конечном итоге сгенерировать A β и имеются обширные доказательства связи APP с патогенезом AD (rev. 54). APP мутации и дупликации, наблюдаемые при семейной AD, и мутации APP (Icelandic) обнаруживаются при спорадической болезни55. Недавние исследования подтвердили, что др. AD факторы риска, подобные APOE4, могут активировать транскрипцию APP transcription56, а генетические доказательства у людей с синдромом Down строго указывают на участие избыточной экспрессии APP при AD, сцепленной с трисомией-21 (ref. 57). MAPT кодирует белок tau, который является интегральным компонентом нейрофибриллярных узелков и считается терапевтической мишенью при AD58.

Expressing growth factors


Доставка гена NGF (кодирующего фактор роста нервов ) в холинергическое nucleus basalis of Meynert с помощью прямых и билатеральных инъекций AAV2 в головной мозг стало одним из первых ген-терапевтических клинических испытаний при AD59. NGF является эндогенным нейротрофным фактором, регулирующим рост и жизнеспособность холинергических нейронов посредством функциональной активации рецептора TRKA59. Пре-клинические исследования на животных моделях, включая NHPs, показали, что экзогенные NGF оказываются благоприятными, это указывает на их пригодность в испытаниях на людях60. Однако, Phase 1/2 клинических испытаний при mild-to-moderate AD продемонстрировала безопасность и долговременность экспрессии AAV2-NGF, при этом не обнаружено изменений в когнитивной способности61. Сравнительно недавно, исследования головного мозга умерших в ходе этого исследования показали, что инъецированный AAV2-NGF не достигает мишеней холинергических нейронов в nucleus basalis of Meynert62; т.о., эффективность этого терапевтического подхода остается неясной. В отличие от испытаний на людях, проведены успешные пре-клинические исследования на животных с NGF с использованием инфузионных насосов и планируются в будущем исследования с введением brain-derived neurotrophic factor (BDNF) в entorhinal кортекс (AAV2-BDNF) при использовании в реальном времени MRI guidance и convection-enhanced доставки63.

Targeting MAPT


ASOs против гена MAPT, кодирующего tau, были использованы, чтобы снизить уровень MAPT мРНК и белка tau на животных моделях. Такие ASOs ослабляют фосфорилирование и агрегацию tau, предупреждают гибель нейронов и увеличивают жизнеспособность трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий мутантный (P301S) tau, и снижают уровни tau в ЦНС при NHPs64. Идет клиническое испытание с использованием этой стратегии (NCT03186989). Альтернативно, ASO-обеспечиваемый пропуск экзонов может снижать MAPT мРНК и уровень белка tau в клетках и in vivo65. Острый нокдаун tau у взрослых мышей приводит к дефициту обучения и памяти66, и появляются доказательства, указывающие, что tau выполняет роль а регуляции пресинаптической функции67. Хотя эти сообщения потенциально касаются этого, но маловероятно, что любая стратегия будет вызывать глобальное истощение tau, и снижение токсичности будет лишь частичным.

Targeting APOE


У людей существуют три apolipoprotein E (APOE) полиморфных аллеля - E2, E3 и E4 - предопределяющие риск AD. Тогда как вариант APOE4 является единственным наибольшим фактором риска для спорадических AD, APOE2 оказывается защитным68. Исследования животных моделей указывают, что APOE4 сцеплен с amyloid и tau патологией69. Одной из стратегий генотерапии является подъем уровней защитного APOE2 в головном мозге. В самом деле, экспрессия APOE2 с помощью вирусных векторов ослабляет Aβ патологию у amyloid-based мышиных моделей70. AAV-обеспечиваемая доставка APOE2 также была эффективной и безопасной при NHPs71, а Phase 1 испытания AAV-APOE2 (доставляемого в CSF с помощью инъекций в желудочки) как ожидается начнется скоро (NCT03634007). Человеческие APOE4 и APOE3 отличаются только одной аминокислотой в позиции 112 (ref. 68). Хотя существующая технология не может широко генерировать изменения одиночных нуклеотидов в головном мозге, исследования показывают, что превращение APOE4 в APOE3 с помощью редактирования гена в iPSCs или органоидах мозжечка может устранять связанные с AD проявления72 и может быть одним из подходов генотерапии в будущем.

Targeting APP


Ген APP выполняет центральную роль в спорадических и семейных AD, а замалчивание или модулирование APP является привлекательной возможностью для генотерапии. Используя CRISPR-Cas9, недавно исследовали избирательно инактивированный мутантный для семейного APP Шведский аллель в клетках и in vivo, не затрагивая соотв. аллель дикого типа73. В др. исследовании использовали ASOs, чтобы пропускать предпоследний экзон (экзон 17) в APP74. Экзон 17 кодирует сайт расщепления γ-secretase и примерно половину трансмембранного домена в APP, поэтому делеция этого экзона упраздняет закрепляющуюся на мембране часть APP и ослабляет секрецию Aβ в клетках и in vivo74 (Fig. 5a). Однако, удаление части APP, отвечающую за прикрепление к мембране, как и ожидалось устраняет физиологические функции. Также APP ASOs генерируют аномальные белки слияния APP, которые быстро секретируются из клеток74 (Fig. 5a), и такие ненатуральные последовательности могут оказывать вредные эффекты, которые ещё не исследованы. APP эволюционно законсервированы в царстве животных и участвут в синаптической пластичности75. Недавнее исследование с использованием NHEJ-based стратегии эксцизии CRISPR-Cas9 ДНК, чтобы индуцировать PTCs в последнем экзоне (exon 18) в APP, укорачивающей на ~36 аминокислот и элиминирующей пентапептид YENPTY эндоцитозного мотива, который запускает амилоидогенный путь28. Как ранее было отмечено правило транскрипции делает последний экзон нечувствительным к NMD (Fig. 2f), т.о., PTCs в этом регионе не деградируют мРНК, но приводят к укорочению белка. N конец и трансмембранные домены APP, которые, как полагают, играют роль в физиологии аксонов и синапсов, остаются интактными в этих обстоятельствах (Fig. 5b) и физиологические функции, по-видимому, остаются неизменными28. Более того, этот подход также активирует путь α-расщепления, который, как известно, выполняет защитную роль при AD75 (Fig. 5c,d). Соотв., С конец APP обнаруживает обширные микро-удвоения, которые приводят к микро-гомологии, обусловленной соединением концов76 и точными исправлениями после редактирования генов, которое делает их подходящей мишенью. Экспрессия нейрозащитных фрагментов APP, таких как растворимые APPα (sAPPα) также может оказаться прекрасной терапевтической возможностью при AD77.

Fig. 5: ASO and CRISPR-based editing strategies to modulate APP cleavage products.

a, Left: schematic showing the transmembrane domain and C terminus of APP, with corresponding exons (small arrows with numbers denote amino acids; APP-695 numbering). Right: the ASO strategy leads to 'skipping' the APP exon 17, leading to a protein that lacks theγ-secretase cleavage site and a portion of the transmembrane domain and, consequently, results in less Aβ secretion74. Sun et al.28 used a NHEJ-based CRISPR-Cas9 strategy to introduce PTCs in the last exon (exon 18) of APP. Since transcriptional rules dictate that the last exon is exempt from NMD, this method does not lead to mRNA decay, but effectively truncates the last ~36 amino acids of APP that includes an endocytic pentapeptide (YENPTY) motif that is known to trigger APP β-cleavage (see ref. 28 for more details). b-d, Data from experiments that edited the APP C terminus with CRISPR showing attenuation of APP ?-cleavage and upregulation of protective β-cleavage. b, Human iPSC-derived neurons (wild-type (WT), or isogenic APPV717I knock-in) were transduced with lentiviral vectors carrying APP-gRNA/Cas9 to edit the C terminus of APP and then immunoblotted with C (C-term) and N terminus (N-term) antibodies (γ-secretase inhibitor was added to prevent further cleavage of β-fragments). Note selective attenuation of APP signal on western blots with the C-terminus antibody (Y188) after CRISPR editing (hu-APP-sgRNA, a single guide-RNA targeting human APP). c, Immunoblotting of secreted sAPPα from the media of iPSC neurons, treated as described in b. Note the increased sAPP? in edited samples, indicating upregulation of protective APP -cleavage. d, ELISA of secreted Aβ from media, treated as described in b. Note the decreased Aβ in CRISPR-treated samples (significance determined with two-tailed t-test, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001). Panels b-d reproduced from ref. 28, shared under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.



Parkinson's disease


Хотя APD является мульти-системным нарушением, классические симптомы ригидность, тремор и гиперкинезия в основном обусловлены потерей dopaminergic нейронов с substantia nigra (SN) pars compacta, это приводит к дисбалансу подавляющих и возбуждающих путей в nigrostriatal проекциях78. Современным лечением является только облегчение симптоматики, имеются значительные побочные эффекты и неостановимая прогрессия болезни. Локальная природа патологии SN при PD уже давно рассматривается как цель генотерапии, которая могла бы восстановить дисбаланс нейротрансмиттеров, повысить жизнеспособность нейронов или целенаправленно воздействовать на гены, непосредственно связанные с болезнью.

Modulating neuronal signaling


Базирующаяся на AAV генотерапия была использована для усиления активности передачи допаминергических сигналов при PD. Путь синтеза dopamine регулируется тремя скорость-ограничивающими энзимами - GTP cyclohydrolase 1 (GCH1), tyrosine hydroxylase (TH) и aromatic amino acid DOPA decarboxylase (AADC) - при этом AADC выступает как энзим финальной ступени в продукции dopamine. Клинические испытания с AAV2-AADC продемонстрировали безопасность, стабильность экспрессии вплоть до 4 лет и скромное улучшение симптоматики79,80. Более целенаправленная доставки AAV2-AADC при NHPs с помощью real-time MRI наведения также была безопасной и хорошо переносимой81, а клиническое испытание на людях (NCT03065192) было начато недавно. Наконец, базирующаяся на лентивирусе генотерапия lentivirus-based gene therap (наз. ProSavin) доставляет все три скорость ограничивающих энзима (TH, AADC and GCH1), а также была запущена Phase 1/2 испытаний, с последующей проверкой, выявила умеренное улучшение двигательной функции82. Снижение striatal dopaminergic тонуса при PD приводит к гиперактивности glutamatergic subthalamic nucleus (STN), а вливание агониста GABA - главного ингибирующего нейротрансмиттера в головной мозг - приводило к смягчению гиперактивности в STN и PD-подобных симптомов при NHP болезни у модельных животных83. В преклинических исследованиях, активация GABA посредством избыточной subthalamic экспрессии glutamate acid decarboxylase (GAD), энзима, катализирующего синтез GABA, снижало PD-подобные симптомы у крыс и NHP моделей84,85. Phase 1/2 клинических испытаний с инъекциями AAV2-GAD в STN, показала, что генотерапия хорошо переносится и снижается симптоматика PD86,87, с эффектами сохраняющимися до года88.

Expressing neurotrophic and regenerative factors


Два обнадеживающих кандидата поддерживают жизнеспособность dopaminergic нейронов среднего мозга, это glial-cell-line-derived neurotrophic factor (GDNF) и neurturin (NRTN)89. Пре-клинические исследования показали, что инъекции AAV-GDNF в putamen грызунов и NHP моделей хорошо переносятся90,91, хотя двухсторонние SN инъекции вызывают потерю веса у пожилых обезьян91. Далее Phase 1 клинических испытаний по определению безопасности билатеральных инъекций to AAV2-GDNF в putamen сейчас происходят (NCT01621581 и NCT04167540). Касательно NRTN, Phase 1 клинических испытаний по доставке AAV2-NRTN в putamen переносилась нормально92, но не улучшала двигательные функции93. Анализ умерших показал, что хотя экспрессия NRTN была повышена в месте инъекции в putamen, но не обнаружено усиления активности в SN94, скорее всего, это обусловлено отсутствием ретроградного транспорта NRTN или неадекватной трансдукцией. Хотя последующее клиническое испытание по доставке более высоких доз AAV-NRTN непосредственно в SN, пока ещё не привело к клиническому улучшению двигательной функции95. Возможной причиной ограниченности эффекта GDNF и NRTN при PD может быть то, что некоторые пациенты с PD обнаруживали пониженную экспрессию Ret - рецептора для NRTN и GDNF; т.о., эти трофические факторы не могут выступать как защита посредством Ret96. Генотерапия может также использоваться, чтобы улучшать генерацию новых нейронов, как это было продемонстрировано в недавнем экспериментальном исследовании в химически индуцированной модели PD, где базирующаяся на ASO деплеция RNA-связывающего белка PTB (также наз. PTB1) приводила к превращению присутствующих астроцитов в нейроны и облегчала нейрохимический и моторный дефицит97.

Targeting disease genes-SNCA, GBA and LRRK2


Существуют обширные доказательства связей SNCA - гена, кодирующего α-synuclein - при PD и родственных болезнях, которые коллективно наз. synucleinopathies (rev. 98). SNCA мутации и геномные мультипликации наблюдаются при семейных synucleinopathies, а геномные исследования популяций со спорадическими болезнями идентифицировали варианты SNCA , которые повышали экспрессию α-synuclein99,100, предоставляя те самым рациональное объяснение снижению уровней α-synuclein при PD. В самом деле, нокдаун α-synuclein с помощью коротких шпилечных РНК (shRNA) или ASOs предупреждал нейродегенерацию у модельных грызунов PD101,102. CRISPR-обусловленное подавление α-synuclein также повышало клеточную жизнеспособность человеческих происходящих из iPSC dopaminergic нейронов у пациентов с PD103. Однако, некоторые in vivo исследования также сообщили соотв. физиологических фенотипах после нокдауна α-synuclein, это вопрос пока остается нерешенным104,105.
Усиление активности в головном мозге glucocerebrosidase (GCase) с помощью генотерапии является многообещающим терапевтическим подходом при PD. Дефицит GCase является характерным признаком болезни Gaucher - наследственной болезни лизосомного накопления, обусловленной мутациями в гене GBA1 - и интересно, что мутации GBA1 выступают также в качестве наиболее распространенного фактора риска возникновения PD и др. synucleinopathies106. Снижение уровней GCase также наблюдается в случае спорадических PD (без мутаций GBA1). Важные доказательства от животных моделей PD также показывают связь между GCase и PD, и тем самым в целом подтверждают сценарий, в котором потеря активности GCase приводит к путям стрессовой деградации и увеличению риска возникновения PD107. Прямые инъекции AAV-GBA1 в головной мозг снижают уровни α-synuclein и патологию у модельных грызунов108. Диффузная доставка в головной мозг GBA1 с помощью внутривенных инъекций AAV-PHP.B-GBA1 в A53T α-synuclein мышиных моделей ослабляла патологию α-synuclein и приводила к значительному восстановлению поведения и увеличению продолжительности жизни109. Фаза 1/2 клинического испытания недавно запущена по лечению пациентов с PD с помощью intracisternal инъекций AAV9-GBA1 в CSF (NCT04127578).
Варианты LRRK2 (которые кодируют leucine-rich repeat kinase 2) вызывают семейную PD и увеличивают риск развития идиопатических болезней110. Наиболее распространенным вариантом риска PD является G2019S, расположенный в каталитическом сайте в LRRK2 и усиливает его киназную активность - свойство также общее и др. PD-сцепленным вариантам LRRK2 . Т.о., ослабление экспрессии LRRK2 является важной терапевтической возможностью и используются низко-молекулярные ингибиторы LRRK2111. Однако, LRRK2 экспрессируется также в легких, почках и селезенке, а глобальное подавление LRRK2 может привести к патологическим изменениям в этих тканях112,113. Легочные осложнения особенно заметны, хотя исследования указывают на то, что они могут быть обратимыми после прекращения воздействия114. Генотерапия может быть использована при этих обстоятельствах с помощью специфического ингибирования LRRK2 в головном мозге, а внутримозговые инъекции LRRK2 ASOs в головной мозг были эффективны для снижения уровней мРНК и белка, без очевидных почечных или легочных фенотипических отклонений115. LRRK2 ASO (BIIB094, Ionis pharmaceuticals; доставляемые с помощью intrathecal инъекций) также находятся в Phase 1 клинического испытания у пациентов с PD (NCT03976349).

Huntington's disease


Как моногенное нарушение, болезнь Huntington's (HD) является привлекательной мишенью для генотерапии. Пациенты с HD обнаруживают прогрессирующие двигательные дисфункции, психиатрические нарушения и снижение когнитивной способности116. HD вызывается избытком CAG тринуклеотидных повторов в гене huntingtin (HTT) , генерирующих мутантные токсические HTT белки с аномально длинными polyglutamine (polyQ) повторами116.

Global silencing of HTT


ASOs, нацеленные на HTT мРНК, снижают уровни HTT белка и задерживают прогрессирование болезни у моделей HD117. В Phase 1/2 испытания, находится intrathecal введение ASO HTT, снижающее уровни мутантного HTT в CSF без каких-либо побочных эффектов118, а Phase 3 испытания недавно была запущена, чтобы определить эффективность119. Внутричерепное введение AAV5 с microRNA против HTT существенно снижало уровни мутантного HTT в головном мозге у трансгенных HD мини-свинок120, и была начата Phase 1/2 клинического испытания. Технология интерференции РНК (RNAi) также была использована для снижения экспрессии HTT. Некоторые экспериментальные исследования с использованием HD мышиных моделей показали, что инъекции AAV-HTT shRNA в striatum существенно снижали экспрессию HTT , это приводило к улучшению моторного и поведенческого дефицита в отсутствие нейротоксичности 121,122. Сходным образом, это оказалось безопасным у NHPs123,124. Преимуществом целенаправленного воздействия на общий HTT заключается в том, что один терапевтический агент может действовать на всех пациентов с HD независимо от специфического типа мутации. Однако, в конечном итоге дикого типа белок - и любая родственная физиологическая функция - также будут супрессированы. В самом деле, истощение эндогенного HTT у взрослых мышей может приводить к прогрессирующему поведенческому дефициту, нейропатологическим изменениям и острому панкреатиту125,126, что важно. Баланс между снижением мутантного HTT и поддержанием дикого типа HTT может быть важным при разработке неизбирательной HTT-понижающей терапии.

Selective silencing of HTT mutant alleles


В экспериментальных исследованиях избирательно инактивировали мутантный HTT путем целенаправленного воздействия на single nucleotide polymorphisms (SNPs), ассоциированные с мутантным аллелем, или с помощью CRISPR или RNAi в клетках, полученных от пациентов с HD127,128, или с помощью ASOs в гуманизированных мышиных моделях HD129. Т.к. описано лишь три распространенных с HD-ассоциированных SNPs у более чем 75% пациентов в США и в Европе130, лишь немногие целенаправленные генотерапии, как полагают, будут эффективны у большинства пациентов, но проводятся клинические испытания с использованием ASO-mutant HTT (ASO-mHTT)131. Хотя стратегия целенаправленного воздействия на SNPs в мутантном аллеле обходит возможный риск деплеции дикого типа HTT, существует также ограничение доступности РНК-связывающей последовательности, которая может быть подвергнута целенаправленному действию ASOs. Недавно, zinc finger protein transcription factors (ZFP-TFs) были использованы для избирательного разрушения мутантного аллеля HTT путем прицельного воздействия на регион CAG повторов и AAV-доставляемые ZFP-TFs оказались безопасными и эффективными на мышиных моделях HD132.

Amyotrophic lateral sclerosis


Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) вызывается прогрессирующей дегенерацией двигательных нейронов, что обычно приводит к респираторной неспособности и гибели спустя 3-5 лет после начала болезни. До 10% пациентов с ALS имеют семейную историю генетических мутаций (fALS), тогда как некоторые мутации являются спорадическими (sALS). Среди распространенных ALS генов (SOD1, C9orf72, TDP43 и FUS), генотерапия, нацеленная на SOD1 и C9orf72 мутации была тестирована в клинических испытаниях (recent rev. 133).

Targeting SOD1


Примерно 10-20% пациентов fALS и 1-2% пациентов sALS имеют мутации SOD1 . Большинство SOD1 мутаций изменяют конформацию белка, это приводит к избыточной нейротоксичности134. Инъекции ASO-SOD1 в CSF понижают уровни SOD1 и повышают жизнеспособность трансгенных крыс с мутантным человеческим SOD1 (ref. 135). В Phase 1 клинического испытания intrathecal введение ASO-SOD1 хорошо переносилось пациентами с fALS с мутациями SOD1136. Последующая Phase1/2 испытания показала, что воздействие ASO-SOD1 снижает уровни в CSF белка SOD1137, а Phase 3 испытания только начата. RNAi и CRISPRs также были использованы для инактивации мутантного SOD1. Внутривенная доставка AAV9-SOD1 shRNA снижает уровни SOD1, замедляет прогрессирование болезни и увеличивает продолжительность жизни трансгенных SOD1 мышиных моделей138. Нарушение экспрессии SOD1 с помощью CRISPR также улучшало двигательную функцию и удлиняло жизнь мутантных SOD1 мышей139. Недавно проводили исследование по проверке концепции intrathecally доставки AAVs, экспрессирующих microRNAs против SOD1, у двух пациентов с SOD1 ALS, аутопсический анализ показал экспрессию SOD1 в спинном мозге одного пациента, демонстрируя возможность этого подхода140.

Targeting C9orf72


G4C2 hexanucleotide repeat expansion (HRE) в интроне 1 из C9orf72 является частой причиной ALS141. По крайней мере, распознано три первичных механизма HRE-индуцированной нейротоксичности: снижение экспрессии нормального C9orf72, накопление очагов РНК от смысловых и анти-смысловых транскриптов HRE и дипептидные повторяющиеся белки от трансляции HRE посредством non-AUG (RAN) механизма142. Intracerebroventricular инъекции ASO-C9orf72 редуцировали очаги C9orf72 мРНК и улучшали когнитивную функцию у трансгенных модельных мышей, экспрессирующих 450 G4C2 повторов в гене C9orf72 143. Проводится фаза 1 испытания intrathecal введения ASO-C9orf72 пациентам с C9orf72 ALS .

Conclusions


Once considered a pariah, gene therapy is now a reality. Traditionally, the widespread pathology of neurodegenerative diseases was considered unamenable to gene therapy, but advances in vector technologies now allow diffuse delivery of genes into the CNS. Combined with contemporary genome-manipulation tools, gene-based therapies promise to alter the future clinical management of both inherited and sporadic neurodegenerative diseases-devastating illnesses that have few or no disease-modifying agents today. Even so, many challenges remain, and systematic development of gene-delivery vectors and rigorous evaluation of the safety of contemporary gene-manipulation tools, along with transparency and cooperation between various stakeholders will be critical in ushering this new era.