Посещений:
РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОВ



Независимая от нуклеаз CRISPR/Cas терапия

CRISPR/Cas-Dependent and Nuclease-Free In Vivo Therapeutic Gene Editing
Ishani Dasgupta , Terence R. Flotte , and Allison M. Keeler
Human Gene TherapyVol. 32, No. 5-6 https://doi.org/10.1089/hum.2021.013

Редактирование генов появилось как один из наиболее революционных прорывов в области биомедицинских наук в последней декаде. Технологический прогресс, достигнутый учеными, сделал возможными точные и целенаправленные манипуляции с геномом. Подходы по редактировании генов связаны с сайт-специфическими модификациями генов путем их делеции, замещения или коррекции, продуцируя тем самым желаемый терапевтический эффект.
Фундаментально, сайт-специфические модификации генетической информации на уровне ДНК нуждаются в двух важных компонентах: в сиквенс-специфическом распознавании ДНК и связывании домена и, второе, в эффекторном домене, который инициирует расщепление ДНК вблизи сайта присоединения. Разрывы двойной нити (DSB) с помощью сиквенс-специфической эндонуклеазы активируют эндогенные клеточные механизмы репарации ДНК, модифицируя в дальнейшем желательную последовательность.1-3 Два основных пути репарации используются клетками для заживления индуцированных нуклеазой DSB - это nonhomologous end-joining (NHEJ) и homology-directed repair (HDR).4-6 В зависимости от пути репарации DSB, исходом может быть инактивация локуса мишени с помощью инсерций или делеций ("indels") , вносимых NHEJ7 или инсерции новой последовательности с помощью HDR с экзогенной матричной ДНК. В пути HDR ДНК донор имеет гомологичные плечи с последовательностями, идентичными региону, окружающему DSB, это делает возможной точную коррекцию или замещение оригинального гена.4 Эти изменения запускаются с помощью искусственно созданных нуклеаз, которые индуцируют разрывы двойной нити (DSB) в желательном геномном локусе, приводя к активации эффективных механизмов репарации ДНК, присутствующих у всех организмов.
CRISPR обладает потенциалом использования непосредственно у пациентов, in vivo или ex vivo, для терапевтического редактирование генов. Редактирование генов in vivo вызывает модификации генов in situ благодаря непосредственной доставке CRISPR/Cas9 в клетки мишени. Необходимо учитывать некоторые параметры для обеспечения эффективности и безопасности терапевтического редактирования генов in vivo. В идеале, переносчики прямой доставки CRISPR/Cas в клетки мишени д. быть не иммуногенными и с минимальной цитотоксичностью. Только клетки мишени, обладающие мутантным геном д. быть отредактированы с помощью CRISPR/Cas компонентов; неспецифическое попадание в цель в нормальных клетках может вызывать побочные эффекты на их физиологические функции. Эффекты вне мишени, ассоциированные с CRISPR/Cas необходимо ограничить, чтобы предупредить инсерционный туморогенез. Наконец, высокая эффективность редактирования может быть необходима для получения клинике соответствующих уровней для терапевтического редактирования генов. Следовательно, выбор оптимальной CRISPR/Cas системы и соотв. вектора доставки являются обязательными для точного и мощного редактирования генов in vivo.

Nuclease-Dependent Platforms for Gene Editing


Базирующиеся на нуклеазах платформы включают meganucleases, zinc-finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) и недавние CRISPR/Cas9, которые могут быть преобразованы, чтобы целенаправленно воздействовать на интересующий геномный локус (Fig. 1). Мегануклеазы или homing эндонуклеазы распознают длинные последовательности ДНК, чтобы вызывать DSB. Они оказались среди первых, которые преобразовывали для распознавания новых сайтов мишеней, используя базирующийся на структуре дизайн и подход по преобразованию белков.1,8 Однако, процесс преобразований мегануклеаз для терапевтического редактирования генов является затруднительным и поэтому они ограничены в использовании. ZFNs состоят из ДНК связывающего домена цинковые пальчики, который предопределяет специфичность, а нуклеазный домен происходит из рестрикционной эндонуклеазы FokI.9 Пара ZFNs разработана для каждого сайта мишени для FokI доменов, чтобы димеризовать, и сделать нуклеазный домен каталитически активным. Используя широкий набор подходов, таких как базирующийся на фагах отбор, базирующийся на бактериях отбор и модулярные сборки, ZFNs были сконструированы для целевого воздействия на разные ранги последовательностей для редактирования генов.10-14 Преобразованные ZFNs обладают обнадеживающим усилением целенаправленной гомологичной рекомбинации (HR) в клетках человека,15 также как терапевтическое редактирование генов при кистозном фиброзе,16 серповидно-клеточной анемии,17,18 и human immunodeficiency virus (HIV).19-21 SB-FIX с помощью Sangamo Therapeutics используется для редактирования генов in vivo и для генотерапии с использованием ZFN-для доставки нормальной копии гена factor IX (FIX) для лечения гемофилии B. Др. базирующаяся на ZFN in vivo генотерапия разработана Sangamo Therapeutics, SB-913, проверенный в первом клиническом испытании для лечения синдрома Hunter's.22 Сходная базирующаяся на нуклеазе FokI платформа редактирования, TALENs, происходящая из TAL эффекторных белков, также продемонстрировала потенциал терапевтического редактирования генов.23,24 Эта технология была эффективно использована, чтобы смягчить действие HIV ко-рецептора, CCR5 гена,23 и манипулировать иммунными клетками для лечения рака.25 Несмотря на эффективность целенаправленного редактирования генов с помощью ZFNs и TALENs, затруднения в клонировании и преобразовании их для каждого сайта мишени ограничивают широкое использование. Наиболее приемлемой оказалась технология CRISPR/CRISPR-associated protein (Cas).

Figure 1. Different programmable nucleases for targeted gene editing. (A) Meganucleases belonging to the endonuclease family form a homodimer to exhibit nuclease activity and have a very long target recognition sequence. (B) ZFN modules (green) linked in tandem are fused to the FokI nuclease (orange) with a conserved linker (black). (C) TALENs are designed by fusing their TALE modules to FokI nuclease, similar to ZFNs. Each TALE module recognizes only one nucleotide base, whereas each ZFN module recognizes three bases. Two distinct ZFNs and TALENs bind to specific sites at opposite DNA strands (blue) and FokI dimer cleaves the DNA at the targeted locus. (D) CRISPR/Cas system contains an sgRNA and a Cas protein (light blue). An ?20 nucleotide spacer region (purple) of the sgRNA recognizes the target DNA to be modified. A PAM sequence (pink) acts as a binding signal for the Cas protein. Once the spacer region of the gRNA recognizes and binds to the target DNA, the Cas endonuclease undergoes a conformational change to induce a DSB at the target site. The DSB can be repaired by the host's DNA repair pathways, either by the non-NHEJ or HDR. The NHEJ pathway results in small indels (green) in the target DNA and in most cases causes disruption of the mutated/defective gene. HDR pathway requires the presence of an exogenous donor template encoding the desired edit in addition to the sequence homologous to the regions flanking the genomic target and results in high-fidelity and precise gene editing. CRISPR/Cas, clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated Cas nuclease; DSB, double-stranded break; gRNA, guide RNA; HDR, homology-directed repair; indels, insertions/deletions; NHEJ, nonhomologous end-joining; PAM, protospacer-adjacent motif; sgRNA, single-guide RNA; TALENs, transcription activator-like effector nucleases; ZFN, zinc-finger nuclease. Created with BioRender.com



CRISPR/Cas TECHNOLOGY


Это мощный, многоканальный модулятор впервые был изучен как часть бактериальной адаптивной иммунной системы, состоящей из белка (Cas) и РНК (crRNA и tracrRNA) компонента. Локус CRISPR/Cas состоит из генов Cas и массива CRISPR, состоящего из повторяющихся последовательностей, перемежаемых различными основаниями ДНК, называемыми спейсерами. Эти спейсеры служат в качестве "снимка" мобильных генетических элементов захватчика, приобретенных во время предыдущей инфекции. Во время будущих заражений этот сохраненный "снимок" обеспечивает распознавание и защиту от чужеродных родственных вирусов или плазмид.26,27 CRISPR/Cas-обеспечиваемая иммунная реакция базируется на сиквенс-специфическом целенаправленном воздействии чужеродных нуклеиновых кислот, она подразделяется на три основных стадии. Первая стадия иммунной реакции выявляется с помощью CRISPR системы, называется этапом приобретения, на котором фрагменты ДНК вторгшихся вирусов вводятся в локус CRISPR хозяина в качестве спейсеров. Вторая стадия, известная как стадия экспрессии, отмечает транскрипцию массива CRISPR, содержащего спейсеры, в пре-CRISPR РНК (pre-crRNA), это сопровождается преобразованием с помощью Cas белков в зрелые crRNAs. Некодирующая trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) является существенной для преобразования crRNA и соединения с Cas белком в типа II CRISPR системах. Зрелая crRNA действует как гид (guide), которая может распознавать проникающую чужеродную ДНК и управлять Cas белком, обеспечивая тем самым расщепление мишени. На заключительной стадии интерференции crRNA обеспечивает распознавание цели, а белки Cas расщепляют чужеродную ДНК, обеспечивая защиту клетки-хозяина.28-30
Результативная работа в этой области показала, что эту систему CRISPR / Cas можно запрограммировать на расщепление ДНК-хозяина у различных видов, что позволяет редактировать гены для множества биомедицинских приложений. Разнообразные CRISPR/Cas системы быстро эволюционировали, приводя к их структурному и функциональному разнообразию. CRISPR/Cas системы подразделяются на два класса, каждый из которых подразделяется на три типа и разные подтипы. Класса 1 CRISPR системы (type I, II и IV) присутствуют в бактериях и archaea, как полагают, они были эволюционно родоначальными. Их эффекторные комплексы состоят из многих субъединиц Cas белка. В противовес этому класса 2 CRISPR системы (type II, V, VI) в основном ограничены бактериями и их эффекторные комплексы состоят из одиночного мульти-доменового Cas белка.31,32 Тира II CRISPR/Cas система стала использоваться наиболее широко в качестве мощной нуклеазы для геномного редактирования32 Этот РНК-контролируемый типа II комплекс состоит из Cas9 эндонуклеазы и guide RNA (gRNA). gRNA представлена ~20-нуклеотидами crRNA, комплементарными ДНК мишени и каркасной последовательностью, необходимой для связывания Cas, а именно, tracrRNA. Прорывное открытие показало, что возможно слить crRNA и tracrRNA в единую химерную gRNA, которая придает специфичность системе CRISPR / Cas для целевого редактирования генов. Кроме того, последовательность мотива, примыкающего к протоспейсеру (PAM), непосредственно ниже сайта мишени, также определяет специфичность этой системы и служит сигналом связывания для белка Cas. Cas нуклеазы, выделенные из разных бактерий, распознают соотв. PAM последовательности. Наиболее широко используются и хорошо охарактеризованы Cas9 эндонуклеаза из бактерий Streptococcus pyogenes, которая нуждается в 5'-NGG-3' PAM последовательности непосредственно ниже сайта мишени для связывания. Cas9 и gRNA формируют рибонуклеопротеиновый комплекс, которому способствует каркасная gRNA (tracrRNA), в то время как спейсерная область (crRNA) свободна для взаимодействия с ДНК мишенью. Как только RNP комплекс соединяется с желаемой ДНК мишенью, gRNA отжигается от мишени, и Cas9 претерпевает конформационные изменения; её HNH нуклеазный домен разрезает нити приблизительно на 3-4 нуклеотида выше последовательности PAM, а RuvC-like нуклеазный домен разрезает нить, не являющуюся мишенью, приводя в результате к DSB в желаемом локусе генома.28,33-35 DSBs репарируются или с помощью NHEJ или HDR пути. Т.о., путем изменения синтетической gRNA последовательности можно связывать любую желаемую мишень, Cas9 белок может быть использован в качестве мощной платформы для точного целенаправленного воздействия на геном. Дикого типа варианты Cas9 нуклеазы, генерируемые с помощью мутаций в любом из двух нуклеазных доменов, функционируют как nickase Cas9 (nCas9), которые разрезают одиночную нить ДНК. Это свойство помогает усиливать специфичность Cas9-обеспечиваемого редактирования генов.36,37 Если оба домена эндонуклеазы HNH- и RuvC-like инактивированы, то формируется dead Cas9 (dCas9), который сохраняет только свой rДНК-связывающий домен. Эти искусственно созданные мутантные Cas9, слитые с др. функциональными эффекторами или лигандами, то они могут активно использоваться для специфического целенаправленного воздействия на ген, для активации, замалчивания, эпигенетической регуляции и редактирования оснований.38-40 Помимо SpCas9, др. Cas9 белки также были использованы, такие как Cas9, происходящий из Staphylococcus aureus (SaCas9)41 и Neisseria meningitidis, наз. Nme2Cas9.42 Эти Cas9 белки обладают сравнимым потенциалом редактирования, как у SpCas9 , но лучше подходят для доставки in vivo, благодаря их более меньшему размеру.

CRISPR/Cas-MEDIATED IN VIVO GENE EDITING


Очень точное, мощное, легко доставляемое редактирование генов необходимо для безопасного ex vivo и in vivo клинического использования. Во время редактирования ex vivo клетки сначала выделяются, переносятся с помощью соотв. инструмента для редактирования генов и затем обратно трансплантируются пациенту.43 По клиническим меркам, это требует времени, усилий и дорогостоящих процессов, поэтому оказывается под вопросом широкое применение к пациентам особенно слаборазвитых стран. Более того, ex vivo редактирование во многом ограничено клетками, которые могут быть изолированы из тела пациента, модифицированы in vitro и затем обратно введены пациенту, это гематопоэтические стволовые клетки (HSCs) и иммунные клетки, напр., T клетки и клетки natural killer (NK). CRISPR/Cas-обусловленное ex vivo терапевтическое редактирование генов активно используется при генетических болезнях, таких как серповидно-клеточная анемия, β-thalassemia, и терапия с помощью chimeric antigen receptor (CAR)-T.44,45 Однако, клетки мишени, участвующие в большинстве генетических болезней нуждаются в коррекции генов in situ. Поэтому редактирование генов in vivo является идеальной платформой для лечения различных генетических нарушений людей.

Ideal candidates for in vivo gene editing


Во-первых, редактирование генов in vivo нуждается в локальной или системной доставке компонентов редактирования генов пациенту, избегая утомительного процесса выделения клеток, размножения, редактирования и обратного введения.46 Напр., существующие подходы сайт-специфического редактирования генов для лечения серповидно-клеточной болезни включают выделение гематопоэтических стволовых клеток и клеток предшественников пациента, это сопровождается или репарированием мутантного гена гемоглобина (HBB)47 или индукцией экспрессии фетального гемоглобина,48,49 и, наконец, обратного введения откорректированных клеток в костный мозг пациента.50 Во-вторых, модификации генов in situболее предпочтительны для определенных типов клеток, которые могут терять свои свойства и функцию при искусственном культивировании, такие как нейроны. Ex vivo технологии редактирования также влияют на жизнеспособность клеток и приводят к плохому приживлению, чего не происходит во время редактирования генов in vivo.
В-третьих, при некоторых моногенных нарушения, где нарушение одного гена вызывает дефекты во всем клеточном клоне, напр., при тяжелом комбинированном иммунодефиците,51 откорректированные HSCs генерируют здоровые клетки, способные к дифференцировке, обладая избирательными преимуществами перед дефектными клетками. Как результат, небольших количеств откорректированных клеток достаточно, чтобы получить терапевтический эффект. Поскольку эффективность редактирования генов in vivo низкая, избирательные преимущества модифицированных клеток увеличивают шансы такого подхода. Идеальными кандидатами на роль редактирования генов in vivo являются генетические нарушения, при которых удаление аллеля с аберрантным сайтом сплайсинга может помочь восстановить функцию гена, напр., при β-thalassemia.52
Более того, некоторые генетические нарушения, которые затрагивают небольшие органы, такие как уши и сетчатку, нуждаются в локальных инъекциях инструментов геномного редактирования, с минимальным распространением на др. ткани. Локальная доставки обеспечивается соотв. путями введения или использованием ткане-специфических промоторов, что улучшает выполнимость специфичного для тканей и органов геномного редактирования in vivo.53 Однако, крупные органы нуждаются в системных инъекциях для эффективного целевого воздействия.
Наконец, обычный подход к генотерапии использует замещение дефектного гена в локусе мишени. Однако, небольшое количество отредактированных клеток может не экспрессировать адекватные уровни трансгена, необходимого для смягчения болезни. Этот недостаток может сказаться на доставке аппарата редактирования в нативный локус, "безопасную гавань" с высокой транскрипционной активностью, такую как локус сывороточного альбумина.54 Такая стратегия создает разносторонние платформы для экспрессии терапевтических уровней белка, с заменой донора для каждого трансгена.

In vivo CRISPR/Cas applications


Большинство CRISPR/Cas-обеспечиваемых терапевтических подходов для моногенных нарушений, которые сегодня находятся на ст. клинических испытаний, используют стратегии ex vivo. В последние годы исследования in vivo редактирования генов базируются в основном на путях NHEJ и HDR. Некоторые из недавних подходов терапевтического преобразования генома in vivo в преклинических и клинических исследованиях представлены в Table 1. Где мы подчеркнули исследования HDR-базирующиеся точных модификациях генов in vivo с использованием CRISPR/Cas, которые в принципе могут быть перенесены в будущем на человека.

Table 1. List of some of the recent therapeutic gene editing studies in in vivo preclinical and clinical models



Genetic liver diseases


Пациенты с alpha-1 antitrypsin deficiency (AATD) страдают от легочной болезни, обусловленной потерей функции AAT antiprotease активности, а некоторые пациенты страдают от печеночной токсичности из-за избыточной функции мутантного аллеля. CRISPR/Cas9-обеспечиваемое редактирование и NHEJ успешно ослабляют действие мутантного AAT и эффективно уменьшают печеночный фиброз в гуманизированных мышиных моделях, подкрепляя тем самым потенциальную терапевтическую возможность лечения пациентов с AATD.55 Дополнительное исследование с использованием совместных инъекций двойного adeno-associated vector (AAV): одного, кодирующего Cas9, и др., экспрессирующего AAT gRNA и HDR донорскую матрицу, в печень трансгенных модельных мышей. Подход делает возможной точную коррекцию гена AAT in vivo и частично восстанавливает уровни дикого типа AAT,54 дела его возможным терапевтическим вмешательством после дальнейшего усовершенствования для использования на людях. Hereditary tyrosinemia type I (HTI) является др. генетической болезнью печени, вызываемой потерей функции fumaryl acetoacetate hydrolase (FAH), ключевого энзима катаболического пути тирозина. CRISPR/Cas9-обуслолвенное HDR успешно исправляет FAH мутацию с помощью 2-х методов: (1) гидродинамической инъекции компонентов редактирования генов, которые приводят к низкой доле коррекции56 и котора была тестирована в клиническом испытании,57 и (2) системное введение Cas9 мРНК с помощью липидных наночастиц (LNPs) и single-guide RNA (sgRNA)/HDR матрицы с помощью AAV, это приводит к инициальной коррекции FAH у более чем 6% гепатоцитов.58 Более того, новое поколение инструментов редактирования генов, редактирования оснований, которые используют соединенную dCas9 с энзимами, которые катализируют непосредственную конверсию A в G или C в T, обусловливая редактирование оснований ДНК, не вызывая каких-либо разрывов ДНК.40,59,60 Используя стратегию adenosine base editing (ABE) с помощью LNP доставки, содержащих sgRNA и codon-оптимизированный редактор оснований, как было установлено, устраняет точковую мутацию FAH in vivo, устраняя необходимость в какой-либо ДНК донорской матрице.61 Кроме того, в модели transthyretin амилоидоза, одиночное применение LNP-обеспечиваемой доставки CRISPR/Cas9 вместе с химически модифицированной sgRNA облегчает эффективное редактирование мышиного гена transthyretin (Ttr) в печени и вызывает более чем 90% снижение уровней сывороточного белка TTR, по крайней мере, в течение 12 мес.62 Это исследование достигло подходящего для клиники уровня редактирования in vivo и в будущем будет опробовано и на людях.

Duchenne muscular dystrophy


Исследования по редактированию in vivo использованы при генетических мышечных болезнях, напр., Duchenne muscular dystrophy (DMD), характеризующейся прогрессирующей мышечной слабостью и преждевременной гибелью, обусловленной мутацией в гене дистрофина. Мыши, моделирующие DMD, обнаруживают сходную делецию в гене Dmd gene (ΔEx50), обнаруживаемую у DMD пациентов. CRISPR/Cas9-индуцированный единичный разрез в гене дистрофина у таких мышей и gRNA, которая делает возможным пропуск экзона 51, восстанавливает до 90% уровня экспрессии гене дистрофина в скелетных и сердечной мышцах.63 Важной ступенью в направлении переноса в клинику терапевтического редактирования генов DMD является использование CRISPR/Cas9-обеспечиваемого NHEJ для лечения собак с мутацией ΔEx50, соотв. мутационной "горячей точке" в гене DMD людей. Системная доставка аппарата редактирования генов в скелетные мышцы приводит к 3-90% восстановлению, в зависимости от типа мышц, а обработанные собаки обнаруживают улучшения в гистологии мышц.64 Хотя такая проверка принципа на модельных собаках выявила потенциал переноса этого подхода и на людей, имеются некоторые вопросы по редактированию генов у крупных животных. Ограниченный размер выборки, возраст введения, продолжительность лечения, характеристика получаемых результатов, безопасность и этические проблемы65-67 необходимо решить в будущем.
Помимо пропуска экзонов, др. группы используют базирующуюся на AAV локальную и системную доставку CRISPR/Cas9 компонентов редактирования у взрослых и новорожденных DMD модельных мышей для удаления мутаций в экзоне 23, приводя к частичному восстановлению функции дистрофина в скелетных миофибриллах и сердечных мышцах.68-70 Более того, локальная доставка ABEs, состоящих из преобразованной adenine deaminase и SpCas9 nickase, помогает корректировать нонсенс мутации у DMD модельных мышей.71 Идеальная терапия для хронических болезней, таких как DMD, д. гарантировать устойчивое восстановление дистрофина в сердечных и скелетных мышцах. Поэтому необходима терапия с одноразовым введением дозы AAAV-CRISPR, которая д. приводить к устойчивому облегчению проявлений болезни. Успешные результаты при кратковременных исследованиях68,70,72,73 помогли исследователям протестировать долговременность восстановления гена DMD. Системное введение AAV9 вектора, кодирующего SaCas9 и gRNA, нацеленных на интроны 22 и 23, восстанавливали экспрессию дистрофина, улучшая тем самым функцию скелетных и сердечных мышц в течение 18 мес. у дистрофичных мышей.74 Др. подход для достижения устойчивой генотерапии при DMD это редактирование мышечных стволовых клеток (MuSCs), используя CRISPR. Поскольку самообновление MuSCs, известных также как сателлитные клетки, регенерирует скелетные мышцы в ответ на повреждения ткани, то коррекция таких клеток д. позволить долговременное терапевтическое редактирование генов. CRISPR-отредактированные MuSCs от дистрофичных мышей, будучи трансплантированными нулевым по dystrophin мышам, обнаруживали увеличение экспрессии dystrophin и успешное обновление.75,76

Retinal disorders


Отличительным признаком исследований, недавно предложенных для клинических испытаний, стало in vivo использование доставки CRISPR/Cas9 для лечения врожденной слепоты у пациентов. Leber congenital amaurosis (LCA) является редким, подрывающим здоровье моногенным заболеванием, приводящим к потере зрения в детстве. Мутация биаллельной потери функции в гене CEP20 ответственна за эту тяжелую дистрофию сетчатки. Editas Medicine разработала терапию, названную EDIT-101, которая доставляет SaCas9 непосредственно, что удалять интронную мутацию IVS26 в гене CEP20, отвечающую за аберрантный сплайсинг, восстанавливая тем самым фыункциональные уровни CEP20 вlклетках людей и гуманизированных CEP20 мышей.77 Клиническое испытание EDIT-101, осуществленное Allergan и Editas Medicine положило путь для проспективной лечебной стратегии для лечения врожденой слепоты с помощью подхода in vivo.
В идеале базирующаяся на HDR точная коррекция гена может репарировать генетические мутации, участвующие в наследственных нарушениях сетчатки. Поскольку HDR в основном происходит в митотических клетках, то пост-митотическая природа большинства клеток сетчатки ограничивает эффективность HDR. Следовательно, большинство подходов к редактированию генов in vivo при дистрофиях сетчатки базируется на CRISPR-Cas-контролируемом NHEJ пути.78-86 Др. стратегия геномного редактирования, а именно, homology-independent targeted integration (HITI), была использована для успешного knock in экзона 2 Mertk (MER/AXL/TYRO3 receptor kinase) гена, защищая тем самым от дегенерации сетчатки87 HITI использует механизм NHEJ репарации и способна целенаправленно вставлять трансген бкз необходимости в HR донорской матрице и в неделящихся клетках.

In vivo editing of stem cells and immune cells


Большинство генотерапий HSC использует выделение из пациента стволовых клеток, их размножение, сопровождаемое коррекцией гена с использованием аппарата редактирования и затем с возращением в тело пациента. Хотя этот подход был использован с началом клинических испытаний, он ассоциировал с ограничениями, рассмотренными выше. Др. неудобство подхода ex vivo заключается в том. что повторное введение отредактированных клеток в костный мозг требует подвергнуть пациента химиотерапии. Недавно одно из начатых клинических испытаний с серповидно-клеточной болезнью, инициированное Bluebird Bio, было остановлено после того, как у двух пациентов, получавших ex vivo генеотерапию SCD, была диагностирована острая миелоидная лейкемия (AML) и myelodysplastic синдром (MDS).88 В 2018, др. пациент из того же самого испытания получил диагноз MDS, благодаря побочным эффектам химиотерапии перед лечением. Действительно ли эти два новых случая могут быть объяснены химиотерапией или инсерционным онкогенезом, запускаемым лентивирусным вектором, использовано в испытании, вопрос всё ещё не решен. Редактирование in vivo не использует требующий временных затрат, дорогостоящий и трудоемкий процесс in vitro обработки HSCs, а также повреждающей ДНК химиотерапии во время повторных вливаний. In vivo подходы включают или прямые модификации HSCs в костном мозге при внутрикостной инъекции, или системные инъекции доставляющих транспортеров, которые действуют на HSCs, проникшие в периферическую кровь, что сопровождается их повторным приживлением в костном мозге. Предыдущее исследование описало успешное лентивирусом опосредованный перенос генов в Т клетки89 и в HSCs путем прямого введения внутрь кости мышей, демонстрируя высокие уровни трансдукции клеток костного мозга.90 Исследования редактирования генов в HSC описаны у thalassemic мышей, которым инъецировали наночастицы, содержащие triplex-формирующие пептиды нуклеиновых кислот и однонитчатый гомологичный ДНК донор, в комбинации с фактором стволовых клеток. Эта стратегия редактирования обнаруживает почти 7% частоту редактирования в косном мозге, достаточную для ослабления проявлений болезни.91 Альтернативная стратегия in vivo генотерапии связана с мобилизацией гематопоэтических стволовых клеток и клеток предшественников (HSPCs) из костного мозга в периферическую кровь, после внутривенной инъекции векторной системы интегрирующей, helper-зависимый аденовирус (HDAd5/35++), которая целенаправленно воздействует на человеческие, CD46 экспрессирующие, зарождающиеся HSCs. Эта базирующаяся на transposase, система интеграции достигала стабильной экспрессии фетального γ-globin у CD46-трансгенных и у мышей, моделирующих thalassemia.92-94 Этот метод, будучи протестирован на макаках резус, продемонстрировал стабильную трансдукцию HSC, улучшая тем самым его пригодность для генотерапии HSC людей.95 Помимо thalassemia, этот подход был недавно использован для коррекции проявления серповидно-клеточной болезни. Вектор HDAd5/35++, кодирующий две кассеты, одна, содержащая аппарат CRISPR/Cas9 и др., кодирующая терапевтический плодный γ-globin трансген, был использован для внутривенных инъекций модельным SCD мышам. Комбинация этих двух кассет, вызывала экспрессию гена плодного γ-globin и ослабляла проявления болезни.96 Несмотря на обнадеживающие результаты, высокий титр иммуногенных аденовирусных векторов может воспрепятствовать клиническим испытаниям. Система доставки AAV вектора может быть безопасной и наиболее эффективной альтернативой для in vivo редактирования генов в HSC. Рекомбинантные tyrosine mutant AAV6 векторы обладают высокой эффективностью трансдукции и мощной экспрессией трансгена в HSCs человека in vitro и мышиных xenograft моделях in vivo.97-99 Кроме того, AAV8-обеспечиваемая трансдукция иммунных клеток, таких как Т клетки, В клетки, макрофаги и дендритные клетки, была достигнута in vivo после системных инъекций мышам,100 поощряя тем самым разработку этих векторов для иммунотерапии in vivo. Др. недавняя стратегия редактирования генов использовала редакторы оснований, доставляемые с помощью HDAd5/35++ векторов, продемонстрировала эффективную трансдукцию HSPC и стабильную экспрессию γ-globin у трансгенных мышей, подчеркивая её огромный потенциал для генотерапии in vivo при гемоглобинопатиях.101,102 Дальнейшие исследования использовали базирующиеся на HDR редактирование HSC in vivo в области гематопоэтической генотерапии.

Brain disorders


Базирующиеся на NHEJ редактирование, запускаемое с помощью CRISPR/Cas9 системы, активно исследовали в регионах головного мозга in vivo.103-107 По сравнению с NHEJ, низкая эффективность пути HDR в пост-митотических нейронах позволят точно корректировать гены, что затруднено в этих клетках. Чтобы преодолеть это, было использовано , чтобы достичь целенаправленной инсерции желаемой донорской последовательности in situ.87,108 Это может быть использовано для создания knockin репортерной системы для отслеживания клеток у живых организмов, что подходит для изучения нейронных связей in (circuits) и функций головного мозга. Более того, некоторые исследования подтвердили , что предшественники нейронов сохраняют свою способность запускать HDR in vivo.109 Быстрая in utero электропортация для доставки редактирующих компонентов в нейральные предшественники делает возможной HDR редактирование в головном мозге мышиных эмбрионов.110-112 Облегченное с помощью HDR редактирование генов выявляется и в пост-митотических нейронах. Комбинация CRISPR/Cas9 и обеспечиваемой с помощью AAV доставки донорской ДНК делает возможным HDR редактирование in vivo вместе с инсерцией репортерной метки в регионы головного мозга. Эта стратегия, известная как vSLENDR (viral-single-cell labeling of endogenous proteins by CRISPR/Cas9-mediated HDR), приспособлена для осуществления точных модификаций генов с помощью HDR в любом регионе головного мозга.113
Некоторые из совр. in vivo исследований терапевтического редактирования генов суммирована в Table 1. Несмотря на эти многообещающие исследования, всё ещё существует пропасть между исследовании на животных и применением у людей.

In vivo gene editing clinical trials


Ландшафт редактирования генов быстро эволюционирует благодаря достижениям некоторых исследований терапевтического редактирования генов. Большинство из проводимых испытаний сконцентрировано на модификации генов ex vivo и описано в обзорах.114,115 Сегодня ex vivo редактирование генов в преклинических и клинических испытаниях прежде всего касаются альтераций Т клеток, чтобы прекратить экспрессию гена для лечения HIV,116-120 преобразования Т клеток для иммунотерапии раковых опухолей,121-124 и модификации HSCs для лечения гемоглобинопатий, таких как β-thalassemia и серповидно-клеточная анемия.18,48,125-127 Клинические испытания при β-thalassemia и серповидно-клеточной анемии использовали ZFN- и Cas9-обусловленные нарушения репрессора фетального гемоглобина BCL11A в HSCs ex vivo продолжаются (NCT03432364, NCT03653247, NCT03655678, и NCT03745287).
In vivo терапевтические подходы к редактированию генов дошедшие до клинических испытаний, суммирован в Table 2. Проводятся ZFN-, TALEN-, и Cas9-базирующиеся испытания для лечения рака шейки матки. Эти подходы нацелены на E6 и E7 гены human papilloma virus (HPV), причины рака шейки матки.128 Хотя сегодня доступны HPV вакцины, они не обеспечивают лечение рака шейки матки. Невирусная доставка ZFNs, TALENs, или CRISPR/Cas9 приводит к целенаправленному разрушению онкогена E7, приводя в результате к снижению роста опухоли у мышиных моделей.129-131 Помимо методов невирусной доставки, зависимая от AAV доставка Cas9, нацеленных на E6 и E7 вирусные гены дала обнадеживающие результаты на xenograft моделях,132,133 отражая её терапевтический потенциал при раке шейки матки. Кроме того, испытания in vivo с ZFN-обеспечиваемом редактировании генов были использованы для лечения гемофилии.134-137 Базирующаяся на ZFN коррекция гена factor IX, α-l-iduronidase и iduronate-2 sulfatase были осуществлены в клинических испытаниях для гемофилии, mucopolysaccharidosis type I (MPS I) и MPS II, соотв. Первоначальные результаты испытаний MPS II подтвердили безопасность этого подхода. Более мощная, вторая генерация ZFNs будет использована в дальнейшем для усиления эффективности редактирования гуманизированных клеток печени.138 Совсем недавнее CRISPR/Cas9-опосредованное испытаниеEDIT-101 (NCT03872479) , проведенное Allergan и Editas Medicine, использовало базирующуюся на AAV доставку в глаза, см. раздел Retinal Disorders. Subretinal инъекция CRISPR/Cas9 аппарата редактирования у мышей и приматов продемонстрировала редактирование генов на терапевтическом уровне, восстанавливалась нормальная экспрессия гена CEP290 у пациентов, страдающих от врожденной слепоты.77

Table 2. List of the in vivo gene editing clinical trials

LIMITATIONS ASSOCIATED WITH CRISPR/Cas-BASED IN VIVO THERAPEUTIC GENE EDITING


Ограничения, ассоциированные с in vivo генотерапией представлены на Fig. 2.

Figure 2. Schematic showing limitations of in vivo gene editing. In vivo gene therapy involves direct injection of the editing machinery into the patient by viral or nonviral delivery methods. Limitations associated with this approach are listed here. Created with BioRender.com



In vivo delivery


Ключевой ступенью, которая детерминирует пригодность для клиники редактирования генов является эффективность и безопасность доставки инструментов редактирования, включая CRISPR/Cas энзимы, sgRNA, и репарационную матрицу в клетки мишени. Cas энзим может быть доставлен в клетки в нескольких форматах: плазмидной ДНК, кодирующей ген Cas, Cas мРНК или белка. Они д. быть соединены с соотв. sgRNA. Электропортация клеток с помощью предварительно преобразованного Cas белка и sgRNA RNP комплекса является предпочтительной формой доставки ex vivo отредактированного гена.139 Хотя электропортация и была использована для доставки Cas9 в зиготы животных140,141 и скелетные мышцы мышей,142 , необходим высокого напряжения шок, чтобы сделать клетки проницаемыми, это токсично и может оказаться неблагоприятным для целого ряда подходов. In vivo доставка ещё более сложная и нуждается в переносчиках, обладающих высокой специфичностью, низкой цитотоксичностью и быстрой очисткой Cas энзима после редактирования генов. Преодоление этих затруднений повысит клинические перспективы in vivo редактирования генов, будет стимулировать развитие систем вирусной и не вирусной доставки. Среди вирусных методов доставки, включая и лентивирусы, аденовирусы и AAVs, нпиболее широко используются для in vivo доставки CRISPR/Cas систем AAVs.
AAVs относительно не иммуногенны, демонстрируют зависимую от варианта капсиды тканевую специфичность в большем мере, чем др. вирусные векторы, и продолжительную экспрессию трансгена без необходимости интеграции в геном. AAV-обеспечиваемая доставка CRISPR/Cas9 была успешно использована в генотерапии моногенных болезней, таких как DMD,68-70,72 нарушения сетчатки,80,85,143,144 и печени,41,58,145сердца,146-148 и лёгких.149 Однонитчатый геном AAV и его уникальные инвертированные терминальные повторы играют существенную роль в точном редактировании генов. ssDNA из rAAVs используют длинные гомологичные плечи, кодирующие селекционные маркеры и имеют низкую величину базирующейся на NHEJ интеграции, используя их тем самым как bona fide HDR матрицу. В то время как CRISPR/Cas компоненты могут доставляться с помощью разных методов, которые не обязательно требуют AAVs, HDR донор часто доставляется с помощью однонитчатых AAVs.150,151 Хотя AAVs являются предпочтительными устройствами доставки CRISPR/Cas, их возможность к упаковке ограничена всего 4.7 kb. Используя систему двойных векторов, один, экспрессирующий gRNA и. HDR репарационную матрицу, а второй AAV кодирующий SpCas9 ген (4.2 kb), для HDR-опосредованной коррекции гена, это позволяет избегать ограничений размеров упаковки.145,152 Альтернативные подходы для точной коррекции генов in vivo, таких как редактирование оснований и prime editing, также нуждаются в двойных векторах, чтобы приспособить эффекторы, слитые с Cas9.153-157 Однако, клетки мишени нуждаются в присутствии обоих векторов вместе, это увеличивает эффективность редактирования. Также высокая доза AAV нуждается в двойных векторах, это может повышать безопасность во время переноса в клинику, с учетом недавних последствий терапии высокими дозами AAV в испытаниях на людях.158,159 Более короткий ортолог Cas9, такой как SaCas9, NmeCas9 или Cas9 из Campylobacter jejuni может быть скомбинирован с gRNA и донорской матрицей в одном AAV векторе, чтобы решить вопрос упаковки.42,80,160,161 Новый всё-в-одном рекомбинантный AAV вектор, кодирующий Nme2 Cas9 вместе с двумя sgRNAs был получен искусственно, чтобы смягчать проявления болезни в HTI мышиной модели. Чтобы осуществить необходимый single-AAV для точной модификации гена с помощью HDR, эта система была усовершенствована. Был разработан само-инактивирующийся одиночный AAV вектор, кодирующий Nme2 Cas9, одиночную sgRNA и HDR донорскую матрицу, фланкированную с помощью Nme2 Cas9 сайтов мишеней. Само-расщепление во время упаковки было преодолено за счет включения anti-CRISPR protein (ACR).162 Точное базирующееся на HDR терапевтическое редактирование на клинически важном уровне было достигнуто на моделях болезней HTI и MPS I.163 Вновь разработанные CRISPR/Cas системы, такие как гиперкомпактные CasФ, имеющие половинный размер SpCas9, обнаруживают сходную эффективность и избирательность и обладают потенциалом преодоления ограничений в размере при базирующейся на AAV доставке.164 Во-вторых, тканевой тропизм AAVs необходим для дальнейшей минимизации каких-либо побочных эффектов CRISPR/Cas в др. тканях. AAV капсиды могут быть искусственно преобразованы, чтобы использовать ткане-специфические промоторы72,103,147 или иметь улучшенные варианты капсид165-167 или повысить специфичность к ткани мишени или эффективность трансдукции in vivo путем включения лигандов, которые соединяются с рецепторами на клетках мишенях.168 Др. ограничением AAVs является иммуногенность,169 высокие титры вирусов лежат за пределами клинически используемых уровней для получения терапевтического редактирования, а также дороговизна производства и масштабируемость для клинического использования.170
Пути применения AAV векторов также влияют на эффективность и специфичность in vivo редактирования генов. Выбор пути оптимальной инъекции зависит от ткани мишени, ткане-специфичного промотора и варианта капсиды AAV. Напр., системные внутривенные инъекции являются преимущественным способом доставки отредактированных генов, участвующих в нарушениях печени, т.к. большинство AAVs накапливаются в печени.145,171 Однако, локальные инъекции, такие как субретинальные инъекции или инъекции в стекловидное тело, предпочтительны, когда используются AAVs, содержащие компоненты CRISPR/Cas, для внесения в сетчатку мыши.85,143,144 Хотя большинство методов in vivo обладают потенциалом использования и у людей, правда, требуются высокие дозы для достижения клинически ощутимого уровня редактирования.
Несмотря на широко распространенное использование AAV систем доставки, ограничения, рассмотренные выше. способствуют разработке новых невирусных носителей для доставки CRISPR/Cas in vivo. Катионные LNPs были использованы для доставки CRISPR/Cas9 RNP в печень мышей для получения терапевтически достоверного редактирования генов in vivo.62 В этом исследовании достигнута 70% эффективность редактирования, при этом одиноная доза давала эффективные результаты у крыс, при оценке пре-клинического результата.62 Др. группы, сообщавшие о in vivo редактировании, использовали невирусные системы доставки в печень и обнаруживали эффективность в пределах от 3.5% в гепатоцитах172 до 35% редактирования после 4-х системных доз.173 Недавнее исследование показало, что LNPs оказались способны эффективно доставлять gRNA и Cas9 мРНК в эндотелиальные клетки селезенки, идентифицируя т. о., новые доступны клетки мишени in vivo.174 Несмотря на то, что этот метод оказался дешевым, быстрым и легким,175 LNPs обнаруживают некоторые доказательства токсичности.58,176 Система доставки, базирующаяся на золотых наночастицах конъюгирует с ДНК и дает ансамбли с полимерами, которые разрушают эндосомы, могут доставлять Cas9 RNP и донорскую ДНК, чтобы корректировать мутации гена Dmd у мышей, при этом обнаруживаются незначительные побочные эффекты.177 Дальнейшее совершенствование наночастиц, nanowires и базирующихся на клетках методов доставки является критическим для in vivo редактирования генов.178,179

Off-target effects of CRISPR/Cas


Точные и аккуратные модификации генов в желательном сайте мишени является обязательными для терапевтического редактирования генов. Хотя система CRISPR/Cas, как известно, наиболее точная по сравнению с др. нуклеазами, она всё ещё обладает активностью расщепления вне мишени. Эффекты вне мигшени обусловлены неспецифическим расщеплением ДНК, вызванным CRISPR/Cas в месте ином, нежели действительная мишень и это может приводить к вредным эффектам, таким как злокачественные преобразования.180 Некоторые из in vivo исследований генотерапии обнаруживают минимальные или отсутствие редактирования вне мишени в предполагаемых сайтах.58,69,70,145 Однако, возможность редактирования вне мишени помимо предсказанных сайтов, требует разработки беспристрастного метода геномного секвенирования. Некоторые базирующиеся на клетках инструменты геномного секвенирования, такие как CHIP-seq181 и Digenome-seq,182 имеют целью идентификацию непредсказуемых мутаций вне мишени in vitro. Однако, эти in silico инструменты не могут непосредственно использоваться, чтобы идентифицировать нежелательные геномные сайты для in vivo редактирования. Двухступенчатая стратегия, наз., "verification of in vivo targets" (VIVO), была разработана впервые для идентификации потенциальных мест вне мишени с использованием CIRCLE-Seq, и затем последующего подтверждения каких-либо альтераций этих мест после CRISPR/Cas9 in vivo геномного редактирования.183 Этот мощный in silico инструмент позволяет идентифицировать места мутаций вне мишени in vivo, жизненно важные для создания более специфичных gRNA, которые влияют на желаемые сайты генома.
Помимо оптимизации дизайна gRNA, снижение долговременной экспрессии Cas9 , по крайней мере, частично др. способом минимизации эффектов вне мишени. Доставка коротко-живущего Cas9 белка вместо гена Cas9,184 использована для само-ограничения системы CRISPR/Cas при кондиционном редактировании генома,143 или индуцибельных Cas9 вариантов,185-187 снижает продолжительность воздействия Cas9, препятствуя тем самым эффектам вне мишени. Кроме того, само-инактивация системы AAV-CRISPR, содержащей gRNA, которая расщепляет некодирующую последовательность Cas9 и может элиминировать Cas9 белок in vivo, не нарушая эффективности целенаправленного редактирования, облегчая тем самым проблемы, связанные с долговременной экспрессией Cas9.163 Более того, LNP-обеспечиваемая доставка Cas9 мРНК58 и внеклеточными пузырьками (EV)-обеспечиваемая доставка CRISPR-Cas9 RNPs минимизирует разрезы вне мишени путем ограничения продолжительности воздействия Cas9.188-193 Недавно разработанная все-в-одном базирующаяся на EV система доставки, известная как, NanoMEDIC (nanomembrane-derived EVs for the delivery of macromolecular cargo), способствует редактированию гена мишени ex vivo и in vivo.194 Альтернативный подход для избегания эффектов вне мишени включает методы редактирования, которые не нуждаются в разрезах двойной нити с помощью CRISPR/Cas9. Напр., dCas9 , слитая с активатором или репрессором транскрипции авзвает активацию CRISPR , исследования интерференции обнаружили высокую специфичность.38,39 Редакторы оснований обеспечивают программируемое РНК редактирование оснований ДНК, не вызывая каких-либо разрывов ДНК, ограничивая при этом нежелательно редактирование вне мишени.60,195 Др. способом снижения эффектов вне мишени является использование anti-CRISPR белков, которые регулируют активность dCas9 и генерируют клетки, резистентные к неспецифическим модификациям генов.196-198 Мощность и специфичность этих техник in vivo необходимо детально исследовать перед переносом в клинику.

CRISPR/Cas immunogenicity


Существуют два важных вопроса относительно иммуногенности редактирования генов CRISPR, это токсичность экспрессии Cas9 и предсуществующий иммунитет против Cas9. Токсичность связана с продолжительной экспрессией Cas9, а способы ее снижения58,143,163,184-187 обсуждались выше. Гуморальная и клеточная иммунная реакция выявлена против SaCas9 только у взрослых мышей, получавших базирующуюся на AAV-CRISPR генотерапию против DMD. Однако, новорожденные не обнаруживали какой-либо иммунной реакции против SaCas9 белков бактериального происхождения.199 Гуманизированный Cas9 белок также может быть менее иммуногенным со сниженной свой потенциальной токсичностью. Иммунная реакция хозяина на Cas9 может препятствовать in vivo терапевтическому редактированию генов. Поэтому наиболее широко используются ортологи Cas9, SpCas9 и SaCas9, происходящие из бактериальных видов, которые часто инфицируют людей, поэтому, скорее всего, люди обладают предсуществующей иммунной реакцией против них. Как и ожидалось, предсуществующий иммунитет в виде anti-Cas9 IgG антител обнаружен против SaCas9 и SpCas9 у здоровых взрослых людей.200 Реактивные Т клетки против SpCas9 были также обнаружены у людей.201 Отредактированные клетки могут быть элиминированы благодаря запуску CRISPR/Cas иммунного ответе. В одном исследовании предсуществующего иммунитета к Cas9 привело к обнаружению высокго процента токсических CD8+ T клеток в печени мыши, что приводило к удалению отредактированных клеток.202 Разработка методов снижения иммуногенности CRISPR/Cas требует дальнейшего внимания.

HDR efficiency


Точная коррекция генов при моногенных нарушениях достигается с помощью HDR. Однако, эффективность HDR-зависимых точных модификаций является более низкой по сравнению с др. конкурентными путями репарации, такими как NHEJ. HDR происходит главным образом в митотических клетках, затрудняя увеличение эффективности, достаточной для терапевтического эффекта. Эффективность редактирования варьирует при разных болезнях, высокая эффективность обычно усиливает терапевтические результаты. Оптимизация и рациональный дизайн HDR доноров,203 повышают сходство последовательностей между донорской матрицей и разрезаемым сайтом мишенью,204 и подавляют путь NHEJ 205,206 это приводит к некоторому повышению эффективности HDR. HITI стратегии могут быть таже использованы для получения целенаправленной интеграции в желаемый трансген, чтобы олегчить генотерапию in vivo.87,108,207 Кроме того, редакторы оснований40,208 и prime редакторы209, делают возможным точное редактирование генов, независимо от путей репарации ДНК, и могут в принципе излечивать некоторые генетические болезни.

NUCLEASE-INDEPENDENT GENE TARGETING AS AN ALTERNATE EDITING APPROACH


Риски, связанные с зависимым от нуклеазы целенаправленным воздействием на гены, рассмотрены выше, включая неумышленную продолжительную экспрессию Cas9, приводящую к потенциальным эффектам вне мишени. Чтобы устранить эту проблему, стратегия свободного от нуклеаз целенаправленного действия на гены, базирующаяся на HR, была разработана Barzel et al.210 В этом методе, рекомбинантный AAV8, содержит лишенную промотора, кодон-оптимизированную FIX кодирующую последовательность, обрамляемую последовательностями, гомологичными мышиному локусу albumin. Свиной teschovirus-1 2A-peptide (P2A), кодируемый последовательностью, предшествующей последовательности гена F9, был использован для рибосомального пропуска, чтобы обеспечить считывание бицистронной Alb-FIX мРНК, транскрибируемой с эндогенного Alb промотора и транслируемой в функциональные белки albumin и FIX (Fig. 3). Этот альтернативный подход редактирования in vivo, свободный от нуклеаз, затрагивающий экспрессию FIX на терапевтических уровнях, чтобы частично корректировать проявления спонтанной кровоточивости у мышей с гемофилией.210 Это составило основу LogicBio's proprietary GeneRide технологии и использовало HR-контролируемое точное и целенаправленное in vivo редактирование генов, устраняющего необходимость в управляющем вектором промоторе и создении нуклеаз.211 Кроме того, эта многосторонняя система для in vivo селекции и экспансии ген-модифицированных гепатоцитов, независимо от генетического фона, была разработана с использованием GeneRide.212 Др. недавнее исследование, опубликованное в Homology Medicines продемонстрировало профессиональный уровень и специфичность HR-обеспечиваемой, свободной от нуклеазы инсерции гена в мышиную печень, содержащую клетки человека, используя AAVs, происходящие из человеческих HSCs.213

Figure 3. Schematic showing promoterless nuclease-free editing at the albumin locus. Recombinant AAV8 vector containing a promoterless codon-optimized human coagulation FIX sequence I (green), preceded by the 2A peptide (yellow) and flanked by albumin homology arms (dark blue) that covers the albumin stop codon (red), is designed. Homologous recombination results in integration of the rAAV8 vector into the endogenous albumin locus (light blue) and generates a chimeric bicistronic mRNA, which is translated into two distinct proteins, albumin and FIX, due to the ribosomal skipping. Adapted from Barzel et al.210 AAV, adeno-associated vector; FIX, factor IX. Created with BioRender.com

Хотя этот метод менее эффективен по сравнению с нуклеазами обеспечиваемом редактировании, он может прекрасно работать, предоставляя селективные преимущества отредактированным клеткам.211

Perspective


Сегодня осуществляются несколько клинических испытаний зависимой от нуклеаз генотерапии в надежде облегчить моногенные нарушения, такие как гемоглобинопатии и дистрофия сетчатки. Некоторые примеры включают ex vivo CRISPR-обеспечиваемую генотерапию для β-thalassemia и серповидно-клеточной анемии, известной как CTX001, и находятся в клинической фазе 1/2 испытаний. SB-FIX by Sangamo Therapeutics является in vivo генотерапией, использующей AAVs для доставки ZFNs, чтобы корректировать ген factor IX для лечения гемофилии B. Др. важное исследование в фазе 1 клинического испытания NCT02793856 проводится на базе CRISPR/Cas9 для нокаута гена PD-1 в T лимфоцитах от пациентов с метастатическим nonsmall-cell раком легких. Более того, Allergan and Editas Medicine проводят клиническое испытание терапии по геномному редактированию, EDIT101, для лечения LCA (Table 1). Эти исследования подкрепляют громадный потенциал преобразованных нуклеаз для лечения генетических болезней.
Кроме того, редактирования генов было использовано при иммунотерапии рака с помощью разработки аллогенной CAR-T терапии. ZFN- и TALEN-обеспечиваемое редактирование генов позволяет генерировать аллогенные ассоциированные с опухолью антиген-специфические CAR-T клетки, с незначительной T клеточной иммунной реакцией и graft-versus-host болезнью.25,124,214,215 Более того, CRISPR/Cas9 запускает более быстрое и легкое мультиплексное редактирование генов в CAR-T клетках, которые обладают CD19-специфической противо-опухолевой активностью в ксенотрансплантатах лимфомы у мышиных моделей.216 Аллогенные универсальные T клетки были созданы с использованием one-shot CRISPR техники со множественными sgRNAs в CAR лентивирусном векторе, который одновременно истощает эндогенные Т клеточные рецепторы и HLA 1, элиминируя тем самым быстрое отторжение иммунной системой хозяина.217 Недавнее исследование использовало CRISPR/Cas9, чтобы специфически подавлять иммунные рецепторы218,219, чтобы усилить генерацию "универсальных" CAR-T клеток, это может быть эффективным лечением для AML и др. злокачественных опухолей. Эффективность и безопасность CRISPR/Cas9-отредактированных CAR-T клеток нуждается в оценке в клинике. Проводимые клинические испытания модифицированных универсальных CAR-T клеток проанализированы.115,220,221 Аппарат редактирования CRISPR/Cas устраняет некоторые ограничения, связанные с CAR-T иммунотерапией, усиливая тем самым эффективность готовых к поставке CAR-T клеток и минимизируя их токсичность.222 В целом, эти находки отражают громадные перспективы редактирования генов, как мощной платформы по генерации CAR-T клеток, готовых к терапии. Более того, более 300 клинических испытаний проводится по улучшению CAR активности и расширению их клинического использования.89 Yescarta для диффузной В-клеточной лимфомы взрослых и Kymriah для детской острой лимфобластической лейкемии, подходы одобренные US Food and Drug Administration (FDA) и European Medicines Agency (EMA) стали хитами на рынке. Сгенерированные человеческие CAR-T клетки непосредственно in vivo будут очень пригодны для преодоления дорогой и трудоемкой продукции ex vivo CAR T клеток, переводя их в более приемлемый мир пациентов. В недавнем исследовании нацеленные на CD8, базирующиеся на лентивирусах одиночные системные инъекции CD19-CAR-T клеток в гуманизированных иммунодефицитных мышей, генерирующих in vivo CAR-T клетки, которые успешно устраняли человеческие В-клетки. Это исследование приводило к цитокиновому шторму в гуманизированных мышах и необходимы дальнейшие пре-клинические исследования по тестированию пригодности этого подхода.223 Оценка противо-опухолевой активности в таких in vivo сгенерированных CAR-T клетках была проделана на T клетках, трансплантированных иммунодефицитным мышиным моделям для пре-клинического тестирования CAR-T клеток.224 Успешная in vivo генерация CD19 CAR-T клеток из CD4+ T клеток была описана, как обладающая способностью элиминировать CD19 + клетки и опухолевые клетки у мышей, подчеркивая значение in vivo терапии CAR-T клетками.225 Хотя эти результаты выглядят как многообещающие, действительно ли in vivo сгенерированные CAR-T клетки сравнимы по эффективности с генерированными ex vivo CAR-T клетками, вопрос нуждается в дальнейшей оценке. Оценки на крупных модельных животных необходимы прежде использования in vivo CAR-T клеточной терапии в клинических испытаниях.

Conclusion


Besides gene editing, the CRISPR/Cas toolbox has also been used for gene regulation, epigenetic modification, drug development, and precision medicine providing personalized therapies based on specific targets and diagnostics, extensively reviewed elsewhere.226,227
In general, the CRISPR/Cas system provides a precise platform for ex vivo and in vivo therapeutic gene editing against debilitating genetic diseases. So far, ex vivo editing has been predominantly used to treat hemoglobinopathies, cancers, and immune cell disorders. Since a wide range of genetic diseases require in situ gene modification, in vivo gene editing has the tremendous potential to treat them. While the in vivo approach minimizes the risk of graft-versus-host disease and immunosuppression, there are existing barriers that hinder its clinical translatability. One of the primary bottlenecks of in vivo gene therapy is the targeted delivery of the editing machinery. Currently, AAV vectors are the most popular delivery tools for introducing the transgene and CRISPR/Cas system to target organs. However, the limited packaging capacity, off-target effects, and high production costs are some of the limitations of AAV vector delivery. Alternatively, nonviral delivery methods that allow flexible packaging ability, ease of manufacturing, and have low cytotoxicity have shown promise. Another concern that affects the efficacy and safety of the CRISPR/Cas-mediated in vivo editing is the off-target effects. Further progress in the delivery of viral and nonviral delivery vectors, and CRISPR/Cas components, is necessary to attain clinically relevant levels of gene editing in vivo.
Overall, the in vivo studies demonstrate the ability of both nuclease-mediated and nuclease-free editings as potent gene therapy tools. However, obstacles such as off-target effects, optimum delivery vehicles, HDR efficiency, and immunogenicity of the editing components have not been completely resolved. With innovative gene editing advancements in the future, these bottlenecks will be surmounted, thus bringing in vivo gene editing closer to human therapies.