Наводимые РНК нуклеазы (RGNs), происходящие из адаптивной иммунной системы , были перенацелены на редактирование генома. Благодаря своей легкой программируемости, RGNs революционизировали нашу способность манипуляций с геномом в клетках высших эукариот [1-4].

Среди всё увеличивающегося количества ортологов, наиболее широко используются RGNs, происходящие из II clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)-associated Cas9 (CRISPR-Cas9) системы из Streptococcus pyogenes [5-7]. Эти RGNs работают как состоящие из двух частей молекулярные ножницы, чьими компонентами являются Cas9 нуклеаза и химерная guide RNA (gRNA) [5-7]. Гид-РНК (gRNA) является искусственно созданным одиночным транскриптом, состоящим из искусственно созданной последовательности CRISPR RNA (crRNA), сцепленной с трансактивирующей crRNA (tracrRNA) субъединицей [1, 5, 6]. 5'-конец crRNA (spacer) управляет специфичностью соединения с ДНК последовательностью за счет Watson-Crick спаривания оснований. Однако, прежде гибридизации crRNA с последовательностью мишени, Cas9 необходимо распознать короткий protospacer adjacent motif (PAM), чьей последовательностью является NGG в случае S. pyogenes Cas9 (SpCas9). Затем в 20 нуклеотидов (nt) последовательность, комплементарная геномной ДНК, располагается рядом с PAM, обозначая канонический сайт мишень для RGN комплексов [1, 5-7].

После соединения с сайтом мишенью Cas9 нуклеаза подвергается конформационным изменениям, что приводит к активации её двух нуклеазных доменов (т.e., RuvC и HNH) с последующей генерацией разрывов двойной нити ДНК (DSB) [8, 9]. В соматических клетках млекопитающих DSBs являются вредными геномными повреждениями, устраняемыми с помощью эндогенных путей репарации ДНК, чаще всего посредством пути nonhomologous end joining (NHEJ). Репарация индуцируемых с помощью RGN DSBs посредством NHEJ может давать меленькие инсерции и делеции (indels) в предопределенных позициях генома. Эти indels могут быть использованы для функционального нокаута генов и/или ДНК мотивов, а также для восстановления оказавшихся вне рамки кодирующих последовательностей [1, 2].

Пространная характеризация структур SpCas9 и gRNA [8-12], эффективности и специфичности RGN-обеспечивания редактирования генома постоянно улучшаются за счет рациональной разработки индивидуальных компонентов CRISPR-Cas9 или направленной эволюции белков [4]. Напр., мутации в регионах, взаимодействующих с PAM составляют основу для SpCas9 вариантов с альтернативной PAM специфичностью [13, 14]. Более того, замены аминокислот N497A/R661A/Q695A/Q926A и N692A/M694A/Q695A/H698A давали высокой специфичности SpCas9-HF1 и HypaCas9 варианты, соотв. [15, 16]. Эти мутации локализованы внутри REC3, некаталитического домена SpCas9, участвующего в распознавании RNA-DNA гетеродуплекса и в активации конформации HNH нуклеазного домена [15, 16]. Поэтому путем вмешательства в proofreading активность, ранее упомянутые мутации alanine в SpCas9-HF1 и HypaCas9 повышали порог активации конформации HNH, приводя к усилению специфичности выше SpCas9 дикого типа [15, 16]. В др. исследовании замена остатков, взаимодействующих с нитью ДНК, не являющейся мишенью, (т.e., K848A/K1003A/R1060A), как было установлено, наделяют вариант высокой специфичностью к eSpCas9(1.1) [17]. Нуклеаза eSpCas9(1.1) обнаруживает тенденцию усиливать свое влияние на мишень ещё больше, чем SpCas9-HF1 [16, 18, 19].

Параллельно были предприняты попытки по улучшению компонентов gRNA. Напр., с укороченным 5'-концом gRNAs путем уменьшения nts (Tru-gRNAs), могут уменьшать активность разрезов RGN вне мишени [20]. Более того, мутации, разрушающие терминатор латентной RNA polymerase III (Pol-III) комбинируются с расширением локализации duplex между crRNA и tracrRNA половинками, приводя к оптимизации каркаса gRNA, что может улучшать работу RGN, главным образом, за счет увеличения экспрессии gRNA и стабильности в клетках мишенях [21, 22].

Несмотря на постоянные усилия по оптимизации компонент CRISPR-Cas9, дальнейшие улучшения доставки в клетки и расщепления мишени ДНК остается потребность в улучшении редактирования генома в клетках человека [2, 23]. Здесь мы собрали RGNs, содержащие оптимизированные SpCas9 и gRNA компоненты. В частности, мы исследовали эффекты на локализацию в ядре и частоты затрагивающих мишени DSB для RGNs, содержащих высокой специфичности eSpCas9(1.1) нуклеазы с двумя или 4 nuclear localization signals (NLSs). NLSs являются небольшими пептидами, которые обеспечивают импорт в ядро молекулярных грузов, которые сцеплены или с искусственными конструкциями, или присутствуют в нативных белках [24, 25]. Более того, мы тестировали пригодность сцепленных gRNAs, обладающих оптимизированными каркасами [22] в eSpCas9(1.1) с двумя или 4 NLSs. Мы установили, что наделенные высокой специфичностью eSpCas9(1.1) нуклеазы [17], называемые после этого eCas9.2NLS, с двумя дополнительными NLSs (eCas9.4NLS) улучшают компартментализацию белка в ядре, приводя в конечном итоге к усилению формирования в мишени DSB. Чтобы ещё больше повысить доставку, а, следовательно, пригодность этих инструментов, мы упаковывали крупные экспрессионные единицы, кодирующие SpCas9 варианты во второго поколения аденовирусные векторы (AdVs). В противоположность др. рекомбинантным вирусным системам, напр., лентивирусным и adeno-associated viral vectors, AdVs имели определенную эписомную природу и способность к упаковке крупных грузов, что позволяло осуществлять высокого уровня transitory экспрессию значительного размера RGN-кодирующих трансгенов in vitro и in vivo [26-30].



a Schematic representation of the constructs deployed to express the CRISPR-Cas9 components. The hybrid CAG promoter is composed of sequences from the cytomegalovirus (CMV) immediate-early enhancer, the first exon/intron of the chicken β-actin gene, and the splice acceptor of the rabbit β-globin gene. Magenta stripes, nuclear localization signal (NLS) from the SV40 large T antigen; cyan stripes, NLS from the nucleoplasmin ofXenopus sp.; rBGpA, rabbit β-globin polyadenylation signal; U6, RNA Pol-III promoter from the human U6 gene; opt-gRNA, gRNA with an optimized tracrRNA; red stripes, nt differences between conventional gRNA and opt-gRNA scaffolds. b SpCas9 immunofluorescence microscopy on HeLa cells. HeLa cells transfected with the indicated combinations of constructs were stained for SpCas9. Two representative fluorescence microscopy images for each experimental condition were acquired at 5 days post transfection. The staining for SpCas9 proteins and DNA was performed with an antibody specific for the C-terminus of SpCas9 and DAPI, respectively. The white horizontal bar corresponds to 30 µm.

Доставка программируемых нуклеаз в клетки мишени остается основной проблемой для широкого использования осуществляемого с помощью RGN редактирования генома. Хотя сцепление крупных прокариотических Cas9 белков (~160 kDa) с NLS мотивами обычно используется для управления их транслокации в ядра клеток эукариот, поэтому Cas9 белки и их варианты в основном соединяли с одним или двумя NLSs [5-7, 17, 47]. Кроме того, беспристрастная количественная оценка уровней транслокации в ядро и тщательная оценка влияния композиции NLS на работу RGN не была проделана. Чтобы это осуществить, мы исследовали эффекты ядерной локализации и целенаправленного расщепления ДНК нуклеазами SpCas9, содержащими разные композиции NLS. В этих экспериментах, мы использовали состоящий из одной части NLS пептид (PKKKRKV), идентифицированный в SV40 крупном Т антигене [48, 49] и состоящие из двух частей NLS (KRPAATKKAGQAKKKK), обнаруженные у Xenopus sp. в белке nucleoplasmin [50]. Эти NLS мотивы использовали классический NLS-обеспечиваемый путь транспорта в ядро. Итак, SV40 крупный Т антиген и nucleoplasmin NLSs соединяли с клеточным importin-α который после димеризации с importin-β, обеспечивает транслокацию прикрепленного груза из цитоплазмы в ядро посредством комплексов ядерных пор [24, 25]. В данном исследовании количественный и беспристрастный иммунофлуоресцентный микроскопический анализ продемонстрировал, что eCas9.4NLS нуклеаза накапливается в 2.3-раза больше в ядре, чем родительский eCas9.2NLS белок [17].

Эксперименты, осуществленные на HEK.EGFPTetO.KRAB репортерных клетках [34, 40,45] позволили нам опробовать работу SpCas9 белков с разным расположением NLS, чтобы целенаправленно воздействовать на ДНК, предмет альтернативных конформаций хроматина. Полученные данные подтвердили, что RGNs с eCas9.2NLS или eCas9.4NLS пригодны для проникновения в ДНК в KRAB-impinged гетерохроматин лучше, чем Cas9. Хорошо бы исследовать, действительно ли эта тенденция является простым результатом увеличения концентрации нуклеазы SpCas9 в ядра клеток мишеней и/или результатом локальных изменений ассоциации ДНК-гистоны, вызываемыми высоким катионовым характером SpCas9-сцепленных NLS мотивов.

Мы также оценили новые комбинации компонентов RGN, продемонстрировав, что высокая специфичность eCas9.2NLS и eCas9.4NLS нуклеаз сравнима с opt-gRNAs. Важно, что после применения количественной системы обнаружения эффектов вне мишени, мы объединили данные, продемонстрировавших, что улучшенные RGNs, состоящие из opt-gRNAs связанных с eCas9.2NLS или eCas9.4NLS, сохраняют специфичность расщепления ДНК, которая выше, чем та, что с их Cas9 аналогом.

Потенциальным ограничением конструкции, кодирующей SpCas9 нуклеазы, являются разные гетерологичные мотивы (напр., NLSs) и безусловно крупные регуляторные элементы (напр., CAG промотор) , которые затрудняют их доставку в трансфицируемые клетки. Чтобы преодолеть это узкое горлышко, мы создали AdVs, кодирующие Cas9, eCas9.2NLS или eCas9.4NLS. Более того, мы использовали преимущества механизмов трансдукции AdV для внесения четко определенных количеств разных SpCas9 белков в клетки человека. Мы осуществляли эти эксперименты на eGFP-позитивных HeLa клетках и миобластах, изолированных от пациентов с X-сцепленными нарушениями мышц DMD. eGFP-позитивные HeLa клетки служат в качестве системы с потерей клеточной функции, которая позволяет определять уровни нокаута гена, запускаемого с помощью AdVs, кодирующих Cas9, eCas9.2NLS или eCas9.4NLS. Важно, что воздействие на клетки мишени умеренных доз AdV.eCas9.4NLS приводит к более высоким уровням нокаута eGFP, чем те, что достигаются при использовании тех же доз AdV.Cas9 или AdV.eCas9.2NLS. От пациентов с DMD полученные миобласты были использованы в качестве клеточной системы с избыточной функцией, исходя из трудностей с трансфекцией клеток. В этой системе RGNs были использованы для запуска NHEJ-обеспечиваемой репарации дефекта рамки считывания DMD. В этих экспериментах мы установили, что сравнение доз AdV показывает, что eCas9.4NLS превосходит eCas9.2NLS, тем самым делая более мощной коррекцию рамки считывания DMD. Улучшение работоспособности AdV.eCas9.4NLS как ожидается будет особенно благоприятным при экспериментах, которые требуют минимизации воздействия на клетки мишени компонентов вирусного вектора и доставки ген-редактирующего инструмента.

NLSs имеют сцепление не только с RGNs, но и с др. типами программируемых нуклеаз, таких как zinc finger нуклеазы и подобные активаторам транскрипции эффекторные нуклеазы [51-55]. Конечно, когда доставляемые программируемые нуклеазы действуют как белки, то NLSs, благодаря своему сетевому позитивному заряду, по-видимому, оперируют как белок-трансдуцирующие домены, помогая тем самым проникновению в клетку [52, 54, 55]. Т.о., эти исследования не могут установить строго вклад NLSs в транслокацию в ядро per se из-за их одновременного участия в проникновении в клетку программируемых нуклеаз [52, 54, 55]. В данной работе путем использования AdV-обеспечиваемой экспрессии разных NLS-сцепленных SpCas9 нуклеаз, мы оказались способны четко продемонстрировать, что выгода от преобразований Cas9 благодаря включению большего количества последовательностей NLS , чем использовали до сегодня. Доказательства, что методы доставки или экспериментальные улучшения могут влиять на активность Cas9 нуклеаз при добавлении разно расположенных NLS и от их количества [56, 57]. Напр., Torres-Ruiz et al. использовали трансфекции плазмид, чтобы вносить в клетки человека RGNs, содержащие Cas9 нуклеазы с одиночным SV40 NLS на C-конце или с этим NLS на C-конце и nucleoplasmin NLS на N-конце [57]. Эти эксперименты показали, усиление проникновения в ядро и активности по расщеплению ДНК с помощью 2NLS-содержащих белков в HEK293 клетках и мезенхимных стволовых клетках людей [57]. Наше пошаговое сравнение высокой специфичности Cas9 варианта одинаково ограниченного на флангах с помощью SV40 и nucleoplasmin NLSs (т.e., eCas9.2NLS) и их производных, наделенных двумя добавочными SV40 NLSs (i.e., eCas9.4NLS) показало, что последняя конструкция обеспечивает превосходное проникновение в ядро и активность расщепления ДНК мишени, при этом сохраняется большая часть высокой специфичности, присущей родительскому eCas9.2NLS белку.

Мы приходим к заключению, что преобразование SpCas9 белков дополнительными NLSs является прямой и эффективной стратегией по усилению производительности RGNs и возможности дальнейшего улучшения посредством дополнительных оптимизаций их содержания NLS. Наконец, тестирование и использование возникающих в результате оптимизации инструментов редактирования генов при генотерапии даст преимущества в отношении их интеграции с системами вирусных векторов, таких которые теперь используют CD46-targeting AdV платформу. Эта платформа доставки генов д. обеспечивать стоихометрическую доставку "all-in-one" оптимизированных RGN компонентов в терапевтически соответствующие типы клеток.