Liu et al.1 сообщили о новой разработке липидных наночастиц (LNPs) , в которых способные к ионизации со многими хвостами фосфолипиды (iPhos) образуют активный компонент и это облегчает избегание эндосом и тем самым улучшает доставку мРНК и/или single-guide (sg)RNA для редактирования генов in vivo . LNPs состоят из наиболее подходящих iPhos и разных вспомогательных липидов - zwitterionic липидов, способных к ионизации катионных липидов и постоянно катионные липиды достигают избранного органа мишени (SORT) и обеспечивают орган-специфическое CRISPR-Cas9 редактирования генов в селезенке, печени и легких мышей, соотв.¹

Основным препятствием генотерапии, базирующейся на ДНК/РНК, является доставка молекул нуклеиновых кислот в клетки мишени. Чтобы проникнуть в клетки эти молекулы д. быть инкапсулированы в специализированные векторы, т.к. клеточные мембраны прирожденно непроницаемы для голой ДНК или РНК. В последнюю декаду, не вирусные векторы привлекли повышенное внимание благодаря своей способности доставлять и/или совместно доставлять разные грузы для генотерапии (DNA, siRNA, mRNA, и т.д.), также благодаря своей более легкой продукции, умеренной иммуногенности, относительно низкой токсичности и пригодностью для повторного введения дозы.^2,3 Среди доступных вариантов не вирусных векторов, LNPs оказываются наиболее разработанными. Они обычно состоят из многих единиц, включая (1) катионные липиды, содержащие ионизируемые амины. Последние положительно заряжены при низком pH во время производства LNP, чтобы облегчить энкапсуляцию негативно заряженных ДНК/РНК. Напротив, они относительно нейтральны при физиологических pH и избегают образования крупных комплексов (наблюдавшихся ранее в LNPs при использовании постоянных катионных липидов), и снова получает протон в эндосоме, чтобы вызвать выход из эндосомы. Более того, LNPs представлены (2) zwitterionic фосфолипидами в качестве помощника или структурных липидов, которые напоминают липиды клеточной мембраны, (3) polyethylene glycol (PEG) липидом, чтобы создать гидратируемый слой, окружающий наночастицу, и (4) холестерол, чтобы стабилизировать наночастицы (Fig. 1a).2

Fig. 1 Structure and function of designed iPhos containing ionizable amines. a Structure and composition of LNP. b Proposed mechanism of cationic lipid and iPhos-mediated membrane disruption and endosomal escape. Adapted from Liu et al.1 and Semple et al.4 c Rationally designed iPhos with one ionizable amine, one phosphate group, and three alkyl tails (x and y indicate the carbon lengths). The ionizable amine is neutral at physiological pH, but positively charged in the endosome. Adapted from Liu et al.1 d Four classes of iPhos. See text for details

Несмотря на недавний прогресс в разработке LNP, эффективность доставки RNA/DNA современной генерацией LNP остается довольно низкой. LNPs проникают в клетки посредством эндоцитоза и затем перемещаются в эндосомы. Отсюда только 1-4% LNPs выходит и высвобождает ДНК/РНК в цитозоль, это в основном объясняет низкую эффективность LNP. Предполагаемый механизм избегания LNPs заключается во взаимодействии между катионными липидами в LNP с анионовыми липидами эндосомных мембран, вызывает образование не двуслойной гексагональной фазы HII, что приводит к разрушению мембраны эндосомы (Fig. 1b).^3,4 Предыдущие исследования были в основном сконцентрированы на оптимизации ионизируемых катионных липидов, тогда как zwitterionic фосфолипиды рассматриваются как вспомогательные липиды, необходимые для формирования LNPs и остаются неиспользованными. Интересно, что zwitterionic фосфолипиды напоминают липиды, формирующие эндосомные мембраны, использующие свой потенциал для слияния с мембранами эндосом и тем самым запускается разрушение мембраны.

Согласно этой гипотезе и благодаря своему опыту оптимизации катионных липидов, Liu et al. рационально создали серию со многими хвостами, способными к ионизации zwitterionic фосфолипидами, наз. iPhos, которые содержат ионизируемые амины, фосфатные группы и три гидрофобных alkyl хвоста (Fig. 1c). Подобно ионизируемым катионным липидам, ионизируемые амины в iPhos обеспечивают pH-зависимое разрушение мембран. При физиологических pH, аминогруппа не присоединяет протон и iPhos с негативно заряженными фосфатными группами не могут сливаться в анионовыми биологическими мембранами. Напротив при низком pH в эндосоме, аминогруппа оказывается заряженной положительно, чтобы сформировать zwitterionic головку вместе с фосфатной группой, которая способна взаимодействовать с мембраной эндосом и формировать HII фазу (Fig. 1b, c).¹

При первоначальном скрининге авт. оценивали доставку мРНК in vitro и выявили 4 класса iPhos, которые смешивали с простыми ионизируемыми катионоыми липидами помощниками N-methyldioctadecylamine (MODA), холестеролом и 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxy(poly(ethylene glycol-2000)) (DMG-PEG2000) (25:30:30:1 mol/mol), чтобы сформировать iPhos LNPs (iPLNPs). Хотя iPLNPs содержат те же самые 4 компонента, типичные для LNPs, ключевым компонентом, который был оптимизирован в данной работе, стал iPhos вместо катионного липида. Для функциональной оценки iPLNPs были затем использованы для доставки мРНК luciferase в линию клеток опухоли яичников IGROV1. Как и ожидалось iPhos с одиночной ионизируемой zwitterionic головкой и тремя хвостами (Fig. 1d, i) обнаруживали самую высокую эффективность, тогда как iPhos с одиночной ионизируемой zwitterionic головкой и двумя хвостами (Fig. 1d, ii) оказались менее мощными, т.к. их небольшие хвосты не позволяли формировать форму конуса, необходимую для индукции HII фазы. Более того, iPhos с неизменной zwitterionic головкой (Fig. 1d, iii) были лишены структурной гибкости, необходимой для интернализации в эндосомы и iPhos со многими zwitterions (Fig. 1d, iv) проникали с низкой эффективностью в мембраны эндосом из-за их крупной головки.¹

Чтобы подтвердить, что правильно сформированные iPhos индуцируют выход из эндосом за счет механизма разрушения мембран, авт. исследовали фазу трансформации, используя 31P NMR спектроскопию. В самом деле, наблюдаемый пик соответствовал фазе гексогональных HII после смешивания воспроизводящих эндосомные липосомы и iPLNPs. iPhos-вызываемое нарушения мембран были также подтверждены данными модели гемолиза и с помощью метода fluorescence resonance energy transfer (FRET).¹

Общая проблема в исследованиях векторов - это перевод функциональных возможностей вектора in vitro в условия in vivo. Чтобы решить эту проблему, Liu et al. отобрали 51 вариант iPhos в результате скрининга in vitro для исследования in vivo. Этот важный эксперимент подтвердил, что iPhos с одной ионизируемой zwitterionic головкой и тремя хвостами оказались также более эффективными и in vivo как при низкой (0.1 mg/kg), так и высокой дозе мРНК mRNA (0.25 mg/kg). Авт., кроме того, сравнивали наиболее подходящий iPhos 9A1P9 с полностью используемыми фосфолипидами 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) и 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), и обнаружили 40- до 965-кратного увеличения эффективности in vivo, это подтвердило, что усиленная эффективность трансфекции iPLNP обусловливается с помощью iPhos, а не с помощью каких-либо др. компонентов. Интересно, что хотя механизм неясен, длина alkyl цепочки обеспечивает эффективность и избирательность. Детальнее, длина в 8-10 углеродов на amine стороне обнаруживает наивысшую эффективность, в то время как длина углеродов на фосфатной группе влияет на избирательность, начиная с 9-12, обнаруживая тропизм к печени, а длина в 13-16 углеродов обнаруживает тропизм к селезенке.¹

Кстати, большинство LNPs обнаруживает эффективную доставку лишь в клетки паренхимы печени, т.e., гепатоциты. Интересно, что в предыдущей работе авт. разработали SORT LNPs и предположили, что внутренний заряд может быть ключом тканевого тропизма. В самом деле, они установили, что zwitterionic/anionic, ионизируемые, катионные или постоянно катионные липиды могут приводить к избирательной доставке мРНК в селезенку, печень или легкие, соотв.⁵ Затем, Liu et al. комбинировали iPhos и свой SORT метод, путем смешивания их наиболее пригодного iPhos 9A1P9 с zwitterionic липидами (DOPE), способными к ионизации катионными липидами (MDOA, 1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane (DODAP) и 5A2-SC8), или постоянно катионными липидами (dimethyldioctadecylammonium bromide salt (DDAB) и 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP)) в качестве липидов помощников. Безусловно, это сделало возможной избирательную доставку мРНК в селезенку, печень и легкие с помощью внутривенного введения мышам. Дальнейшая надежда относительно клинического использования стало то, что внутривенное введение Cas-mRNA/sgRNA мышам с помощью избирательного для печени 9A1P9-5AS-SC8 iPLNP или избирательного для легких 9A1P9-DDAB iPLNP привело к орган-специфическому CRISPR/Cas-обусловленному редактированию генов (тотальная доза РНК: 0.75 mg/kg). Чтобы подтвердить огромный потенциал для клинического использования, авт. продемонстрировали, что iPLNPs можно продуцировать в крупных масштабах, используя microfluidic смешивание, сохраняя эффективность и орган-специфическую доставку, делая возможными повторные инъекции и были безопасными в используемых дозах.¹

Это исследование продвигает фосфолипиды из неисследованного вспомогательного компонента LNP к главному ключевому игроку в дизайне невирусных векторов и, таким образом, значительно расширяет репертуар стратегий для оптимизации LNP. Полученные данные о том, что эта новая конструкция LNP обеспечивает высокоэффективную и органо-специфичную доставку мРНК, а также CRISPR / Cas-опосредованное редактирование генов in vivo, являются высокоинформативными и многообещающими для многочисленных приложений, включая генную терапию человека.

Membrane-destabilizing ionizable phospholipids for organ-selective mRNA delivery and CRISPR–Cas gene editing Shuai Liu, Qiang Cheng, Tuo Wei, Xueliang Yu, Lindsay T. Johnson, Lukas Farbiak & Daniel J. Siegwart Nature Materials volume 20, pages701–710 (2021)