Первоначальные подходы включали добавление функционального гена в мутантные клетки для компенсации болезненного фенотипа.4 Это замечательный подход для рецессивных моногенных болезней в результате потери функции, таких как CF, но не эффективен для доминантно негативных или болезней за счет избыточности функции. Стратегия добавления гена широко использует конституитивные промоторы, чтобы экспрессировать интересующий ген, но кондиционные или эндогенные промоторы также используются. Экспрессия интересующего гена может быть преходящей или постоянной в зависимости от терапевтической стратегии, использования технологий геномной интеграции или эписомного поддержания векторной ДНК. Примером стратегии добавления гена будут рассмотрены позднее.

Системы CRISPR/Cas сегодня классифицируются на 6 типов (I-VI), каждый с уникальным набором Cas нуклеаз, большая часть радактирований генов у млекопитающих осуществляется за счет использования Cas9 (type II), происходящей из Streptococcus pyogenes (spCas9).5

spCas9 является мультифункциональным, мультидоменовым белком, представленным 1368 аминокислотами.5 Во время процесса редактирования гена Cas9 и guide RNA (gRNA), состоящая из crRNA и tracrRNA последовательностей, которые взаимодействуют с Cas9, и вносятся в клетку.5 gRNA распознает и соединяется в ДНК мишенью вблизи места protospacer adjacent motif (PAM). Домен PAM interaction (PI) в Cas9 распознает и взаимодействует с последовательностью PAM.5,9 Cas9 разрезает ДНК на 3 пары оснований (bp) выше PAM сайта с помощью двух самостоятельных нуклеазных доменов, HNH-подобного эндонуклеазного домена, который разрезает нить, комплементарную guide последовательности (нить мишень) и RuvC-подобный домен, который разрезает не являющуюся мишенью нить ДНК, приводя к разрыву двойной нити (DSB) в геноме.5,9,10 Такой DSB запускает механизм репарации клеточной ДНК, приводящий в результате или к (1) склонному к ошибкам nonhomologous end joining (NHEJ) и приводящий к insertions или deletions (indels), что часто приводит к сдвигу рамки считывания или нонсенс мутациям или (2) homology-dependent repair (HDR), которая нуждается в матрице в форме однонитчатой ДНК (ssDNA) или двунитчатой ДНК (dsDNA), несущей необходимую модификацию.5 HDR может также использовать др. аллель хозяина в качестве матрицы, приводя к неотредактированному исходу.11-13 HDR существенно менее эффективна, чем NHEJ, и она возникает только во время G2 и S фаз цикла репликации, тогда как NHEJ может возникать в ходе всего клеточного цикла.5,12

Хотя большинство CRISPR редактирований генов осуществляется с использованием spCas9, некоторые и др. Cas варианты также обнаруживают выдающиеся результаты. Второго типа II Cas белок, наз. CRISPR из Prevotella and Francisella 1 (Cpf1) или Cas12a, был разработан для редактирования генов у млекопитающих.5,14 Cas12a имеет 4 домена: RuvC-I и RuvC-II нуклеазные домены, a/beta домен и zinc finger. В отличие от Cas9, Cas12a лишен HNH-нуклеазного домена, поэтому имеет меньший вес, что является преимуществом для некоторых подходов доставки.5 Вместо создания обрубленных концов DSB, таких ка у spCas9, Cas12a вызывает ступенчаты разрезы, создавая преимущества для knock-in стратегий.5 Cas12a распознает богатый T сайт PAM, скорее, чем богатый G сайт PAM, распознаваемый Cas9.5,15 Это отличие в распознавании PAM может сделать возможным доступ к целенаправленному воздействию на дополнительные сайты генома, которые с трудом поддаются целенаправленному воздействию Cas9; однако, Cas12a , как было установлено, обладает более низкой способностью к продукции indel.15 Продукция Indel может быть увеличена с помощью модификации gRNA с добавлением 8-meric uridinylate-богатого 3' довеска.15 Cas12a также обладает более низким показателем редактирования вне мишени, чем Cas9,16 возможно создавая менее безопасный инструмент для клинического использования. Доставка Cas12a ribonucleoprotein (RNP) в воздушные пути с помощью amphiphilic пептидов достигает в среднем эффективности редактирования в 12% в крупных воздушных путях и 10% в мелких воздушных путях ROSAmT/mG мышей.17 Все клетки у таких мышей содержат tdTomato кассету, фланкированную loxP последовательностью в Rosa26 локусе, a делеция tdTomato с помощью двойного Cas12a целенаправленного воздействия приводит к локальной флуоресценции GFP.17 Это исследование показало, что прямое прицельное использование Cas12a RNPs на эпителий дыхательных путей, становится выдающейся областью при легочных болезнях.

Кроме того, преобразование белков может улучшать эффективность и специфичность редактирования с помощью Cas12a и Cas9.18,19 Используя фагами обеспечиваемую непрерывную эволюцию, которая управляется постоянным отбором желательного фенотипа, связанного с продукцией инфекционных фагов, содержащих эволюционирующий ген,20 были разработаны варианты spCas9 для распознавания non-NGG и non-G PAM последовательности.21,22 Направленная эволюция или преобразование белка spCas9 может улучшать специфичность обнаружения мишени и делать возможным целенаправленное воздействие сайтов, ранее недоступных, предоставляя лучшие альтернативы для нативного spCas9 редактирования генов в некоторых случаях. В настоящее время использование Cas9 вариантов, которые распознают non-NGG и non-G PAM последовательности, xCas9(3.7) и SpCas9-NG, только начинает оцениваться в культурах клеток и у растений.23-26

Новый Cas вариант, разработанный для редактирования генов у млекопитающих происходит от Deltaproteobacteria, назван CasX или Cas12e.5,27 Это один из самых небольших Cas белков менее, чем с 1000 аминокислот,27 предоставляет преимущества для упаковки в adeno-associated virus (AAV) , оставляя пространство для др. ген редактирующих инструментов. Подобно Cas12a, Cas12e также создает ступенчато-образные DSB, но использует более длинную последовательность PAM из TTCN.27 Эффективность возникновения indel и показатели эффектов вне мишени пока не определены, но малый размер и непатогенное происхождение обеспечивают преимущества.

Cas варианты были также разработаны для эпигенетического контроля генов мишеней. Ферментативно деактивированные Cas9 (dCas9), которые не могут разрезать ДНК всё ещё сохраняют способность соединяться с мишенью были слиты с активаторным или репрессорным доменами, чтобы усиливать или подавлять экспрессию генов, соотв.5,28-31 Обозначенные CRISPRa, если с активаторным доменом и CRISPRi , если с репрессирующим доменом, эти варианты Cas делают возможным обратимый эпигенетический контроль специфических генов. Стратегия CRISPRa, как было установлено, эффективно предотвращает мышечный фиброз и паралич, а также ослабляет паралич задних конечностей у мышей, моделирующих muscular dystrophy type 1A (MDC1A) благодаря усилению активности гена LamaA1.32

Редактирование оснований предоставляет более эффективный метод модификации одиночных нуклеотидов, чем HDR.33 Произошедший из каталитически неактивного spCas9 редактор оснований с помощью Cas9 аппарата соединяется с ДНК мишенью и вызывает смещение небольшого сегмента ssDNA в структуру R-loop без создания стандартного разрыва.33 Редактор оснований затем создает изменение одиночного нуклеотида в R петле. Существует два типа редакторов оснований: (1) cytidine base editors (CBEs), которые превращают C-G bp в T-A bp и (2) adenine base editors (ABEs), которые превращают A-T bp в G-C bp. ABEs обеспечивают продукт очень высокой частоты (~99.9%) и с низкой частотой indels (обычно ~0.1%) в культурах клеток и у мышей,34 по сравнению с конверсией CBE пар оснований с 60-98% чистотой продукта.33,35 Это, как полагают, связано с экспрессией uracil N-glycosylase (UNG), т.к. UNG-/- клетки обладают повышенной специфичностью редактирования оснований.33,35 Редактирование оснований обладает потенциалом корректировать многие моногенные нарушения, при этом ABEs обладают потенциалом корректировать почти половину из всех патогенных мутаций у человека.36 При CF, 15% известных мутаций одиночных пар оснований потенциально могут быть откорректированы с помощью CBEs и 46% с использованием ABEs (CFTR2.org). Единственным ограничением для редактирования оснований является присутствие пригодного сайта PAM в сайте мишени. ABE варианты были недавно созданы для использования альтернативных PAM последовательностей, это делает возможным доступ к регионам генома, которые ранее были недоступны.37 Доставленные мРНК , кодирующие CBE и gRNA успешно осуществляют редактирование оснований в ооцитах мышей и саиней.38,39 Химически модифицированные мРНК, кодирующие ABE и gRNA могут быть использованы, чтобы редактировать в общем-то устойчивые к трансфекции клетки.40 Split intein AAV векторы предлагают др. систему доставки для редакторов оснований. Техника редактирования оснований была использована для создания новых мышиных, кроличьих овечьих моделей и обладает широким потенциалом для редактирования оснований в исследованиях по генотерапии.41-45

Prime редактирование, новое использование spCas9, позволяет модифицировать более одного нуклеотида с более значительной эффективностью, чем стратегия Cas9-HDR. В этом случае модифицированная spCas9 (nickase) вызывает однонитевой разрыв.46 Слияние с обратной транскриптазой и использование преобразованной guide RNA (prime editing guide RNA [pegRNA]) позволяет nicked ДНК действовать как праймер для обратной транскрипции матрицы pegRNA в ДНК, приводя к желательному генетическому изменению.46 Эта стратегия облегчает более крупные альтерации, чем редактирование оснований, но с большей эффективностью и меньшим возникновением indel, чем обычная система CRISPR/Cas9.

Prime редактирование может существенно расширить возможности использования генотерапии, при этом оно обладает способностью целенаправленно воздействовать на более чем 89% мутаций, вызывающих болезни.46 Кстати эта технология была протестирована только на линиях культивируемых клеток и её эффективность in vivo ещё предстоит изучить. Prime editors (PEs) значительно крупнее, чем белок Cas9, а эффективную доставляющую систему предстоит ещё разработать и оптимизировать. Кроме того, PE комплементарная ДНК (cDNA) превосходит способность упаковки рекомбинантными адено-ассоциироваными векторами. Наконец, pegRNAs, которая может быть значительно длиннее, чем обычная gRNAs, может влиять на эффективность доставки, если используется не вирусный вектор. Альтернативные или модифицированные методы доставки PE, скорее всего, необходимо будет разработать для эффективного редактирования в специфических типах клеток и in vivo.

Сложная архитектура легких позволяет эпителиальным поверхностям быть прямыми мишенями для доставки терапевтических грузов. Местное применение с помощью ингаляции делает возможным непосредственное воздействие на эпителиальные клетки, выстилающие воздушные пути и воздушные пространства. При лечении векторами или клетками, подходы по системной доставке через сосудистую систему неэффективны. Поэтому большинство пульмональных генотерапий используют аэрозоли. Хотя легкие делают возможной орган-специфическую доставку, легочная архитектура и иммунные реакции составляют труднопреодолимые барьеры для эффективной доставки.

Слой слизи, присутствующий в крупных и малых воздушных путях представляет собой сеть из гель-образующих муцинов. Муцины являются крупными полимерными макромолекулами, содержащими негативно заряженные гликаны.47 Секретируемые муциновые остатки располагаются в airway surface liquid (ASL). ASL возникает благодаря секреции из подслизистых желез и поверхности эпителия и является богатым источником секретируемых защищающих хозяина пептидов и белков, антител и collectins surfactant proteins (SPs), SP-A и SP-D. Вирусные и не вирусные векторы могут быть лишены подвижности и инактивированы в этом слое посредством мультивалентных взаимодействий с муцинами, такими как электростатические и гидрофобные взаимодействия и образование водородных связей.48,49 Пространственные обструкции также могут вносить вклад в вектора иммобилизации. Векторы, заловленные в муцины, также могут быть освобождены посредством mucociliary clearance (MCC). Антитела могут перемещаться беспрепятственно внутри слизи и ASL у людей, но Fc регионы могут формировать низкого сродства взаимодействия со слизью.49-51 Нейтрализующие антитела против вирусных векторов, особенно AAV и AdV, присутствуют в секретах воздушных путей некоторых здоровых и больных индивидов 52-54

Антитела, соединяющиеся с вирусными векторами внутри ASL могут приводить к их агрегации и очистку, снижая трансдукцию. Повторное использование AdV или AAV векторов приводит к развитию нейтрализующих и анти-капсидных антител, потенциально снижающих эффективность.55,56 Однако, повторное использование лентивирусных векторов (LVs) у мышиных моделей не приводит к возникновению системных или локальных нейтрализующих антител.57,58

Недавнее исследование показало, что иммунные реакции могут быть устранены с помощью вариантов Cas9 .59 S. pyogenes and Staphylococcus aureus являются широко распространенными комменсалами у людей, которые также могут действовать как патогены и неудивительно, что ряд популяций людей может обладать предсуществующими гуморальными и/или клетками-опосредованными реакциями. Исследования доставки с помощью AAV Cas9 у модельных мышей продемонстрировали, что иммунные реакции могут быть устранены в ответ на экспрессию Cas9 белка. Использование AAV-доставляемых SaCas9 (AAV-CRISPR) в скелетные мышцы приводит к инфильтрации CD4+ и CD8+ T клеток и к продукции anti-Cas9 антител.60 Системно доставляемые AAV-CRISPR также могут приводить к гуморальному ответу у мышей,61 к появлению SaCas9-специфических memory T клеток, приводя к снижению эффективности после повторного введения,62 и к CD8+ T cell-обеспечиваемому убийству клеток, экспрессирующих SaCas9 in vivo.63

Человеческая сыворотка также может содержать предсуществующие антитела против Cas9 вариантов. Immunoglobulin G (IgG) антитела, нацеленные на SaCas9 и SpCas9 были обнаружены у 86% и 73% доноров, соотв., в крови из пуповины от 22 доноров.64 В периферической крови от 12 здоровых доноров, 67% доноров содержали anti-SaCas9 антитела и 42% anti-SpCas9 антитела.64 В исследовании на большой выборке из 200 доноров, 19% и 4.5% доноров обнаруживали потенциально позитивные SaCas9 и SpCas9 антитела, соотв. 65 Из этих протестированных доноров только 5% и 1.5% с anti-SaCas9 и anti-SpCas9 антителами были исследованы более строго в тестах, подтвердивших антитела, нацеленные на Cas9, могут не быть распространенными в генеральной популяции.65

Обусловленные клетками реакции в отношении белков Cas9 у людей также были описаны. В периферической крови людей моноядерные клетки, стимулированные SpCas9 или Cas12a приводили к активации T эффекторных и T регуляторных клеток.66 Хотя SpCas9-реактивированные T регуляторные клетки могут смягчать пролиферацию эффекторных Т клеток, обогащенные SpCas9-реактивные эффекторные Т клетки, как было установлено, специфически нацелены и лизируют линии лимфобластоидных B клеток, экспрессирующих SpCas9,66 подтверждая, что адаптивная иммунная реакция может противодействовать терапевтическим попыткам CRISPR. Необходимы дальнейшие исследования иммунной реакции на SpCas9 и SaCas9 у людей, чтобы определить эффективность этих белков в клинических условиях.

Попытки супрессировать иммунные реакции хозяина на Cas9 белки включают временную иммуносупрессию и модификации Cas9. Иммунодоминантные T клеточные эпитопы SpCas9 для HLA-A*02:01, наиболее распространенный HLA тип в Европе и у белых Сев. Америки, были идентифицированы и мутации MHC-binding якорных остатков этих эпитопов приводили к снижению активации Т клеток.67 Эти модификации не влияли на функцию или специфичность SpCas9, подтверждая, что такой подход может быть использован, чтобы супрессировать иммунную реакцию хозяина на CRISPR-обеспечиваемую генотерапию.67 Разнообразие HLA аллотипов может осложнять создание полностью лишенного иммуногенности Cas9 белка и может требовать allotype-специфичных модификаций для разработки более эффективного лечения.

Легочный сурфактант присутствует в альвеолярной жидкой выстилке и представлен фосфолипидами, холестеролом и SPs, таким как SP-A, B, C, и D. SP-A и SP-D участвуют в защите хозяина, т.к. мыши, дефицитные по этим белкам более чувствительны к бактериальным и вирусным инфекциям. SP-A и SP-D могут снижать эффективность трансдукции не вирусных векторов, вызывая их агрегации и удаление.68-70

Резидентные макрофаги в воздушных путях и альвеолах играют критическую роль в защите хозяина и ремоделировании ткани. Частицы размером в пределах 250-nm до 3-µm фагоцитируются с легкостью; однако, частицы менее 250-nm фагоцитируются менее эффекутивно.49,71 Т.к. большинство вирусных и не вирусных векторов доставки меньше 250-nm, то одиночные частицы не столь легко захватываются макрофагами, но агрегация векторов может облегчать фагоцитоз. Агрегация и поглощение 20-110-nm наночастиц серебра наблюдается в макрофагах, выделенных из жидкости после вымывания бронхоальвеолярных выделений у крыс после аэрозольного распыления наночастиц.72 Opsonization векторов с помощью SP-A и SP-D может увеличивать очистку с помощью макрофагов.49

Векторы могут также пересекать физические барьеры дифференцированного эпителия. Плотные соединения между соседними клетками предупреждают доступ к базо-латеральной поверхности, месту, где находятся многие рецепторы вирусов.49 Чтобы достичь продолжительного генного редактирования крупных воздушных путей, предшественники базальных клеток, скорее всего, д. подвергнуться целенаправленному воздействию. Базальные клетки являются популяцией само-обновляющихся, мультипотентных клеток, ответственных за регенерацию и гомеостаз проводящих путей. Их апикальная цитоплазма не достигает просвета путей, что ограничивает их трансдукцию.73 Кроме того, было установлено, что эндоцитоз с апикальной поверхности дифференцированных клеток происходит с низкой эффективностью,74 это может мешать трансдукции с помощью векторов, использующих эти пути проникновения в клетки.

Связанные с болезнью факторы могут также создавать барьеры трансдукции эпителиальных клеток. При CF, потеря CFTR-зависимой секреции анионов приводит к снижению секреции жидкости и более кислому ASL pH. Это нарушает антимикробное действие ASL и снижает MCC.75,76 Нарушения MCC и снижение защиты хозяина создает обстановку вседозволенности для бактериальных инфекций, что приводит к воспалению, закупорке воздушных путей и преобразованию воздушных путей. CF респираторные секреты содержат повышенные уровни эндогенной ДНК, актиновых филамент и клеточного дебриса благодаря этому воспалительному окружению и это может сделать секрет более вязким.77 Бактериальные биопленки также могут формироваться в CF легких, создавая дополнительный внешний барьер для доступа к эпителиальным клеткам. Повышенные оксидативные стрессы могут увеличивать поперечные связи из дисульфидных мостиков между волокнами муцина, приводя к образованию более мелких пор в муциновом геле и к более эластичной слизи.78,79 Установлено, что CF слизь может препятствовать проникновению как вирусных, так и не вирусных векторов в первичных культурах эпителия воздушных путей человека (HAE).49,80-84

Доставка грузов для добавления генов и компонентов после редактирования генов возможна в следующих форматах: (1) доставка ДНК-экспрессирующих кассет или мРНК, кодирующих необходимые компоненты и (2) доставка белков и ДНК или РНК (в контексте CRISPR/Cas системы: Cas белка, gRNA и донорской ДНК, если необходимо). Вектор часто диктует тип используемого груза.

Несколько систем вирусных векторов используются для ингаляций и приводят к высокой трансдукции разных типов клеток легких.

Adeno-associated virus

AAV были интенсивно использованы для доставки генов в воздушные пути in vivo и их безопасность в клинических испытаниях на людях строгая.73,85-91 AAV трансдукция провоцирует небольшую реакцию врожденного и приобретенного иммунитета после первого воздействия и обнаруживает минимальные признаки цитотоксичности.4 Разные серотипы AAV делают возможной трансдукцию разных типов эпителиальных клеток воздушных путей. Клинические испытания по доставке AAV при CF использовали серотип AAV2 с выдающимся профилем безопасности, но эффективность трансдукции воздушных путей была низкой.55,92-94 Одной из причин ограниченной эффективности доставки оказалась доступность рецепторов. AAV рецепторы (AAVR), кодируемые геном KIAA0319L, необходимы для инфекции AAV серотипами 1, 2, 3b, 5, 6, 8 и 9, а они расположены исключительно в базо-латеральном и околоядерном компартменте клеток HAE.95 Разработан AAV2.5T, с помощью направленной эволюции по апикальной трансдукции первичных культур HAE, это привело к 100-кратному увеличению апикальной трансдукции по сравнению с нативным AAV серотипом 5.96 AAV2.5T использует сиаловую кислоту в качестве фактора прикрепления и это взаимодействие необходимо для интернализации. Интернализация AAV2.5T зависит от AAVR, т.к. антитела к AAVR не мешают трансдукции AAV2.5T.96,97

ДНК перетасовка капсидных субъединиц из разных AAV серотипов может создать рекомбинантные AAV (rAAV) векторы с улучшенной целенаправленной и трансдукционной эффективностью. Эта техника была использована, чтобы отобрать капсиды AAV, которые смогут эффективно трансдуцировать гепатоциты в присутствии объединенной человеческой антисыворотки, это привело к идентификации AAV2/AAV8/AAV9 химеры, наз. AAV-DJ.98 Перетасовка ДНК была использована для идентификации AAV капсид с высоким тропизмом к легочным эндотелиальным клеткам и она может быть использована для открытия новых AAV капсид для др. легочных компартментов, эпителия воздушных путей или альвеолярных клеток.99 Обладая библиотеками пептидов для AAV капсид, можно также использовать комбинации с перетасованными капсидами. 98,100-103 Штриховое кодирование ДНК может быть использовано в библиотеках AAV капсид, чтобы сделать возможным извлечение капсид высоко-производительным способом.100,101

AAV капсида является icosahedron (двадцатигранником), состоящей из капсидных белков VP1, VP2 и VP3 в соотношении ~1:1:18.104,105 Выпячивания, выступающие из поверхности вдоль тройной оси симметрии, обладают 5 из 9 регионами "variable loop" (VRs), которые варьируют по аминокислотному составу между серотипами.104,105 Различия между серотипами могут быть картированы по этой поверхностной топологии.104,105 Композиция VR может влиять на тканевой тропизм и некоторые VRs, такие как VR-VIII из VP3, могут противостоять инсерциям чужеродных последовательностей, чтобы видоизменить тропизм.104,105 Отбор типов клеток или ткане-специфическое целенаправленное воздействие AAV капсид может быть достигнуто при использовании пептидов или специально сконструированных designed ankyrin repeat protein (DARPin) инсерций в AAV капсиду в этих регионах. Deverman et al., используя от Cre рекомбинации зависимый подход для отбора капсид, оказались способны прорваться через гемато-энцефалический барьер.106 Библиотеки капсид с 7-mer инсерциями пептидов были отобраны благодаря использованию астроцит-специфических Cre-экспрессирующих модельных мышей, в результате удалось изолировать варианты капсид с 40-кратным увеличением трансдукции в ЦНС.106 В отдельном исследовании, DARPins, специфические для Her2, CD4 и EpCAM, вводили в последовательности AAV капсид, в результате получали специфические нацеленные на опухоли воздействия у мышиных моделей, CD4-позитивные клетки в селезенке гуманизированных мышей и EpCAM-позитивные клетки во всей крови человека, соотв.107

Слизь воздушных путей д. препятствовать эффективной трансдукции некоторых AAV серотипов. AAV1, AAV2 и AAV5 могут прикрепляться к слизи воздушных путей человека.80,81 Трансдукция AAV6, однако, не снижается эндогенной слизью или избыточной секрецией слизи, тогда как трансдукция AAV1 снижена в первичных культурах HAE или у мышиных моделей. Изменения одиночных аминокислот в AAV6 капсиде, K531E, повышает чувствительность к повреждениям слизи, указывая на гликан-специфические взаимодействия серотипов.108

Хотя AAV векторы могут достигать высокой трансдукционной эффективности в первичном эпителии воздушных путей человека, способность к упаковке ограничена 4.8-kb.109 Это может ограничивать добавление некоторых генов и CRISPR/Cas подходы. кДНК cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) последовательность составляет ~4.5-kb, которая слишком велика, чтобы быть упакована внутри экспрессионной кассеты AAV. Создание CFTR mini-гена с помощью делеции части CFTR регуляторного (R) домена (CFTR-R) и использование минимум 83-bp синтетического промотора дает экспрессионную кассету, которая эффективно умещается в AAV vector.110,111 Для редацтирования генов, размер упаковки AAV слишком мал, чтобы уместить весь CRISPR/Cas груз spCas9. Эта помеха может быть преодолена путем использования меньшего варианта Cas, такого как saCas9 или двойных векторов, один AAV, содержащий генетическую последовательность Cas белка и второй AAV кодирующую gRNA и маркерный ген или HDR матрицу. Подразделенная Cas система, такая как split-intein, может быть также использована, когда N-terminal регион Cas9 кодируется одним AAV, а C-терминальный регион Cas9 кодируется вторым AAV вектором.60,112,113 Эта стратегия также эффективна для доставки редакторов оснований.112,114,115 Двойные AAV векторы были использованы для коррекции функции CFTR у CF модельных свиней. Один AAV нес интегрирующую CFTR экспрессионную кассету, фланкированную piggyBac транспозоном, а др. AAV нес piggyBac transposase, оба вводили в виде аэрозолей в трахею.116 Хотя эффективность трансдукции не была установлена в этом исследовании, доставка была достаточной, чтобы корректировать дефекты анионовых каналов.116 Эффективность трансдукции двух AAV6 векторов, как было установлено, возникает на тех же уровнях, что и при трансдукции одиночным AAV6 вектором в легких мышей, которые приближались к 10% эпителиальных клеток воздушных путей.117 Эти исследования подчеркивают пригодность двойного AAV вектора для эффективного целенаправленного воздействия на воздушные пути.

Хотя AAV векторы очень эффективны при трансдукции разных типов клеток легких, их небольшая способность переноса создает проблемы для доставки донорской ДНК для HDR. Такое использование требует двух векторов. AAV трансдукция может привести к устойчивой экспрессии компонентов CRISPR, поскольку упакованная ДНК может персистировать эписомно в течение всей жизни клетки или при модификации может в редких случаях интегрироваться в геном хозяина.

Др. стратегия преодоления ограничения размера генома - это создание parvovirus химер, в которых rAAV геном упакован внутри капсиды от др. parvovirus с более значительной способностью к упаковке. Первоначальная демонстрация этой техники упаковки rAAV генома в B19 капсиду, приводила к эффективному целенаправленному воздействию на эритроидные клетки.118 Геном rAAV также был упакован в капсиды человеческого bocavirus (HBoV) и bocavirus гориллы (GBoV), чтобы повысить ёмкость упаковки до 1-kb.119-121 такие rAAV/HBoV или GBoV химеры эффективно трансдуцировали первичные культуры эпителиальных клеток из воздушных путей человека, легочные органоиды и легкие хорьков.119-121 Хотя rAAV/HBOV химеры, использующие серотип HBoV1, могли эффективно нейтрализоваться с помощью человеческих IgG, rAAV/HBoV4 и rAAV/GBoV не затрагивались подобными воздействиями, подтверждая потенциал использования таких векторов для доставки в легкие.

Основным ограничением parvovirus cross-genera псевдоупаковки стала продукция высокого титра вектора; однако, достигнут недавно прогресс в понимании репликации вируса HBoV1, это позволило улучшить метод продукции. При прототипической продукции rAAV/HBoV1 вектора, временная трансфекция клеток HEK293 осуществлялась с помощью плазмид, содержащих (1) rAAV2 геном, (2) необходимые adenovirus (Ad) гены помощники (E2, E4Orf6 и VA RNA), (3) AAV2 Rep гены и (4) HBoV1 капсиды (VP1, VP2 и VP3) и nonstructural (NS) гены (NS1, NS2, NS3, NS4 и NP1).121 Типичная продукция составляла 10-20 раз меньше, чем таковая от rAAV2 вектора.121

Позднее было установлено, что NP1 является единственным NS белком, необходимым для экспрессии HBoV1 капсид и что он способен к транскрипции полной длины cap мРНК, которая обычно заканчивается в сайте полиаденилирования (pA) внутри уникального региона VP1.122 Молчащие мутации в HBoV1 cap cDNA позволяют pA сайтам продуцировать rAAV/HBov1 вектор в отсутствии любого из NS белков, увеличивая еще больше урожай продукта.123

Др. метод продукции rAAV2/HBoV1 вектора использует Sf9 клетки насекомых и baculovirus expression vectors (BEVs).124 Клетки Sf9 инфицируются двумя BEVs: один обладает rAAV2 геномом, а др. несет систему экспрессии для AAV2 Rep78 и Rep52, а также HBoV1 капсидные белки VP1, VP2 и VP3.124 Добавление третьего BEV, экспрессирующегоHBoV1 NS белок NP1 усиливает продукцию вектора до уровня продукции rAAV2 клетками Sf9, хотя проксимальная часть pA предупреждает экспрессию HBoV1 cap в отсутствие NP1 в клетках млекопитающих, этого не происходит в клетках насекомых.124 В целом продукция rAAV2/HBoV1 в клетках Sf9 дает в 10- 100-крат больший вектор, чем rAAV2/HBoV1, продуцируемый в клетках HEK293 при использовании метода преходящей трансфекции продукции.124 Хотя биологические характеристики, такие как способность к трансдукции, Sf9-продуцируемый rAAV эквивалентен продуцируемому HEK293 клетками rAAV, а rAAV2/HBoV1 продуцируемый Sf9 клетками обнаруживает 5-7 кратную редукцию трансдукцию культивируемыми HAE клетками по сравнению с rAAV2/HBoV1, продуцируемым HEK293 клетками.124-128 Это снижение трансдукции возможно из-за уменьшения упаковываемого генома, т.к. rAAV/HBoV1, продуцируемый Sf9 клетками обладает высоким уровнем пустых капсид (50-60% полных частиц) по сравнению с вектором, продуцируемым в клетках HEK293 (>95% полных частиц).124 Изменчивость гликозилировании HBoV1 капсидных белков в двух клеточных линиях также может влиять на трансдукцию. Благодаря последующей оптимизации методов продукции rAAV2/HBoV1, использование этого вектора на животных моделях и в клинических испытаниях может стать более приемлемым.

Анализ вариантов HBoV1, выделенных из выборок людей выявил различные горячие точки, которые могут влиять на продуктивность векторов и трансдукцию первичных культур HAE.129 Один капсидный вариант (T590S) увеличивает продукцию вектора AAV2/HBoV1, не затрагивая эффективности трансдукции.129 Этот аминокислотный вариант локализуется в HI петле VP3, гипервариабельный участок, который сцеплен со сборкой частиц и упаковкой генома в AAV.130 Др. выделенный вариант (Y523F) увеличивает трансдукцию первичных культур HAE.129 Эти капсидные варианты подчеркивают многообещающее использование модификаций капсид HBoV1 в будущем для усиления rAAV2/HBoV1 векторов для клинического использования.

LVs широко используются и некоторые одобрены FDA для клинических испытаний по лечению болезней, таких как SCID, chronic granulomatous disease, adrenoleukodystrophy и beta-thalassemia. Терапия с помощью LV этих болезней в основном использует ex vivo терапию гематопоэтических стволовых клеток, которые возвращаются обратно пациенту. Даже при успехе ex vivo LV терапии, доставка в легкие остается проблематичной из-за рассмотренных выше препятствий.

LVs шроко используются в подходах с добавлением генов, чтобы интегрировать экспрессионные кассеты в геном хозяина. Они могут быть также использованы для упаковки последовательностей, кодирующих Cas белки, gRNAs, и др. компоненты аппарата в один вектор. Множественные gRNAs могут быть закодированы в одиночный лентивирусный вектор, каждая из которых под специфическим промотором для своего собственного тпа клеток, чтобы редактировать множественные гены во многих типах клеток при одной трансдукции.131 LVs могут быть псевдотипированы с помощью разнообразных вирусных оболочек, чтобы менять их тропизм. Они являются широко распространенными псевотипированными с помощью оболочки vesicular stomatitis virus (VSV), VSV-G, который эффективно трансдуцируется в базо-латеральные поверхности эпителия воздушных путей, но обнаруживает низкий уровень апикальной трансдукции из-за низкой доступности рецепторов.132-135 Чтобы усилить трансдукцию VSV-G псевдотипированных LV in vitro или in vivo необходимо временное разрушение плотных соединений с помощью chelators кальция,136 индуцированных повреждений,137 или воздействия умеренными детергентами,138 такими как lysophosphatidylcholine (LPC). Предприняты многочисленные поиски от разных псевдотипов оболочек для эффективной апикальной трансдукции и продукции вирусов, используя оболочки Autographica californica, оказались пригодными множественные nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) GP64.139-144 GP64-псевдотипированные LVs могут эффективно трансдуцировать носовые проходы и воздушные пути мышей и свиней.132,141 Псевдотипированный SIV-based LV с помощью модифицированной из Sendai virus (SeV) оболочки hemagglutinin-neuraminidase (HN) и слияния (F) белков вызывает мощную апикальную трансдукцию.145,146 F/HN-SIV трансдуцирует носовой эпителий мышей с эффективностью 4.5% и апикальной трансдукцией полностью дифференцированных первичных культур HAE, чтобы генерировать функциональное CFTR проведение трансмембранных хлоридов.145

Из-за интеграции и постоянной экспрессии является благоприятным для добавления некоторых генов и для CRISPRa или CRISPRi подходов, в случаях редактирования генов это может оказаться нежелательным. Идентифицированы Anti-CRISPR proteins (Acrs), естественные bona fide CRISPR-Cas антагонисты, они подавляют активность Cas путем предупреждения соединения , разрезания ДНК, загрузки crRNA или формирования комплексов.147-149 Acrs могут эффективно подавлять активность Cas9, будучи доставлены ex vivo в гематопоэтические стволовые клетки они понижают ассоциированную с Cas клеточную токсичность и улучшают приживление у мышиных моделей.150 Доставленные AcrIIC3 может ингибировать редактирование Nme2Cas9 у мышей, приводя в результате к подавлению редактирования в сердце и печени.151 Интеграция дефектных LVs с мутациями в integrase может позволить их использование, но этот вопрос не был тщательно изучен, чтобы сделать вывод, действительно ли интеграция является 100% несовершенной или только повреждена.152 Небольшие молекулы ингибиторов, doxycycline-зависимая инактивация, укороченные gRNAs и синтетические олигонуклеотиды, замалчивающие активность Cas9 153-157, были разработаны, чтобы ограничивать персистенцию Cas9.

Аденовирусные векторы (Ad) активно использовали для трансдукции разного типа клеток. Ad-CFTR векторы серотипа 2 и 5 трансдуцируют первичные HAE и успешно трансдуцируют носовой turbinate эпителий in vivo, хотя и временно.4 Серотипы Ad-2 и Ad-5 используют coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) в качестве первичных рецепторов, которые располагаются на базо-латеральной поверхности эпителия дыхательных путей человека.158 Химерный вектор Ad-5, несущий гетерологичные волокнистые молекулы из серотипа 35 (Ad5F35) может трансдуцировать апикальную поверхность эпителия воздушных путей человека и корректировать проведение анионов в клетках, несущих мутацию CFTR F508del .159 Существует опасность в отношении клинического использования Ad векторов, поскольку некоторые клинические испытания при CF обнаруживали воспалительную реакцию. Исследования на не человекообразных приматах также сообщали о воспалении альвеол при использовании высоких доз Ad вектора.160,161 Высокие дозы вводимые системно Ad могут вызывать тяжелые иммунные ответы, как при испытаниях 1999 года при дефиците ornithine transcarbamylase (OTC), когда применение 1013 вирусных частиц, вводимых в бедренную артерию приводили к гибели пациентов.162,163 Поэтому Ad векторы в основном используются при исследованиях или модифицируются, чтобы снизить вредные иммунные реакции. Исследования реакций врожденного иммунитета в отношении Ad могут привести к модификациям, улучшающие из пригодность.164,165

Из-за относительного высокого преобладания серотипа Ad-5 в генеральной популяции, использованы альтернативные Ad векторы. Выделенные Gorilla adenovirus (GAd) могут быть изменены в дефектные по репликации векторы, которые продуцируют высокие титры. GAd векторы использованы для вакцин против респираторных синцитиальных вирусов и Zika вирусов в преклинических исследованиях, чтобы получать высокого уровня антиген-специфические антитела.166,167 GAd типа 9, isolate 46 обнаружили высокий тропизм к эндотелиальным клеткам легких у мышиных моделей.168 Подобно Ad-5, этот GAd вектор может быть модифицирован в fiber knob, чтобы изменить тканевое целенаправленное действие .168 GAd векторы обнаруживают ни pre. распространенность серотипа и могут подвергаться преобразованию капсид.

Helper-dependent adenovirus (Hd-Ad) являются привлекательными для доставки крупных грузов и для CRISPR/Cas стратегий, которые нуждаются в использовании HDR доноров. Hd-Ad обладают способностью к упакове большого груза по сравнению с AAV, обладая способностью кодировать ~36-kb.169 Такая способность паковать большие грузы может быть приспособлена к упаковке Cas белка, gRNA и донорской ДНК в одном векторе. В Hd-Ad, все вирусные кодирующие последовательности были делетированы, чтобы минимизировать продукцию вирусного белка и продуцировать неспособный к репликции вектор.169 Hd-Ad векторы менее иммуногенны, чем аденовирусные векторы. Широкое разнообразие серотипов может быть использовано, но серотип 5 эффективно трансдуцирует базальные клетки воздушных путей in vivo у модельных мышей и свиней, а также базальные клетки in vitro в первичных культурах HAE.4,170,171 Хотя сообщалось, что Hd-Ad ДНК может персистировать в виде эписомных ДНК, в одном исследовании сообщалось о временной экспрессии Cas9 дольше донорской ДНК, при этом обнаруживалась полная потеря экспрессии Cas9 спустя 7 дней.172 Хотя этот феномен может быть результатом разбавления Hd-Ad ДНК при серийных пассажах, считается, что векторная ДНК деградирует после интеграции донорской ДНК как результат неустойчивости векторной ДНК. Hd-Ad векторы могут составить альтернативу временно трансдуцируемым клеткам для CRISPR/Cas-обеспечиваемой генотерапии.

Невирусные векторы используются менее широко для доставки в легкие из-за низкой трансдукции и воспалительной реакции. Невирусные векторы продолжают использоваться для доставки из-за потенциальных преимуществ: (1) нет ограничений к упаковке величины груза, (2) многие невирусные векторы способны к биологической деградации и биосовместимы, обнаруживают меньшую цитотоксичность и побочные иммунные реакции, (3) повышение продукции довольно прямолинейно и экономично и (4) временная экспрессия груза может снизить эффекты вне мишени, вызываемые устойчивой экспрессией Cas белков, интеграцией в геном хозяина и генотоксичностью.

Возрождается интерес к невирусной доставке в легкие. Векторы в основном имеют три конфигурации: (1) базирующиеся на пептидах, (2) базирующиеся на липидах и (3) базирующиеся на полимерах. Др. редакции систем невирусной доставки, такие как доставка экзосом, также используются. Отсылаем к соотв. работам.173,174

CF является аутосомно рецессивным заболеванием, возникающим в результате мутаций в гене CFTR.175 CFTR кодирует анионовый канал, который проводит хлориды и бикарбонаты через эпителиальные клетки в поджелудочной железе, печени, кишечнике, желчном пузыре, потовых железах, воздушных путях и детородных каналах.176 Мутации, нарушающие функцию CFTR меняют объем и состав ASL, нарушают защиту хозяина и снижают mucociliary транспорт, приводя к бактериальным инфекциям, ремоделированию воздушных путей и снижению функции легких.175,176 CF затрагивает более 70000 индивидов во всем мире и является наиболее угрожающим жизни наследственным заболеванием среди белых.

Кстати, идентифицировано более 2000 вариантов гена CFTR, при этом, по крайней мере, известно 346, вызывающих болезнь.176 Мутации классифицируются в соответствии с их влиянием на транскрипцию и трансляцию CFTR: мутации Class I являются нонсенс или мутациями сдвига рамки считывания, которые приводят к укороченным или нестабильным мРНК, которые мешают продукции любого функционального белка. Мутации Class II включают наиболее распространенный аллель F508del, вызывающий неправильную упаковку белка или снижение трафика через плазматические мембраны. Мутации Class III характеризуются дисфункцией пропускной способности канала. Мутации Class IV продуцируют CFTR белок с пониженной проводимостью. Мутации Class V располагаются внутри интронов и вызывают нарушения сплайсинга мРНК. Наконец, мутации class VI продуцируют функциональный, но относительно нестабильный CFTR белок на клеточной поверхности.

С 2011, открыто несколько низкомолекулярных CFTR корректоров, которые способствуют укладке белков, и усилителей, которые действуют, чтобы удерживать CFTR каналы открытыми, одобренных FDA для терапии CF.177-180 Кстати, три корректора (lumacaftor, tezacaftor и elexacaftor) были разрешены для лечения мутаций клесса II. Tezacaftor и elexacaftor могут быть использованы в комбинации, т.к. каждая малая молекула целенаправленно воздействует на свой собственный специфический сайт, чтобы синергично усиливать укладку и функцию белка.180 Ivacaftor, в настоящее время единственный одобренный FDA усилитель, целенаправленно воздействует на мутации класса III, такие как G551D, чтобы повысить проводимость канала и , как было установлено, является эффективным для некоторых мутаций из класса IV и V.180 Терапия тремя компонентами tezacaftor, elexacaftor и ivacaftor, наз. Trikafta сегодня разрешена для индивидов 12 лет и старше.181 Это воздействие может оказаться полезным у ~90% от всех индивидов с CF в этих возрастных рамках, существенно продвинув лечение CF.180,181

Терапия малыми молекулами обнаруживает достоверные преимущества, но следует учитывать продолжительность жизни индивидов. Определенные побочные эффекты, такие как аномальная функция печени, могут делать эти терапевтические возможности непригодными у некоторых пациентов.180 Наконец, терапия малыми молекулами обнаруживает небольшие или не обнаруживает эффектов у ~10% индивидов с более редкими мутациями. Стратегии генотерапии обладают потенциалом преодолевать эти препятствия и предоставлять мутациям агностическое лечение. Предыдущие исследования подтвердили, что достижение 6-50% функции от дикого типа CFTR может восстанавливать транспорт хлоридов в эпителии воздушных путей и может обеспечивать достоверный клинический успех.182-187

Первые исследования по генотерапии CF использовали инсерции дополнительной копии гена CFTR, или интегрированной в геном хозяина или в виде эписом. Предложено несколько вирусных и не вирусных стратегий доставки, все они с разной степенью сохранения эффекта. Ретровирусы и LVs были использованы для доставки и интеграции CFTR экспрессионных кассет, приводя к восстановлению функции CFTR в HAE,у модельных мышей, свиней и хорьков.4,188-191 AAV векторы, которые сохраняются эписомно, оказались эффективным средством доставки и восстановления CFTR функции in vitro и in vivo у модельных мышей, кроликов и макак.192-194 Однако, предыдущие клинические испытания с использованием AAV2 векторов ге достигли клинической значимости.4,55,90,92-94,195 Неэффективность переноса гена обусловлена плохой трансдукцией воздушных путей с помощью AAV2 серотипа, недостаточность экспрессии CFTR благодаря использованию ITR промотора в конструкции вектора, а генерация вызываемой терапией иммунной реакции хозяина может вносить вклад в неутешительность результатов этих клинических испытаний. Умеренная стабилизация легочных болезней, наблюдалась при недавней невирусной доставке phase 2b клинического испытания, в котором CFTR cDNA (pGM169) соединялась в комплексы с с липосомным комплексом GL67A была применена благодаря распылению лекарственного средства.196 Хотя улучшения функции легких были умеренными в группе, леченной pGM169/GL67A, исследователи пришли к выводу, что повторное использование этой не вирусной терапии является безопасным и может менять клинически важные параметры функции легких, такие как FEV1.196

Липосомы активно изучались в отношении доставки лекарств, витаминов и нуклеиновых кислот. "Золотым стандартом" доставки в легкие стала катионовая липосома GL67A. GL67A введенная в комплекс с плазмидной ДНК (pDNA), несущий CFTR экспрессионную кассету обнаружила обнадеживающие результаты по доставке в легкие мышей, овец и людей. Первое клиническое испытание с использованием GL67A в качестве вектора доставки выявило ~25% коррекцию ионного дефекта CF, хотя эти результаты наблюдались только 2 недели. Кроме того, воздействие вызывало умеренные "flu-like" симптомы, обусловленные, скорее всего, распознаванием Toll-like receptor-9 (TLR-9) содержимого CpG в pDNA. Использование третьего поколения, CpG-свободных плазмид выявило эффективную доставку в легкие мышей и снижение воспалительной реакции до уровня почти неотличимого от контрольного. Во второй, фазе 2b клинического испытания, повторное применение GL67A/pDNA комплексов приводило к стабилизации функции легких.

Hd-Ad системы эффективно целенаправленно воздействуют на эпителий воздушных путей и воздушные пути некоторых животных моделей, обозначая потенциальную стратегию для будущих клинических испытаний.4,170,197,198 Базирующиеся на Transposase методы, такие как система piggyBac, которая также может доставляться посредством Ad или AAV векторов, вызывает устойчивую экспрессию CFTR у мышей и фенотипическую коррекцию у CF модельных свиней.4,116,199

rAAV/HBoV1 химеры, в которых rAAV геном содержит полной длины CFTR cDNA, кодирующую последовательность, управляемую с помощью CMV-β-actin промотора, упакована в HBoV1 капсиду и эффективно трансдуцирует первичные эпителиальные культуры поляризованных воздушных путей человека с апикальной поверхности и частично откорректированный CFTR-обеспечиваемый транспорт хлоридов.121 Такие химеры могут предоставить альтернативную систему векторной доставки, если отсутствует барьер из блокирующих антител. AAV/HBoV1 векторы могут также эффективно трансдуцировать легкие хорьков, предлагая животную модель, в которой этот CFTR-несущий вектор может быть протестирован в отношении фенотипической коррекции.120

CRISPR/Cas9-обеспечиваемое добавление гена было использовано для внесения CFTR экспрессионной кассеты в безопасные локусы в линиях клеток человека и свиней.172,200 В этих исследованиях, "все в одном" HD-Ad векторы, несущие экспрессионные кассеты для Cas9, gRNA, нацеленные или на AAVS1 или GGTA1 safe harbor локусы человека и свиней, соотв. и CFTR донорскую ДНК с соотв. гомологией плеч, успешно интегрированную и экспрессирующую CFTR сайт-специфическим способом.171,172,200 Трансдуцированные свиные IPEC-J2 клетки обнаруживают интеграционную эффективность в 10%.200 Хотя эффективность не подсчитана, трансдуцированные IB3-1/CF клетки продуцировали измеримые количества проведения CFTR хлоридов при временной экспрессии Cas9, наиболее вероятно благодаря нестабильности векторной ДНК после HDR донорской ДНК.201 Эта стратегия CRISPR/Cas добавления гена предоставляет высокие уровни интеграции в линиях клеток без сохранения экспрессии Cas9 белка. Необходимы дальнейшие исследования на первичных HAE клетках и in vivo моделях, чтобы определить пригодность этого подхода у людей.

Купирование экспрессии CFTR с др. геном, подход "GeneRide", является ещё одной стратегией с терапевтическим потенциалом. Этот подход использует инсерцию лишенного промотора терапевтического гена в кДНК in-frame выше стоп-кодона эндогенного гена, отделяя эндогенный ген от терапевтического гена с помощью 2A сайта рибосомального пропуска.202 Это приводит к продукции мРНК, содержащей как эндогенную, так и терапевтическую мРНК, но два отдельных белка. Эта техника делает возможной инсерцию human coagulation factor IX (hF9) в локус альбумина, экспрессирующийся гепатоцитами, это ослабляло фенотипические проявления hemophilia B у модельных мышей.202 Тот же самый локус albumin используется также для инсерции лишеного промотора человеческой uridine glucuronosyl transferase A1 (UGT1A1) кДНК, устраняя фенотип мертво-рожденности у мышей, моделирующих Crigler-Najjar syndrome type I (CNSI), хотя это не нормализовало уровни билирубина в плазме.203 Комбинирование GeneRide с CRISPR/Cas9-обеспечиваемым добавлением гена посредством двух соотв. AAV векторов: один несущий кДНК из saCas9 и gRNA, нацеленную на локус albumin, и второй вектор, несущий UGT1A1 cDNA, фланкированную с помощью регионов, гомологичных albumin, приводя к 26-кратному увеличению эффективности целенаправленного воздействия, устранения у CNSI модельных мышей фенотипа мертво-рожденности и продукции уровней биллирубина, сравнимых с диким типом.204 Подход GeneRide обнаруживает потенциал подходящий для клинического использования при разных генетических нарушениях. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить терапевтическое значение этого подхода для лечения легочных болезней.

Cell penetrating peptides (CPPs), длиной в 5-30 аминокислот, которые являются катионовыми, amphipathic или не полярными и могут транслоцироваться через плазматические мембраны и облегчать клеточное потребление.205 Существует множество CPPs, которые могут транспортировать разные грузы в разные типы клеток. Комбинации многих CPPs может также быть использовано, чтобы усилить эффективность доставки.205 В контексте доставки CRISPR/Cas грузаy, CPPs могут быть связаны с RNPs, состоящими из Cas белка и gRNAs, чтобы обеспечить проникновение в клетки.205 Эффективность доставки может широко варьировать в зависимости от типа груза и типа клеток мишеней, и необходима значительная оптимизация CPPs. CPPs также стремятся оказаться в эндосомных компартментах после интернализации.206,207 Добавление endosomal leakage domain (ELD) может быть использовано для дестабилизации эндосомных мембран, что позволит проникать в цитозоль Cas RNPs.208,209 CPP-ELDs, несущие Cas9 RNPs или Cas12a RNPs, как было установлено, эффективно трансдуцируют первичные культуры HAE, а также крупные и мелкие воздушные пути мышей.17 Такие CPPs предлагают многообещающие системы доставки для базирующегося на белках редактирования генов для лечения CF. Недавние доказательства подтвердили, что этот Cas белок может эффективно целенаправлено воздействовать на первичны эпителий воздушных путей у людей и в легких мышей in vivo.17

Zinc finger nucleases (ZFN) являются искусственно преобразованными нуклеазами, которые облагчают редактирование генома, путем соединения с последовательностью ДНК мишени посредством ДНК-связывающего домена и внесения DSB посредством ДНК-разрезающего домена. Bednarski et al. использовали ZFNs целенаправленное воздействие на 5' конец экзона 11 гена CFTR и внесение донорской конструкции, состоящей из экзонов 11-27 CFTR, чтобы корректировать F508del мутацию в CFBE41o в клеточной линии, восстанавливая экспрессию CFTR мРНК и проведение хлоридов.210 Хотя этот подход пока тестируется in vivo, создание super-exon может позволить коррекцию всех мутаций CFTR, расположенных ниже экзона 11.

С помощью технологии CRISPR/Cas, коррекция болезнь-вызывающих мутаций также опробована. Исследования, базирующиеся на HDR с донорской CFTR ДНК, корректировали F508del в человеческих induced pluripotent stem cells (hiPSCs), кишечных органоидах и upper airway basal stem cell (UABC) органоидах.171,211-213 Активность вне мишени, как и предсказывалось была относительно низкой, возникала в 0-4% из секвенированных аллелей.211-213 Эффективность коррекции была относительно низкой , для этого использовали отбор позитивных клеток или колоний благодаря экспрессии маркера резистентности. При редактировании генов CFPAC-1 в гомозиготных F508del линиях клеток человека использовали вирусный вектор, отбор лекарств и репортерский подход enrichment-free (VDR-free) в результате оказались откорректированными 1% аллелей.214 Исследование мышей in vivo продемонстрировало 0.1% HDR-обеспечиваемого CRISPR-Cas редактирования генов в легких мышей,215 значительно ниже порога фенотипического восстановления CFTR, а также возникновение indel более 1%.215

Альтернативной стратегией является трансплантация откорректированных по гену клеток. Гены откорректированные с помощью UABCs могут быть внедрены в pSIS мембрану, FDA-разрешенные свиные мембраны используются для репарации назальных синусов.211 Эта технология может быть использована, чтобы имплантировать откорректированные по гену базальные стволовые клетки в верхних частях воздушных путей, областях, которые становятся резервуаром для бактерий, резистентных к антибиотикам.211 Генотерапия ex vivo, базирующаяся на клетках является др. подходом для лечения легочных болезней. Независимо от подхода, CRISPR/Cas-базирующаяся на HDR коррекция мутаций гена CFTR нуждается в дальнейшем улучшении, чтобы преодолеть существующую низкую эффективность коррекции и относительно высокую частоту indel.

Некоторые мутации приводят к созданию альтернативных сайтов сплайсинга внутри интронов CFTR, приводя к созданию псевдоэкзона или дополнительной последовательности к существующим экзонам.216 Эти мутации ответственны перед CRISPR/Cas-вызываемыми NHEJ, устраняются эксцизией или разрушением болезнь-вызывающей мутации внутри интрона. Такой подход приложим к линии клеток 293T, которые содержат или c.1679 + 1634A>G, c.3140-26A>G, или C3718-2477C>T CFTR мутации.217 Мутации c.1679 + 1634A>G и c.3140-26A>G создают акцепторный сайт для сплайсинга и разрушают 99% и 95% транскриптов CFTR, соотв.218,219 CRISPR/Cas9-обоеспечиваемое NHEJ, с использованием двух gRNAs, которые целенаправлено воздействуют на интронные последовательности, фланкирующие мутацию, приводят к более чем 56% эффективности эксцизии и вплоть до 90% восстановления сплайсинга.217 Третья мутация, c.3718-2477C>T, создающая донорский сайт для сплайсинга,220 также была тестирована с использованием этого подхода, давала эффективность эксцизии в 55% и снижение аберрантного сплайсинга до 17%.193 Такая степень редактирования в 10 раз выше, чем HDR-обеспечивающий подход в том же самом типе клеток и в локусе CFTR.221 Такая NHEJ стратегия эффективна для редактирования интронных CFTR сплайсинг мутаций, но не пригодна для мутаций, затрагивающих канонические сплайс-сайты, т.к. это, скорее всего, должно быть результатом делеции части белковой кодирующей последовательности. Подход по NHEJ репарации станет жизнеспособной терапией для индивидов с мутациями, которые сегодня не поддаются терапии малыми молекулами.

Редактирование оснований обладает потенциалом целенаправлено воздействовать на многие CF-вызывающие мутации, благодаря использованию альтернативных Cas белков с разными PAM последовательностями без необходимости в донорской ДНК. Из мутациё, перечисленных в базе данных CFTR2, 11.7% теоретически может быть подвергнуться целенаправленному действию CBEs и 31.8% действию ABEs.222 В модели кишечного органоида Geurts et al. достигли 8.88% эффективности редактирования редаой мутации R553X посредством редактирования основания аденина, используя канонический Cas9, слитый в ABE (cas9-ABE) и эффективности редактирования в 1.43%, когда целенаправлено воздействовали на мутации W1282X и R553X с помощью неканонического Cas9 редактора оснований (xCas9-ABE).222 В этом исследовании кишечные органоиды были диссоциированы на одиночные клетки и электропортированы с помощью плазмид, кодирующих Cas9-ABE и gRNA. Если использовали повторно органоиды, происходящие из назальных смывов, то редактирование мишеней R553X достигало сходной эффективности 8%,222 подчеркивая многообещающее будущее редактированию оснований в лечении CF легочной болезни.

Triplex-формирующие пептидные нуклеиновые кислоты (PNAs) являются синтетическими нуклеотидными аналогами, которые могут вызывать репарацию ДНК посредством формирования сиквенс-специфических triplex на геномных сайтах мишенях.223 Вместе с короткой донорской ДНК PNAs были использованы, чтобы редактировать человеческие β-globin и CCR5 гены.224-227 Triplex-образующие PNAs и донорская ДНК, которая нацелена на F508del CFTR мутации, доставляемые с использованием полимерных наночастиц, достигали частот модификаций, приближающихся к 10% в человеческих CFBE выборках и к 5% в носовом эпителии с незначительными эффектами вне мишени (<0.0001%).228

Класса V и др. CF-вызывающие мутации вызывали недостаточную экспрессию CFTR на плазматической мембране. Повышенная продукция может восстанавливать проводимость хлоридов и бикарбонатов до почти нормального уровня. Целенаправленное воздействие dCas9 активатора (dCas9-VPR), в котором dCas9 слит с состоящим из трех частей активатором VP64-p65-Rta, с gRNAs, которые соединяются с вышестоящим CFTR промотором, активируются и увеличивают экспрессию дикого типа или F508del CFTR в культивируем носовом эпителии людей.229 Др. эпигенетический подход для усиления экспрессии CFTR заключается в ингибировании BGas, соединяющихся с CFTR. BGas - это длинная не кодирующая РНК (lncRNA), расположенная в анти-смысловой ориентации интроне 11 из CFTR. BGas функционируют сочетанно с несколькими белками, включая HMGA1, HMGB1 и WIBG, чтобы изменить структуру хроматина и подавить RNAP-II транскрипцию CFTR.230 Подавление BGas увеличивает экспрессию CFTR и активность хлорных каналов .230 Создание Gapmer, анти-смыслового олигонуклеотида с phosphorthioate мостиками на 5' и 3' концах, которые нацелены на BGas экзон 1 (экзон, который связывает и супрессирует транскрипцию CFTR ) увеличивает экспрессию CFTR в 6 раз, по сравнению с контрольным scrambled gapmer.229 Оба подхода далее усиливали презентацию CFTR на клеточной поверхности с добавлением малых молекул потенциаторов и корректоров.229 Действительно ли это задокументированное увеличение экспрессии CFTR будет приводить к терапевтическому успеху предстоит выяснить. Помимо вмешательств, использующих эту стратегию, не получено излечения, но улучшило жизнь Несмотря на эти проблемы эпигенетическая модуляция CFTR может предоставить пригодную терапевтическую стратегию в будущем.

Подобно активации генов, нацеленное на РНК редактирование может быть использовано для осуществления нестационарного лечения CF легочной болезни. Adenosine deaminases, которые действуют на РНК (ADARs)

ферментами, которые катализируют сайт-направленный мутагенез РНК путем превращения аденина в инозин, который считывается, как guanosine во время трансляции.231 Эта технология используется для создания модифицированных ADAR, наз λN-DD, в которых присутствует lambda phage N protein boxB, который соединяется с РНК, слит с adenosine deaminase регионом ADAR.231 Это дает ADAR, которая использует анти-смысловую РНК в качестве гида для соединения с CFTR мРНК . λN-DD, как было установлено, корректирует W496X CFTR мутации in vitro с почти 100% эффективностью, а внутри ооцитов Xenopus восстанавливает функциональные CFTR токи.231

Легочный сурфактант является смесью фосфолипидов и SPs B и C, которые функционируют, чтобы снизить поверхностное натяжение на границе между воздухом и жидкостью в альвеолах.232 SPs высоко экспрессируются в альвеолярных типа 2 (AT2) клктках.49 Мутации в генах SFTPB, SFTPC, которые кодируют SP-B и SP-C, и в ATP-binding member 3 (ABCA3), который участвует в метаболизме сурфактанта, вызывают дефицит SP.233 Дефицит SP может вызывать фенотип потери функции (SFTPB или ABCA3 мутации), благодаря аберрантному метаболизму сурфактанта или функции SP, или фенотипу избыточности функции (SFTPC мутации), поскольку накапливается в цитозоле аномальный SP в AT2 клетках и нарушается развитие легких.233 Дефицит SP часто присутствует при рождении с тяжелой дыхательной недостаточностью.233 Терапевтические вмешательства в основном поддерживающие или сострадательные, поскольку доступность доноров детских легких для трансплантаций ограничена.

Все известные мутации SFTPB аутосомно-рецессивные, наиболее распространенные мутации вызывают сдвиг рамки считывания в кодоне 121 (pPro133GInsTer95).233 Первоначальные исследования касались добавления гена с использованием для доставки AdV человеческого SFTPB в мышиные MLE12 клетки. Мышиные клетки сохраняли свойства AT2 клеток, но имели очень низкие уровни SP-B и обнаруживали повышенную экспрессию SP-B после переноса Ad гена.234 Доставка с помощью того же самого вектора AdV cotton крысам приводила к пику человеческого SP-B спустя 48-96 ч после применения, это затем снижалось до невыявляемых уровней.234 Применение SP-B экспрессионных плазмид с помощью электропортации в SP-B-дефицитных модельных мышей, при этом экспрессия контролировалась с помощью doxycycline индуцибельного промотора, то это приводило к 8-кратному увеличению экспрессии SP-B по сравнению с воздействием контрольных плазмид.235 Воздействие SP-B плазмид также приводило к умеренному в 2.5- 5-кратному увеличению жизнеспособности.235 Легочные органоидные модели, наз. alveolospheres, полученные из hiPSCs, содержали клетки с канонической функцией AT2 и были использованы для изучения эффективности редактирования гена SFTPB.236 Лентивирусами доставляемые дикого типа (SFTPB) в альвеолосферы, происходящие из SFTPB(pPro133GInsTer95) hiPSCs, приводили к успешной транскрипции и трансляции дикого типа SP-B, а также к секреции сурфактантных биоактивных липидов.237 Электропортация CRISPR/cas9 в той же самой модели дала сходные результаты, включая повышенную мРНК SFTPB, экспрессию зрелого SP-B белка и генерацию ламеллярных телец.236 Исследование также показало эффективное редактирование гена SFTPB у модельных мышей. Использование мышей с экспрессией SP-B под контролем doxycycline-индуцибельного промотора, с nuclease-encoding chemically modified (nec) доставкой мРНК и донорской ДНК, доставляемой посредством AAV вектора было использовано для инсерции CAG промотора выше точки стартового кодона SP-B посредством HDR, привело в результате к более продолжительному выживанию мышей.201 Эти исследования предоставили информацию об эффективности стратегии редактирования генов при дефиците SP-B.

Наиболее распространенная мутация SFTPC это I73T missense мутация.238 Возраст начала и тяжесть болезни зависят от специфических SFTPC мутаций и варьируют в зависимости от тяжести респираторной недостаточности при рождении до идиопатического легочного фиброза у взрослых.233 Подходы с нокаутом могут быть достаточны для лечения этого типа недостаточности SP, т.к. нулевые SFTPC мыши обнаруживают нормальный рост и функцию легки, тогда как SFTPC(I73T) мыши обнаруживают арест морфогенеза легких на ст. образования поздних альвеол и не жизнеспособны.239 В недавнем исследовании с использованием CRISPR/Cas9-вызываемого нокаута SFTPC(I73T) у плодов мыши, продемонстрировали потенциал терапевтического применения такого подхода. Ветор Ad vector, с закодированными spCas9, EGFP и gRNA доставлялся к SFTPC(I73T) у плодов мышей посредством инъекций в амниотическую жидкость, приводя к 64% снижению AT2 клеток, которые экспрессируют HA-SFTPC(I73T) и к 22.8% увеличению жизнеспособностиl.238 Редактирование легких плодов посредством CRISPR/Cas9 обладает потенциалом ослаблять избыточность функции дефицита SP.238

Alpha-1 antitrypsin (AAT) дефицит (AATD) затрагивает 4% в США и является одним из распространенных генетических нарушений у индивидов в Сев. Европе.240 Мутации названы по их фенотипу protease inhibitor (Pi). Наиболее распространенная мутация AAT это E342K, приводит к продукции PiZ формы AAT, и обозначается Z-AAT.240 90% AATD пациентов являются гомозиготными по PiZ аллелю. PiZ склонен к полимеризации в грубом эндоплазматическом ретикулуме, что нарушает его секрецию.240 PiZ приводит к двум болезненным фенотипам: (1) фенотипу избыточности функции, вызываемому агрегацией PiZ в гепатоцитах, что может приводить к фиброзу, циррозу печени и гепатоцеллюлярной карциноме и (2) фенотипу потери функции, это снижает секретируемые, функциональные AAT, приводя к болезни легких.240 PiZ приводят к увеличению протеазой вызываемого переваривания соединительной ткани нижних частей воздушных путей и альвеол, приводя к эмфиземе и хроническим обструктивным легочным нарушениям.240 Около 5-10% AATD пациентов обнаруживают болезнь печени, у большинства взрослых развивается легочная болезнь.240 Современные возможности лечения ограничены при AATD. Пациенты, у которых развивается печеночная болезнь, могут нуждаться в печеночных трансплантациях. Пациенты в общем получают еженедельно вливания очищенного белка AAT от здоровых доноров.

AAT является serine protease ингибитором (Serpin), кодируемым геном SERPINA1.240 AAT является очень распространенным белком, прежде всего продуцируемым гепатоцитами и секретируемым в сыворотку, но небольшие количества продуцируются также локально клетками бронхиального эпителия и моноцитами.240 Базовые уровни в сыворотке человека AAT колеблются в пределах от 1500 до 3500 µg/mL (20-48 µM).241 Уровень AAT в 11 µM в сыворотке или 1.2 µM в альвеолярной жидкости эпителиальной выстилки (ELF) рассматривается как защитный, исходя из клинических наблюдений за AATD пациентами.242 Одной из важных функций AAT является инактивация нетрофильной elastase, изобилующей протеазы, высвобождаемой из нейтрофильных гранул в ответ на разные инфекции или воспалительные стимулы.240

Стратегии добавления гена для генотерапии AATD связаны с доставкой M-AAT кодируемой последовательности, экспрессируемой с конституитивного промотора. Ранние исследования по добавлению генов использовали ретровирусные векторы на мышиных и собачьих моделях AATD, но эти исследования не привели к экспрессии M-AAT на терапевтическом уровне.75 Преклинические исследования с использованием AAV векторов серотипов AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 и AAVrh.10 При этом AAV1, AAV2 и AAVrh.10 серотипы были использованы для клинических исследований.75,243 Векторы AAV1 и AAV2 вводили посредством внутримышечных инъекций и приводили к экспрессии M-AAT ниже терапевтического порога. Эти испытания не удались, скорее всего, из-за используемого метода и возникающих в результате целенаправленного воздействия клеток. Хотя теоретически любой тип клеток может быть модифицирован, чтобы экспрессировать M-AAT, т.к. в конечном итоге она секретируется в сыворотку, то используемый метод может сильно влиять на эффективность терапии. Используя мышиную модель, внутрибрюшинные инъекции AAV5 вектора приводили к более высоким уровням человеческих M-AAT, чем внутримышечные введения той же дозы.75,244 Это, скорее всего, из-за распределения вектора после введения, что позволяет осуществлять трансдукцию как мезенхимных клеток, выстилающих плевру, так и системную доставку посредством тока вектора по лимфатическим сосудам и системно кровообращение и затем в гепатоциты. Это может быть достигнуто как за счет локальной экспрессии M-AAT мезенхимными клетками, которые диффундируют в паренхиму легких, так и системной экспрессии гепатоцитами M-AAT, которые секретируются в сыворотку. Фаза I/II клинического испытания использования внутриплеврального введения вектора AAVrh.10, кодирующего M-AAT недавно завершена.245 Результат этого испытания пока не опубликован, но данные по мышиной модели указывают на то, что экспрессия M-AAT может быть более высокой, чем в предыдущих испытаниях.

Несколько in vivo исследований с использованием PiZ модельных мышей продемонстрировали терапевтическую пригодность базирующейся на CRISPR/Cas9 генотерапии AATD. В одном исследовании использованы два параллельных подхода с использованием двойной AAV8 системы, при этом один вектор кодировал saCas9, малую версию Cas9, происходящую от S. aureus, а др. вектор кодировал или gRNA или gRNA и донорскую ДНК.246 первый подход использован, чтобы решить вопрос с фенотипом избыточности функции при болезни печени путем создания indels посредством NHEJ. Это привело к 98% снижению в кровообращении PiZ и к 86% снижению агрегатов PiZ в гепатоцитах.246 Второй подход корректировал фенотип потери функции при болезни легких с помощью HDR. Это привело к 5% коррекции. В третьем исследовании использовали сходную двойную стратеги с AAV, при этом один вектор AAV9, который обладал более широким клеточным тропизмом для кодируемой Cas9, а второй AAV8 с гепатоцеллюярным тропизмом, нес gRNA и HDR матрицу.247 Использование этих векторов привело к частоте HDR в 15-20% у новорожденных и у взрослых PiZ трансгенных мышей и к уровням секретируемой M-AAT вплоть до 71 µg/mL.247 Четвертое исследование использовало knock-in подход, нацелен на обладающих ROSA26 safe harbor локусом, мышей C57B1/CJ .248 Двойной вектор Ad5 с одним, кодирующим человеческую M-AAT донорскую ДНК и др. кодирующий Cas9 и gRNA, обеспечивал долговременную экспрессию M-AAT, длящуюся более 200 дней и устойчивый уровень в сыворотке M-AAT вплоть до 100 µg/mL.249

Development of improved vectors for airway delivery and advancements in gene editing systems has brought remarkable progress. Major breakthroughs have occurred in CRISPR technology, including the advent of base editing and prime editing. Low indel and off-target frequencies with these approaches suggest that base editing and/or prime editing may be safer and more effective than traditional ZFN or CRISPR/Cas9 gene correction. Further study using in vivo models, optimization of correction efficiency, and adaptation to lung delivery will be required to assess therapeutic value.

As progress continues, open questions remain regarding the cell types targeted and the duration of treatment. Many airway epithelial cells that are accessible to vector delivery are terminally differentiated. As cells turn over, readministration may be required to continue to achieve therapeutic value. Investigation of the immune response and the potential for repeated dosing will be critical to future advancements.

Targeting of basal cells and other progenitor cell types could result in a lifelong cure using gene therapy; however, the effect of gene addition and gene editing on these cellular compartments is not fully understood. Determining transcriptomic changes in basal cells and other regional progenitor cell types after gene addition or editing and assessing their ability to differentiate and self-renew will provide important information on targeting these cell types for treatment of lung disease.