Масса и размер мышц обычно уменьшаются с возрастом и этот феномен известен как sarcopenia. Эта зависимая от возраста атрофия коррелирует с недостаточными уровнями мышечных клеток, дифференцирующихся и пролиферирующих под регуляцией сигнального пути TGF-β и экспрессией E3s ubiquitin-protein ligase при старении. Саркопения оказывает значительное влияние сообщество пожилых, поскольку оно характеризуется высоким показателем пространных побочных эффектов и постепенным ухудшением болезней. Управляемая с помощью single-guide RNA (sgRNA), Cas9 нуклеаза широко используется при редактировании генома, открывая новые пути лечения саркопении. Здесь представлены две системы rAAV9, pX601-AAV-CMV:SaCas9-U6:sgRNA и pX601-AAV-EF1α:SaCas9-tRNAGLN: sgRNA, которые эффективно редактируют myostatin. Путем доставки с помощью двух rAAV-SaCas9 целенаправленно воздейстовали на myostatin с помощью внутримышечных инъекций старым мышам, увеличивался вес телаи возрастали количество и площадь миофибрилл. Нокаут myostatin приводит к изменениями пути передачи сигналов TGF-β и повышает уровни белков MyoD, Pax7 и MyoG и повышает количества сателлитных клеток, чтобы улучшить дифференцировку мышечных клеток. Более того, нокаут myostatin предупреждает атрофию мышечных клеток, редуцируя уровни белков Murf1 и MAFbx. Мы установили, что обе системы rAAV-SaCas9 эффективно редактируют гены, снижая экспрессию myostatin путем воздействия на соотв. сигнальные пути, изменяя тем самым физиологический статус. Мы показали, что myostatin выполняет важную роль в активации пролиферации скелетных мышц и подавляет мышечную атрофию во время старения. Мы полагаем, что нокаут myostatin с использованием rAAV9-SaCas9 системы обладает значительным терапевтическим потенциалом при саркопении.

Недавние исследования показали, что относительно компактная SaCas9 активна обеспечивает редактирование генома in vivo [25,26,27]. Эффективность SaCas9 сравнима с таковой у SpCas9. В 3-х независимых исследованиях было показано, что SaCas9 специфична к разным сайтам мишеням в клетках человека [1, 28, 29]. Путем замещения некоторых положительно заряженных остатков незаряженными аминокислотами группа Zhang's разработала вариант SaCas9 с высокой специфичностью [1]. Наши две SaCas9 конструкции оказались способны разрушать гены и эффективно вызывать редактирование генома in vitro и in vivo. Мы создали две версии конструкций SaCas9 с разными sgRNA промоторами, U6 pro (~241 bp) и tRNA GLN pro (~72 bp) и разными SaCas9 промоторами, CMV pro (~584 bp) и EF1α pro (~212 bp), и установили, что R-SaCas9 конструкция (pX601-EF1α:SaCas9-tRNA:sgRNA), которая была сходна с SaCas9 (pX601-CMV:SaCas9-U6:sgRNA) может использоваться для редактирования генома и влиять на экспрессию белка MSTN в C2C12 клетках и в мышцах мышей. Эти находки подтвердили, что генотерапия in vivo с использованием конструкции SaCas9 обладает потенциалом высокой эффективности.

Чтобы исследовать эффекты MSTN на мышечную атрофию у старых мышей, мы также разработали all-in-one AAV-sgMstn2 и RAAV-sgMstn2 вирусы, регулирующие MSTN. Единая векторная система имеет преимущества, поскольку AAV вирус содержит SaCas9 и sgRNA. Следовательно, лишь один вирус необходим для геномного редактирования у животных и в линиях клеток [30]. В целом мы наблюдали эффективное редактирование генома с двумя rAAV-SaCas9 вирусами достигающее исправления ~20.81% и 18.13% геномных мутаций у старых мышей. Это исследование повысило величину инъецируемых AAV вирусов в 5 раз, а эффективность редактирования также была более высокой [12, 31, 32, 33]. Исследования Siriett and Wagner показали, что старение существенно влияет на миогенез из-за поведения миогенных регуляторных факторов и поведения миобластов. Эти эксперименты показали, что отсутствие MSTN достоверно увеличивает регенерацию мышц и снижает мышечную атрофию [34, 35]. Более того, показано, что нокаут Mstn может воспроизводить этот эффект на мышцах старых мышей. Увеличение веса тела, наблюдаемое у anti-MSTN мышей было достоверно выше, чем в контроле. Более того, по сравнению с контрольными мышами количество и объём мышечных волокон возрастали у Mstn нокаутных мышей Schiaffino et al. [36] показали, что подавление MSTN белка способствует гипертрофии мышц и приросту веса тела у взрослых. McPherron and Lee [37] вызывали нокаут гена Mstn у мышей и обнаружили, что такие мыши имеют большую мышечную массу, более широко распределенные группы скелетных мышц и более крупный диаметр мышечных волокон. Эти находки согласуются с нашими экспериментальными данными. Вес quadriceps и adductor мышц увеличивался примерно на 0.2-0.3µg , а общий вес увеличивался на 1-1.5µg у нокаутных по Mstn мышей. Замедлялась атрофия мышц увеличивалось качество костей и секреция некоторых гормонов [38,39,40].

В связанных с TGF-β сигнальных путях у anti-MSTN мышей увеличивалась экспрессия CDK2 за счет снижения экспрессии p21, а значит активации клеток из G2 фазы в M фазу. Thomas et al. [41] установили, что MSTN подавляет фосфорилирование Rb белка путем усиления p21 и ослабления CDK2, ингибируя тем самым пролиферацию миобластов. Наши результаты подтверждают это, т.к. нокаут Mstn приводит к снижению Smad2 и p21. Эти изменения в уровнях CDK2 были увеличены у Mstn нокаутных мышей. Более того, рост мышц и атрофия, прежде всего, зависят от активности AKT/mTOR сигнального пути [42]. MSTN оказывает влияние на этот путь передачи сигналов, а подавление экспрессии гена Mstn индуцирует мышечный рост преимущественно стимулируя синтез белка посредством mTOR киназы и подавления деградации, вызываемой FoxO транскрипционными факторами [43]. Наши результаты показали, что накаут MSTN вызывает увеличение AKT и mTOR. Экспрессия FoxO1 репрессируется нокаутом Mstn у старых мышей. Эти ключевые цитокины имеют важное влияние на анаболизм белков, связанных с пролиферацией и дифференцировкой мышечных клеток, и возникновением клеточного цикла.

Arnold с колл. установили, что подавление экспрессии MSTN сопровождается дифференциальной экспрессией миогенных регуляторных факторов. Так, экспрессия члена миогенных регуляторных факторов, MyoG тесно связана с ростом и дифференцировкой скелетных мышц. Мы показали, что нокаут Mstn ведет к увеличению MyoD и MyoG старых мышей. Более того, Pax7, широко используемый маркер сателлитных клеток, также увеличивается у Mstn нокаутных мышей по сравнению с мышами, обработанными AAV-CN. Это подтверждает, что сателлитные клетки более активны и подвергаются дифференцировке. Ни MAFbx, ни MuRF1 необязательны для нормального роста мышц, но их отсутствие, как было установлено, снижает величину мышечной атрофии [44]. Во время атрофии, MAFbx катализирует деградацию белков, это способствует синтезу белков, тогда как др. лигазы, особенно MuRF1, катализируют убиквитилирование и деградацию компонентов миофибрилл и цитоскелета [45, 46]. Наш анализ ubiquitin-protein лигаз показал, что уровни MuRF1 и MAFbx снижены в группе с нокаутом Mstn. Эти цитокины обнаруживают непосредственную роль в пролиферации, дифференцировке и атрофии мышечных клеток.

Consitt and Clark [47] показали, что передача сигналов MSTN выполняет важную роль в подавлении роста скелетных мышц, приводя к метаболической дисфункции в популяциях стариков. Scimeca et al. [48] подчеркнули роль пути MSTN в физиологическом механизме саркопении у людей, подчеркнув, что anti-MSTN антитела могут обладать способностью лечить саркопению. Camporez с сотр. показали, что мышечная масса и мышечная сила у молодых и старых мышей увеличивается после воздействия anti-MSTN антителами. Это подтверждает фармакологическое подавление MSTN обладает потенциалом терапии связанной с возрастом саркопении и метаболических болезней [49]. Наши эксперименты также показывают, что снижение экспрессии MSTN посредством rAAV-SaCa9 вирусов эффективно ослабляют мышечную атрофию у старых мышей. Хотя подавление MSTN пока не используется для лечения саркопении, MSTN и AAV-Cas9 привлекают все больше внимание в качестве терапевтических мишеней.

Итак, мы продемонстрировали, что два rAAV-SaCas9 вируса могут быть использованы для эффективного редактирования генома у старых мышей. Увеличиваются количество и объем клеток мышечных волокон и пролиферация и дифференцировка сателлитных клеток . Эффект от нокаута Mstn в атрофирующихся мышеных клетках связан с изменениями пути передачи сигналов TGF-β и ubiquitin-proteasome пути.