3D печать и биопринтинг активно используются в области формирования комплексов посредством коллоидной само-сборки [22], регенерации ткани и кости [23-27], систем культивирования клеток нейробластомы [28], изготовление нервных трубок или искуственная продукция имплантов [29-31], построения мышечных клеток [32], доставки вакцин [33], молекулярной диагностике [34], и т.д. Технология 3DBP обладает огромным потенциалом для доставки генов в дефектные клетки при разных болезнях, для искусственного преобразования тканей и регенерационной медицины и особенно для лечения костных дефектов, при этом специфические нуклеиновые кислоты д. точно помещаться в 3D печатаемую ткань, орган или каркас (костные или мышечные импланты) для лечения. Это также верно для стволовых клеток, энзимов, факторов роста и др. биоактивных элементов , которые повышают экспрессию генов, поскольку они собираются в 3D сchernehs слой за слоем. Некоторые из этих подходов по 3D печати суммированы на Fig. 2. Сходным образом, эволюция терапии стволовыми клетками или др. типами клеток, нанотехнологии и молекулярная медицина существенно ускорилась в плане трансфекции генов в клетки хозяина. Наноносители, векторы и чувствительные к стимулам грузы или системы конъюгации разрабатываются успешно в отношении свойств высвобождения, что помогает легко переносить гены с помощью разных техник редактирования. Наноносители используются в комбинации с3D отпечатанными каркасами с использованием их индивидуальных характеристик, для доставки генов и родственных молекул и контроля их свойств. [35] Методы подготовки для модуляции генов и ген терапевтических каркасов суммированы на Fig. 3. Примером доставки генов является исследование по производству 3D отпечатанных каркасов для доставки мРНК. При этом poly-lactide (PLA) 3D отпечатанные каркасы были разработаны посредством использования программы Tinkercad и метода, базирующегося на выдавливании. Такие каркасы затем покрывали Rhodamine-меченными флуоресцентными PAMAM дендримерами. Наконец, FAM-mir-503 (miRNA ген) был инкубирован с этими функцинализованными PLA каркасами. Была оценена и измерена трансфекция клеток HeLa этими PLA каркасами. Изображения конфокальной микроскопии показали, что интернализация флуоресцентных производных дендримеров облегчает клеточную пролиферацию на их поверхности и действует как новый не токсичный вектор доставки для переноса miRNAs в клетки человека в исследованиях in vitro [36].



Fig. 2 Applications of 3D bioprinting

Fig. 3 Methods of preparation for gene modulating scaffolds

Использование 3DBP было также применено для продукции подлинных клеток, тканей и органов в качестве подхода по тканевому инженерингу и для разработки каркасов из биоматериалов при этом клетки засевались с большой точностью. Напр., клетки Chinese Hamster Ovary (CHO) подверглись 3D биопринтингу с помощью технологии термального струйного принтера, в этом случае печатающая головка состояла из узкого чайного горлышка (диаметр: 48 mm) , чтобы выталкивать клетки и далее эти клетки анализировали в отношении клеточной жизнеспособности, присутствия повреждений мембран клеток (вызываемых нагреванием или стрессами от системы, базирующей на выталкивании) и апоптоза. Эти результаты продемонстрировали клеточную жизнеспособность на уровне~89% и клеточного апоптоза на уровне ~3.5%, тогда как возникали временные поры в клеточных мембранах во время процесса печати, которые репарировались спустя 2 ч после печати. Выдающимся достижением этого исследования стала доставка генов мишеней в виде green-fluorescent protein (GPA) ДНК плазмид в CHO-S клетки с помощью метода co-printing. Эффективность трансфекции, как было установлено, составляет более ~30% клеток, отпечатанных с помощью GFP-плазмид, в то время как экспрессия GFP не была обнаружена в смеси не отпечатанных клеток с плазмидами. Было также отмечено, что временные поры в клеточных мембранах помогают эффективной доставке генных микрочастиц, которые в дальнейшем индуцируют рост преобразованной ткани. [37] Сходное исследование использовало Porcine Aortic Endothelial (PAE) клетки для оценки трансфекции гена и доставки клеток с помощью каркасов, отпечатанных на базе струйного 3D принтера. В этом случае эффективность in vitro трансфекции составляла свыше ~10% ьлшжа как после трансфекции клеточная жизнеспособность составляла более ~90%. Кроме того, попеременная печать fibrinogen и thrombin, сопровождаемая прямым co-printing клеток PAE и плазмидной ДНК in vivo в подкожную ткань бестимусных мышей приводила к образованию 3D cuboid-based конструкций из геля фибрина с трансфицированным геном. Целенаправленная доставка генетически модифицированных PAE клеток в каркас из 3D fibrin геля была подтверждена с помощью экспрессии GFP и тем самым было показано наличие потенциала по разработке 3D каркасов in-situ для базирующейся на клетках генотерапии. [38]

Др. исследование с использованием мРНК терапии для репарации дефектов костей свода с помощью 3D печати гибридного каркаса в качестве системы доставки. В этом исследовании трансфицировали фотоактивированные конъюгированные с miR-148b наночастицы серебра в стволовые клетки костного мозга и затем помещали клетки в коллагеновый собранный 3D каркас, представленный poly (lactide-co-glycolide) (PLGA), polycaprolactone (PCL) hydroxyapatite (HAp). Персонализованный 3D принтер (Multi-Arm BioPrinter) был использован, чтобы механически выталкивать гнезда (frames) каркаса. Трансфицированные с помощью miRNA клетки обнаруживали: 1) высокую экспрессию остеогенного маркера, такого как RUNX2 и биоминерализацию костного sialoprotein (BSP), 2) улучшенное формирование кости и 3) высокую плотность минералов в кости (~34%) по сравнению с не трансфицированными клетками. Такая структура продуцировалась, чтобы преодолеть проблемы, такие как дезорганизация тканевого интерфейса, биологическая нестабильность, короткий период полу-жизни, плохая интеграция ткани и т.д. встречающиеся при обычной генотерапии черепно-лицевых костей. [39] Сходным образом, использование подходов персонализованной и локальной доставки программируемых факторов для репарации кости может быть использовано и при др. Экспериментах, где полимерные (PLGA/PEG) микрочастицы (? 50 ?m) были нагружены фактором транскрипции GET-RUNX2. Эти микрочастицы были смешаны с чувствительными к температуре материалами (Pluronic F-127, и т.д.) и печатались с помощью выдавливания (штамповки) посредством RegenHU 3D Discovery 3D принтера, так что эти каркасы могли трансформироваться в подобную кости структуру кристаллической решетки при температуре тела. Позднее исследовали эффекты мезенхимных стволовых клеток совместно печатаемых 3D каркасами, содержащими микрочастицы. Исследования in vitro продемонстрировали, что засеянные стволовые клетки индуцировали очень высокий остеогенез в ответ на воздействие транскрипционного фактора, благодаря устойчивому профилю высвобождения RUNX2 из инкапсулированных микрочастиц. [40] С др. стороны, 3D отпечатанные каркасы были также способны модулировать экспрессию генов, как в случае эксперимента, в котором были разработаны гидрогели для регенерации костной ткани с помощью биосовместимых bioinks, а именно желатина и alginate. Конформационные изменения в сфабрикованных каркасах, такие как размер, пористость и механические свойства изменяли экспрессию остеогенных генов в MC3T3-E1 клетках. [41]

Были спробованы невирусные генные векторы, включенные в биоотпечатанные структуры, в качестве стратегии для регенеративной медицины и искусственного преобразования ткани. В этом случае плазмиды (pDNA) были внедрены в раствор nano-hydroxyapatite, чтобы сформировать комплексы и затем геном активируемый bioink был приготовлен путем смешивания этих комплексов с раствором RGD-?-облученного alginate. Затем осуществляли трансфекцию этих комплексов в полученные от свиней мезенхимные стволовые клетки (MSCs) Наконец, этот геном активированный bioink подвергся 3D печати в конструкцию с помощью 3D Discovery системы с множественными головками и техникой слитого отложения, которая одновременно печатала bioink и расплавленный poly-caprolactone в механически стабильные каркасы. Исследования in vitro также продемонстрировали очень высокое воздействие на остеогенез MSCs благодаря эффективной совместной доставке pDNA, кодирующей терапевтические гены- Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2) и Transforming Growth Factor (TGF- β3). Геном активируемый каркас поддерживает экспрессию генов (свыше 14 дней) улучшает кровоснабжение (около 12 недель) и униформное отложение кости. Исследования in vivoв течение 1 мес. Также показали достоверное увеличение уровней отложения минералов. Т.о., это исследование показало специально разработанный и 'point-of-care' метод трансфекции гена при остеогенезе и доставки гена. [42] Сходным образом, 3D печать также облегчает разработку др. генетически модифицированных bioinks, которые являются или формирующими поры гидрогели, которые обеспечивают быструю трансфекцию, или плотные bioinks, обнаруживающие устойчивые эффекты. Такие bioinks в дальнейшем приводят к формированию механически устойчивых конструкций, которые обеспечивают эффективную доставку пептидов, базирующихся на pDNA генах и делают возможным становление пространственно сложной тканевой структуры. [43] Использование 3D биопринтинга наблюдалось также при врожденной дисплазии тазобедренного сустава с индукцией нарушений суставного хряща, характеризующихся пониженными уровнями экспрессии Growth Differentiation Factor (GDF5). В этом исследовании конструкции базировались на генетически инспирированных 3D биоотпечатанных каркасах, при этом ген фактора роста был конъюгирован на стволовых клеток, происходящих из костного мозга кроликов, которые затем превращались в клетки, нагруженные гидрогелем и печатаемые вместе с PCL. Компьютером cгенерированные тканевые модели были использованы для контроля печати с помощью organ printing united system (OPUS). Результаты показали ~95% выживаемость клеток с улучшенным эффектом репарации in vivo в коленном хряще кроликов и далее продемонстрирована также регенерация ткани. [44] Доставка с помощью не вирусного вектора гена (DNA) , кодирующего остеогенный агент, наз. bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) используется в регенеративной медицине, чтобы сформировать кость in vivo. В этом исследовании подготовлен геном активируемый 3D гидрогель для индукции роста кости и формирования кровеносных сосудов в теле в случае перелома кости и др. дефектов. Здесь BMP-2 трансфицировали в multipotent stromal cells (MSCs) от коз в комбинации с частицами alginate и calcium phosphate, чтобы получить 3D структуры посредством системы BioScaffolder, базирующейся на технике 3D отложения волокон. Каркас обеспечивал устойчивую продукцию и высвобождение pBMP-2 в течение 5 недель и обнаруживал также более высокую экспрессию in vitro osteocalcin из пористых биоотпчатанных каркасов (~70%), чем плотные каркасы (~50%) , и по сравнению с обычным контролем (<2%). С др. стороны, анализ окрашивания обнаружил негативные результаты, указывающие на то, что не происходит образование настоящей кости in vivo в конце 6 недель. Это исследование приводит к выводу, что негативные результаты обусловлены высокой концентрацией alginate, использованного в каркасах, что приводит к формированию мелких пор и медленному и несвоевременному высвобождению BMP-2, демонстрируя тем самым, что механические аспекты 3D печати каркасов играют большую роль в высвобождении и экспрессии. [45]

Доставка генов, базирующаяся на клетках путем создания 3D каркасов (депо), разработана для лечения благоприобретенных наследственных болезней и известно её использование в тканевом преобразовании и лечении рака. Исследование по разработке микро/макропористых poly-L-lactide (PLLA) каркасов, которые засеиваются mesenchymal stromal cells (MSCs), происходящими из костного мозга мыши. Эти MSCs были генетически преобразованы, чтобы секретировать erythropoietin (EPO). Каркасы были созданы с помощью solid free-form технологии, используя 3D компоновку и технику вымывания пор, в результате чего возникают взаимосоединенные поры на каркасах. Микропористость каркасов способствует транспорту кислорода и питательных веществ , усиливая тем самым выживаемость и жизнеспособность клеток, тогда как макропоры усиливают миграцию клеток. Большая область поверхности пор и ступнчатообразный паттерн offset plotting (компановки) каркасов увеличивает прикрепляемость и пролиферацию клеток и метаболическую активность в течение более 2-х недель и увеличивает доставку терапевтических белков и растворимых генных продуктов. Генетически модифицированные MSCs способствуют устойчивому высвобождению растворимых генных продуктов (EPO белок), которые также увеличивают пористость депо. [46]

Первичные или вторичные метастатические опухоли, которые метастазируют в кость, удаляются во время хирургического вмешательства, однако, они могут заполнять опустевшее место и могут приводить к повторному появлению опухоли из-за остаточных опухолевых клеток. Каркасы, разработанные с помощью добавочной продукции (3D печати), которые заполняют такие пустоты, способны к устойчивому или продолжительному высвобождению лекарства и могут быть способны разрушать оставшиеся раковые клетки и поэтому такие структуры используются при химиотерапии. Изучение разработанных с двойной доставкой 3D напечатанных PCL каркасов, функционирование которых запускается с помощью chitosan/siRNA наночастиц и doxorubicin, при этом siRNA используются для индукции молчания генов для предупреждения резистентности к лекарствам против опухолей и также для индукции взаимно усиливающего действия с doxorubicin в отношении гибели раковых клеток. При этом каркас обнаруживает взрывное высвобождение release siRNA, которая индуцирует последовательно замалчивание специфического гена, которое поддерживается в течение 7 дней в non-small cell легочной карциноме (H1299) и клетках глиомы (U251). Более того, исследования токсичности показали взаимоусиливающую цитотоксичность chitosan наночастиц с низкими концентрациями doxorubicin. Это было индуцировано в siRNA независимым от последовательности способом в клетках рака легких в противовес не покрытым группам. Такое взаимоусиливающее действие, как полагают, обусловлено увеличением потребления doxorubicin посредством клеточных мембран, что дестабилизирует и/или индуцирует апоптоз или некроз, обусловленный комбинацией лекарств. [47]

Генотерапия для лечения сосудистых болезней влечет за собой использование векторов, экспрессируюших кодируемые ангиогенные факторы. Ангиогенная генотерапия связана с переносом генов, кодирующих ангиогенные факторы, что способствует формированию новых сосудов (ангиогенезу). Основные гены, используемые для приготовления векторов экспрессии, это Vascular Endothelial Factor (VEGF) и Fibroblast Growth Factor (FGF). [48] Разные исследования использовали ангиогенный VEGF для формирования сосудистой сети в тканях в качестве подхода по регенерации ткани. Изучли инкапсулированные в наночастицы VEGF путем образования комплексов с dextran sulphate и путем коацервации с полимером chitosan. Такие наночастицы затем инкорпорировали в два типа 3D матриц - каркасы PLGA и гидрогели Matrigel™. Эффективность действия VEGF улучшалась благодаря методу инкапсуляции и паттерну контролируемого высвобождения из этих 3D имплантов, а также улучшался ангиогенез in vivo. Гидрогель, нагруженный инкапсулированным VEGF усиливал ангиогенез в ~5-7 раз по сравнению с гидрогелем, нагруженным свободным VEGF, тогда как ~3.5 раз усиливался ангиогенез при использовании каркасов, нагруженных инкапсулированным VEGF, по сравнению с не инкапсулированным VEGF, загруженным в PLGA депо [49]. Хотя в этом исследовании не использовали технологию 3D печати, Matrigel™ (только у мышей) [50, 51] и PLGA [52] каркасы были использованы как bioinks для биопринтинга и сходные подходы могут быть в дальнейшем использованы в области биопринтинга для создания имплантов, высвобождающих ростовые факторы, и для регенерации тканей. Сходные платформы применяли для использования регенеративной медициной и техникой доставки генов с помощью гидрогелей, в случае наночастиц heparin-chitosan с гидрогелями PEG для доставки с помощью лентивирусов и для экспрессии VEGF, чтобы способствовать ангиогенезу. Функционализованные с помощью лентивирусов PEG гидрогели готовили путем растворения PEG-acrylate с помощью photoinitiator, заморозки и обработки УФЛ (для образования сетчатых структур в растворе PEG). Такие гидрогели затем инкорпорировали с heparin-chitosan наночастицами для иммобилизации лентивирусов с помощью пористых сcherneh PEG гидрогеля. Связывание и удержание лентивирусов в таком виде приводило к устойчивому и существенному повышению экспрессии трансгена in vitro и in vivo и демонстрировало улучшение сосудистого роста. [53]

Более того, одновременно с доставкой гена использование 3D отпечатанных, базирующихся на генах наносистем может быть использовано для становления чувствительных к стимулам биосенсоров, функционализированных с помощью нуклеиновых кислот или в качестве систем для локализации ДНК сигналов. Напр., использование функционализованных с помощью ДНК bioinks используется для продукции в additive наномедицине. Такой подход базируется на подходящих по цене и простых в производстве методах, в которых ДНК обеспечивает создание динамичной и формирующей паттерн техники. Здесь нити ДНК инкорпорируются внутри гидрогеля с помощью выбрасывающего капли 3D принтера (Ultimaker Original+) с помощью python script reading программы, чтобы локализовать последовательность ДНК, и программы, отвечающей за свойства их диффузии. Смешанные gelatin, alginate и agarose, функционализованные с помощью ssDNA посредством click химии, были загружены в головку принтера и выдавливались посредством носика на предметное стекло в подготовленные гидрогели [54]. Др. пример, запускаемой (функционализованной) геном 3D печати, стало исследование, в котором ДНК - ДНК взаимодействие было использовано в качестве смарт-клея ('smart-glue') для склеивания микрочастиц в ансамбль в коллоидном геле при 3D выталкивании. Структурная целостность такого геля и сборка микрочастиц в клетках хозяина поддерживалась исключительно с помощью ДНК - ДНК взаимодействий. Здесь сначала готовилась суспензия конъюгированных с ДНК polystyrene микрочастиц, которые позднее загружали в контролируемый компьютером и модифицированный Replicator 3D принтер, чтобы сформировать само-собирающийся коллоидный гель с разными 3D формами. Форма и размер пор и текучесть (rheology) этой коллоидной системы поддерживались с помощью комплементарной ДНК линкерной последовательности, присутствующей в качестве клея между следующими др. за др. Микрочастиц. ДНК слипчивость или соединяемость (connectors) в 3DP делает возможным её использование для создания комплексов коллоидных структур. [55] Создание siRNA и miRNA-нагруженных нано-носителей для лечения болезней также рассматривается как важный подход к 3DP доставке генов. В одном исследовании разработали 3D печатаемые microfluidic chips в качестве косвенного метода для продукции siRNA-polymer нано-комплексов для подавления белков и замалчивания генов. Разные геометрия, гидродинамика и структура каналов печатаемых chips обеспечивает различия в эффективности нано-комплексов. Здесь microfluidic chips были 3D отпечатаны посредством техники stereolithography с использованием Accura 25 (resin) в качестве bioink и COMSOL Multiphysics 5.3a модуля для конструирования. Далее нано-комплексы фабриковались путем инъекций раствора siRNA посредством центрального входа (inlet), PAMAM полимерного дендримера посредством боковых отверстий (inlets) , а их скорость тока контролировалась, при этом оба раствора смешивались внутри микрочипа. Оптимизация гидродинамического тока в связи с разной геометрией microfluidic чипов осуществлялась с помощью in-silico симуляций. Желательные характеристики сформированных siRNA нано-комплексов, такие как заряд и размер зависели от геометрии microfluidic чипа и могли быть модулированы путем изменения ширины каналов, размера каналов и углового расстояния (spacing). Хотя продукция нано-комплексов посредством microfluidics обнаруживала хорошую воспроизводимость, затраты времени и контроль качества, обусловленные автоматическими процедурами, сравнимы с обычными методами. [56] Сходные подходы к 3D печати каркасов, имплантов и преобразованных тканей вместе с CAD-обеспечивающими устройствами были разработаны для доставки любых генов (siRNA, mRNA и искусственных олигонуклеотидов) для редактирования генов и генотерапии или для переноса элементов (белков, энзимов, вакцин) с целью модулирования экспрессии генов. Напротив, генетически модифицированные биологические элементы могут быть использованы в качестве bioinks для стабилизации 3D печатаемых каркасов, напр., elastin-подобные recombinamers были генетически модифицированы и использованы в качестве bioinks для биопринтинга из нагруженных клеток. Такие biomimetic bioink создают подходящее окружение для роста и пролиферации клеток. [57] Общая картина исследований, демонстрирующая генотерапию или модуляцию посредством 3D печати каркасов представлена на Fig. 4.

Fig. 4 Overall summary of 3D printed scaffolds used in gene therapy