Посещений:
БОКОВОЙ АМИОТРОФИЧЕСКИЙ СКЛЕРОЗ



ген-Терапевтические подходы

Gene therapy for ALS: A review
Defne A.Amado, Beverly L.Davidson
https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2021.04.008



Боковой амиотрофический склероз (ALS) исторически создавал уникальные проблемы для подходов, основанных на генной терапии, из-за нехватки терапевтических мишеней, а также трудности доступа как к головному, так и к спинному мозгу. Однако недавние достижения в нашем понимании механизма заболевания и генетики ALS в сочетании с огромными успехами в целенаправленном воздействии на ЦНС, доставке генов, редактировании генов и методах нокдауна открыли новые горизонты терапевтических возможностей. Клинические испытания с использованием генотерапии сегодня коснулись и ALS пациентов с мутациями SOD1, экспансией C9orf72 hexanucleotide повторов, экспансией ATXN2 тринуклеотидов, а также со спорадической болезнью без известной генетической причины.
ALS фатальное заболевание, характеризующееся дегенерацией верхних и нижних двигательных нейронов, что приводит к прогрессирующему параличу, дыхательной недостаточности и гибели в 2-5 лет. Оно также наиболее распространенное заболевание двигательных нейронов взрослых, с распространенностью 5 на 100,0001 и пожизненным риском 1:400-1:800.2 Изучению терапевтических подходов, модифицирующих болезнь, длительное время мешало плохое понимание механизма болезни. Фактически, из более 80 клинических испытаний на людях,3 только riluzole4,5 и edaravone6-8 демонстрировали прогресс, оба действовали умеренно путем целенаправленного воздействия на неспецифические факторы, такие как эксцитотоксичность или окислительный стресс. Недавние успехи в нашем понимании патофизиологии ALS, в том числе открытие многих его генетических основ позволило разработать все более целенаправленные методы лечения, а сегодняшние клинические испытания дают все больше надежды и надежды на эффективное лечение.
Патологические проявления ALS, у более 97% пациентов, являются убиквитинированными цитоплазматическими включениями, состоящими в основном из Tar-ДНК-связывающего белка 43 кДа (TDP-43).9,10 Патология TDP-43 также обнаруживается у 50% пациентов с лобно-височной деменцией (FTD) и наблюдается почти во всех случаях спектра ALS-FTD.9-13 Обычно обнаруживаемые в ядре, TDP-43 широко способствуют транскрипции, трансляции и сплайсингу,14-17, взаимодействуя с ~30% транскриптома.14 Его неправильная локализация в цитоплазме, как полагают, вредна в двух отношениях: (1) токсичность цитоплазматических агрегатов,18,19 и (2) потеря нормальной ядерной функции.20-24 В двигательных нейронах от ALS пациентов, TDP-43 ассоциирует с цитоплазматическими stress granules (SGs),25,26, конгломераторами из белков и РНК, которые становятся неадекватными при болезни. SGs, кроме того, связаны с ядерным импортом, экспортом и факторами транскрипции и трансляции, это приводит к потере снования между ядром и цитоплазмой и в конечном итоге клетка погибает.25-27 Этот внутриклеточный каскад содержит несколько терапевтических мишеней, патологических элементов, общих большинству случаев ALS.14
Др. подход и одна из наиболее важных техник генотерапии, целенаправленно воздействует на генетические мутации, как известно, вызывающие ALS. 10% ALS может быть классифицировано как семейные случаи, при этом ~70% семейных случаев связаны с известными генными мутациями.28 Первым описанным ассоциированным с ALS геном, стал ген superoxide dismutase-1 (SOD1),29 в 1993 он объясняет 12%-20% семейных и 1%-2% спорадических случаев ALS.28,29 В течение полутора десятка лет он оставался единственной известной наследуемой причиной и поэтому стал основой для всех пре-клинических моделей ALS.30,31 Однако, в отличие от 97% описанных случаев, SOD1-ALS пациенты не обнаруживали патологии TDP-43 при аутопсии, это создало впечатление, что SOD1 животные модели не представляют собой большую часть ALS патологии и исследования, проведенные на этих моделях не могут широко представлять патологию.30,31 В самом деле, большинство ранних исследований оказались непригодными для клинических испытаний на людях.32,33 До 2008 ничего не знали о втором участнике в наследственном ALS, о TARDBP, кодирующем TDP-43.34,35 Мутации TARDBP объясняют 4% семейных и 1% спорадических случаев, открытие этой непосредственной генетической причины и идентификация TDP-43 во включениях в двигательных нейронах привело к созданию дополнительных мышиных моделей.30,31,36,37 Годом позже открыты мутации в гене fused in sarcoma (FUS), объясняющие др. 4% семейных случаев ALS,38,39 хотя подобно SOD1, FUS пациенты лишены патологии TDP-43. В 2010, увеличенные промежуточной длины CAG тринуклеотидные повторы в гене ataxin-2 (ATXN2) были обнаружены в ассоциации с 4.7% всех ALS.40 Наиболее значительным генетическим открытием, кстати, стало то, что из C9Orf72 в 2011;41,42 увеличения G4C2 гесануклеотидных повторов в этом гене оказались связанными с 40% семейных и 8% спорадических случаев, или с 11% от всех ALS,28,43 и некоторые мышиные модели воспроизводили патофизиологию ALS.44,45 Более 20 дополнительных генов, ассоциированных с ALS, вместе обусловливают дополнительные 12%-15% семейных ALS,28,46, оставляя всё ещё 25%-30% семейных случаев необъяснимыми. Помимо SOD1 и FUS, патология TDP-43 наблюдается при всех мутациях, причем почти все известные гены, связанные с ALS, также идентифицируются при FTD или действуют как модификаторы фенотипа FTD, SOD1 является заметным исключением.10
Генотерапия связана с доставкой генетического материала в клетки, чтобы внести функциональную копию не функционирующего гена, внести трофические факторы и др. болезнь-модифицирующие гены или для замалчивания экспрессии вредного гена с помощью antisense oligonucleotides (ASOs), RNA interference (RNAi) или технологии редактирования генов, такой как CRISPR. Чтобы целенаправленно воздействовать на ЦНС, этот материал может быть доставлен голым, как это происходит в случае ASOs; c помощью вирусных векторов, включая adeno-associated virus (AAV) и др.; или c помощью физических или химических систем, таких как наночастицы.2,47 Методы для проникновения в ЦНС через гематоэнцефалический барьер внутривенные вливания (i.v.), введение в желудочки головного мозга (i.c.v.), intrathecal (i.t.), или введения внутрь паренхимы. В случае ALS необходимо проникновение в моторную часть коры головного мозга и спинной мозг.
Серотипы, которые доминируют в пре-клинических испытаниях ALS, это естественно возникшие AAV9 и AAVrh10, из-за своей способности целенаправленно воздействовать на двигательные нейроны51,52. В частности открытие, что self-complementary AAV9 (scAAV9) векторы пересекают гематоэнцефалический барьер51 привело к его использованию при лечении spinal muscular atrophy (SMA), при которой пациенты лишены функциональной копии гена SMN1,53, 54, 55 а последующие клинические исследования на людях выявили драматическую эффективность у SMA пациентов,56 поэтому US Food and Drug Administration (FDA) одобрил Zolgensma в 2019. Недавно новые технологии были использованы для создания новых AAV серотипов с повышенным тропизмом к ЦНС и экспрессией, затрагивающей периферические ткани,57, 58, 59 с гарантированной широкой эффективностью, и повышенной специфичностью. Большинство пре-клинических испытаний с лентивирусам и при ALS описаны в др. месте,49, сконцентрировавшись на доставке в мышцы или переносе генов ex vivo,49,62 включая один поход из комбинации обеих стратегий 62 который недавно завершил фазу I/II клинического испытания (ClinicalTrials.gov: NCT02943850).
ASOs


ASOs являются однонитчатыми в 8- 50-оснований последовательностями из синтетических олигонуклеотидов, которые могут быть созданы для комплементарных мРНК мишеней для RNase H энзимом обеспечиваемой деградации мишеней, нацеленной на первичные транскрипты для индукции альтернативного сплайсинга (Figure 1A).63, 64, 65 Недавно были осуществлены модификации по увеличению стабильности ASO, по защите от деградации нуклеазами, улучшено проникновение в клетку, рекрутирование RNase H и снижение иммуногенности.64 Хотя они не пересекают гематоэнцефалический барьер, ASOs достигают широкого распространения в ЦНС после их введения,63,65 это делает их важным инструментом против ALS. В самом деле, ASOs были успешно разработаны для воздействия на SMA. Для терапии SMA доставка нарушающих сплайсинг ASO приводит к конверсии SMN2 в SMN1, что прекрасно продемонстрировано на мышиных моделях SMA, а также продемонстрировано распределение по затронутым областям спинного мозга у не человеко-образных приматов (NHPs).66 Это сопровождало и клинические испытания, обнаруживая заметные улучшения в силе и продолжительности жизни детей с SMA,67, 68, 69 , это привело к одобрению FDA nusinersen в 2016 , которые теперь широко используется в клинике.

Figure 1. Summary of gene therapy strategies (A) Non-viral strategies include using ASOs to induce alternate splicing or RNase H-mediated degradation. (B and C) Viral strategies include (B) AAV-mediated gene silencing, through RNA interference or CRISPR-Cas9 or (C) AAV-mediated gene delivery including neurotrophic factors. AAV, adeno-associated virus; ASO, antisense oligonucleotide; Cas, CRISPR-associated system; miRNA, microRNA; PAM, protospacer adjacent motif; RISC, RNA-induced silencing complex; RNAi, RNA interference; shRNA, small hairpin RNA.



SOD1


о
Мутации в SOD1 , как полагают, вызывают ALS посредством избыточной токсичности, вызываемой агрегацией неправильно упакованного белка SOD1.30,70 Хотя известно более 150 ассоциированных с ALS мутаций SOD1, мутация G93A, редкая у людей, исследована наиболее широко на пре-клинических моделях SOD1G93A мышей71,72 и крыс.73 В ключевом пре-клиническом исследовании 20-mer ASO, нацеленный на доставлялся посредством непрерывного вливания в боковые желудочки крыс и поясничную часть спинного мозга NHPs и было продемонстрировано достоверное распространенное распределение концентраций ASO по головному и спинному мозгу глубокие ткани с проникновением в глубокие ткани.74 У SOD1G93A крыс леченных до появления симптомов, обнаруживается значительный нокдаун SOD1 мРНК и белка в головном и спинном мозге, это ассоциирует с замедлением прогрессирования болезни и увеличением выживаемости.74 Это привело к к фазе I клинического испытания (ClinicalTrials.gov: NCT01041222), при котором доставляли ASO ISIS 333611 посредством одиночного введения, 11.5-h i.t. пациентам с SOD1-ассоциированным ALS.75 Это исследование продемонстрировало безопасность и переносимость, а также продемонстрировало пригодность использования спинномозговой жидкости (CSF) SOD1 в качестве фармакокинетического маркера, при этом не было отмечено снижение в CSF SOD1 белка при используемых умеренных концентрациях (максимальная доза, 3 mg). Последующее испытание (ClinicalTrials.gov: NCT02623699) доставки ASO, под названием BIIB067/Tofersen (IONIS-SOD1Rx), осуществляется посредством серийных поясничных инъекций i.t. в течение 12 недель, в когорте пациентов в дозе в пределах 20-100 mg.76 Испытание продемонстрировало надежность этих высоких доз, а также снижение в CSF SOD1 белка до 33% в группе с наивысшей дозой. Анализ показал, многообещающее уменьшение скорости снижения согласно измерениям revised ALS functional rating scale (ALSFRS-R) в группе с высокой дозой, особенно среди пациентов с быстрым прогрессированием.76 Безопасность и эффективность теперь оцениваются в фаза 3, рандомизированного, дважды слепого, с плацебо в контроле испытании (ClinicalTrials.gov: NCT02623699) и более расширенном исследовании (ClinicalTrials.gov: NCT03070119). Помимо традиционной доставки голых ASOs, др. группа описала новый подход с использованием AAV для достижения целенаправленной и существенной экспрессии ASO. AAVrh10 экспрессирующий анти-смысловую последовательность, нацеленную на SOD1, внедренную в U7 малую ядерную РНК, доставляли с помощью i.v. и i.c.v. мышам SOD1G93A, при рождении или взрослым до появления симптомов, что приводило к nonsense-обусловленному распаду SOD1 и заметному увеличению жизнеспособности, силы и веса в обеих группах.77

C9orf72


Хотя полностью механизм, с помощью которого экспансии повторов C9orf72 hexanucleotide вызывают ALS, неизвестен, исследования указывают на выдающуюся роль функции токсической избыточности, обусловленной частично РНК с G4C2 повтором и частично белками с повторами дипептида, продуцируемого с помощью трансляции ассоциированного с повтором non-ATG (RAN).78,79 Первые базирующиеся на ASO стратегии концентрировались на снижении этой токсичности в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPSCs), происходящих от людей с экспансиями C9orf72. Три таких исследования опубликованы в 2013, они установили, что обусловленная ASO редукция C9orf72 транскриптов или посредством соединения с экспансиями повторов или с окружающими регионами, вызывая снижение фокусов ядерной РНК при ассоциированном с C9orf72 ALS.78,80,81 Две группы установили дополнительно, что воздействие ASO устраняет аберрантную экспрессию гена и снижает чувствительность к excitotoxicity в нейронах, дифференцированных из iPSC,78,81, тогда как третья группа продемонстрировала сохранение экспрессии аберрантной РНК после целенаправленного воздействия на смысловую нить и получила доказательства, подтверждающие важность одновременного целенаправленного воздействия на анти-смысловую нить.80 эта группа также впервые осуществила исследование in vivo, продемонстрировав значительную эффективность и переносимость нокдауна C9orf72 РНК у мышей дикого типа спустя 18 недель после одиночной инъекции ASO в боковые желудочки.80 В последующей работе авт. использовали одиночную i.c.v. инъекцию для доставки ASOs, нацеленных на смысловую нить РНК, содержащую G4C2 повторы, у пресимптоматических взрослых мышей, экспрессирующих до 450 повторов. Они продемонстрировали существенное снижение фокусов РНК и дипептидных повторов в белках в коре и спинном мозге, а также ослабление нарушений когнитивных способностей.82 Эта работа в конечном итоге привела к фазе I клинического испытания ASO BIIB078 (ClinicalTrials.gov: NCT03626012) C9orf72-ALS пациентов.

ATXN2


Хотя экспансии длинных тринуклеотидных повторов в ATXN2 были известны в качестве причины spinocerebellar ataxia type 2,83, 84, 85, 86 увеличения промежуточной длины были обнаружены в 2010 в качестве относительно распространенной причины наследственного ALS.40,87, 88, 89 Ataxin-2 выполняет разные функции в клетках, включая преобразования РНК и эндоцитоз рецепторов, но его критические функции связаны с формированием стрессовых гранул27,90 и индукцией аберрантного расщепления TDP-43 с помощью каспазы 391,92 особенно важны при ALS. В 2018 было продемонстрировано, что хозяйские факторы нуклео-цитоплазматического транспорта связаны с ataxin-2-содежащими SGs после индукции стрессов в HEK293T клетках. Далее, доставка ASOs, нацеленных на ataxin-2 в нейроны, происходящие из iPSCs от C9orf72-ALS пациентов, устраняла неправильную локализацию в цитоплазме ядерных белков.27 Плодотворная работа in vivo с использованием быстро прогрессирующих TDP-43 ALS модельных мышей продемонстрировала, что одиночная доставка Atxn2-ASO в боковые желудочки при рождении приводило к устойчивой, заметной редукции Atxn2 мРНК, а также к увеличению продолжительности жизни и улучшению походки.93 В то время как эти стратегия может быть успешной у пациентов с ATXN2-ALS, важно, что она также предоставляет терапевтический подход для более широкой популяции ALS, т.к. TDP-43 локализация в ATXN2-зависимых стрессовых гранулах является общей патологической конечной точкой.25 Осуществляется фаза I клинического испытания ASO BIIB105 (ClinicalTrials.gov: NCT04494256), с вовлечением пациентов с и без экспансий повторов CAG в ATXN2.

FUS


FUS является наиболее распространенным мутантным геном при ювенильном и детском ALS, при этом мутация p.P525L вызывает особенно агрессивную и раннюю форму с ранним началом94,95 за счет механизма токсической избыточной функции. В 2019, Ionis Pharmaceutical, в сотрудничестве с Columbia Medical Center, разработали ASO, нацеленный на эту мутацию посредством i.t. доставки и получили одобрение FDA для экспериментального использования у молодых женщин, у которых разрешена терапия с помощью jacifusen.96 Jaci с тех пор ушел в прошлое, но jacifusen использован для лечения трех дополнительных FUS-ALS пациентов FDA's по сострадательному протоколу и более 8 пациентов получили разрешение на экспериментальное исследование фондом ALS association and Project ALS.95,97,98

AAV-mediated gene silencing


AAV-обусловленное замалчивание имеет преимущества по сравнению с ASOs для необходимого устранения повторного использования, которое используется, когда воздействие нацелено на головной и спинной мозг. AAVs часто используются для доставки малых не кодирующих РНК, чтобы осуществить RNAi, естественно возникающего процесса, при котором двунитчатая РНК регулирует экспрессию мРНК посредством спаривания гомологичных оснований и последующего расщепления посредством RNAi-induced silencing complex (RISC; Figure 1B).2,99 Два типа малых не кодирующих РНК, small hairpin RNA (shRNA) и искусственных microRNA (miRNA), используются довольно широко в качестве терапевтической стратегии против нейродегенеративных болезней, в частности miRNA из-за её более надежно профиля безопасности.100,101 Дальнейшее усовершенствование было достигнуто путем использования биоинформационных инструментов, чтобы минимизировать загрузку пассажирской нити102 и оптимизировать промотор, серотип и выбор дозы,99 , приводя к значительному снижению эффектов вне мишени. Первое AAV-RNAi клиническое испытание на людях для нейродегенеративных болезней (ClinicalTrials.gov: NCT04120493) сегодня находится на ст. фазы I/II и использует AAV5 для доставки miRNA, нацеленной на Huntingtin для лечения болезни Huntington's .2,103 Это исследование выявило безопасность и пригодность данных и для ALS.
Альтернативным подходом к лечению нарушений с избыточностью функции стало редактирование генов с использованием CRISPR-associated (Cas) системы, с наиболее широко используемой RNA-guided Cas9 эндонуклеазой104 (Figure 1B). CRISPR-Cas9 делает возможным специфическое целенаправленное воздействие на геномные последовательности и индукцию разрывов двойной нити ДНК, вызывающих сдвиг рамки считывания в результате инсерций или делеций (indels) при разных подходах,105 её использование в области ALS довольно важно.106 Помимо системы, базирующейся на CRISPR. был разработан сходный трансформационный потенциал.107-110 Сюда входят CRISPR-interference (CRISPRi), которая использует каталитически мёртвую dead Cas9, чтобы репрессировать ДНК, не вызывая мутагенных эффектов, ассоциированных с разрывами;111 семейство Cas13, коорое целенаправленно воздействует на РНК для её деградации112,113 варианты которой достаточно малы, чтобы быть упакованы в AAV;114 и prime editing, метод введения специфических геномных инсерций или делеций без индукции разрывов двойной нити.115 Использование этих технологий в области ALS крайне ожидаемо в будущем.

SOD1


Т.к. первой идентифицированной формой ALS, была SOD1, то к ней было применено большинство базирующихся на AAV-RNAi подходов с многообещающими результатами. Первое AAV9 исследование с доставкой shRNA против SOD1 с помощью i.v. введения SOD1G93A мышам разных возрастов и было установлено увеличение на 39% выживаемости после P1-инъекции, которая снижалась значительно с возрастом и прогрессированием болезни;116 они отметили всё увеличивающееся предпочтительное целенаправленное воздействие на глию по сравнению с нейронами при поздних инъекциях.116,117 Они также обнаружили заметное увеличение жизнеспособности у SOD1G37R мышиных моделей с медленной прогрессией, когда воздействие производилось после начала болезни, и они продемонстрировали мощный нокдаун SOD1 мРНК по всему спинному мозгу у NHPs после поясничных i.t. инъекций.116 Др. группа использовала двухсторонние кортикальные инъекции AAV9-shRNA, целенаправленно воздействующих на SOD1 у взрослых крыс SOD1G93A до появления симптомов и установили, что супрессия только верхнего моторного SOD1 способна сохранять моторную функцию и повышать жизнеспособность до 20 дней.118 В исследовании 2016 использовали AAV9 для доставки искусственных miRNA против SOD1 (mi-SOD1) в желудочки новорожденных SOD1G93A мышей. Авт. обнаружили 50% увеличение продолжительности жизни с существенной задержкой параличей задних конечностей, а также улучшение многих гистопатологических параметров, включая количество спинальных моторных нейронов.119 Безусловно воздействие на новорожденных обладает ограниченной translatability, т.к. большинство пациентов находятся во взрослом состоянии после обнаружения симптомов и авт. поэтому предложили проведение отдельного исследования с использованием rAAVRh10 для доставки mi-SOD1 системно взрослым SOD1G93Aмышам. Они установили достоверную задержку начала болезни и 21% увеличение продолжительности жизни при сохранении силы и респираторной функции.120 Они затем тестировали вектор у мартышек посредством i.t. инъекций и установил достоверное снижение SOD1 в нижних двигательных нейронах по всему спинному мозгу без кратковременной токсичности.120 Последующее исследование rAAVRh10.mi-SOD1 у макак, с i.t. введением в голову, продемонстрировало мощное замалчивание на уровне мРНК в laser-captured двигательных нейронах по всему спинному мозгу, которое было пропорциональным силе использованного промотора.121 Авт. продемонстрировали низкий профиль воздействий вне мишени и установили отсутствие побочных явлений спустя 92 дней после инъекции, проложив путь исследованиям на людях в 2020. В этом исследовании два пациента с SOD1-ALS подверглись воздействию посредством i.t. вливания rAAVRh10.mi-SOD1. Первый пациент имел временное улучшение в силе его правой ноги и легкое снижение уровней в CSF SOD1 без др. признаков улучшения, его лечение осложнилось тяжелым meningoradiculitis с сенсорными симптомами. Эти сенсорные симптомы не наблюдались у второго пациента, который подвергался иммуносупрессии во время вливания. При аутопсии уровни SOD1 снижались в спинном мозге пациента 1 по сравнению с не леченными пациентами SOD1 , и нейроны были истощены с обеих сторон в ганглиях дорсальных корешков (DRG) при этом наблюдали инфильтрацию нервных корешков T-лимфоцитами. Пациент 2 сохранял стабильную силу и жизнеспособность в течение описанного 12-мес. периода.122
Токсичность в DRG, наблюдаемая выше в клиническом испытании наблюдалась при использовании AAV9 системно к новорожденным свиньям и ювенильным приматам,123 тогда как NHPs не обнаруживали клинических признаков токсичности. Дальнейший мета-анализ CSF и его системное применение у 33 NHP (в целом из 256 NHPs) выявил токсичность DRG у 83% CSF-обработанных и у32% после системного воздействия на NHPs независимо от серотипа, пола, промотора или трансгена; важно, однако, что патология зависела от дозы и и в целом была умеренной и не наблюдалось клинических осложнений.124 Интересные альтернативные подходы, не связанные с токсичностью DRG, были испытаны с разной степенью успешности. Напр., базирующееся на AAV-Rh10 воздействие miSOD1, описанное выше, как результат приводящее к продолжительности жизни в 50 дней после непосредственной инъекции в язык и внутриплевральное пространство взрослым SOD1G93A мышам до появления симптомов,125 области, слабость которых является ведущей причиной смертности пациентов с ALS. В недавнем исследовании успешно использовали DRG-специфические miRNAs для подавления экспрессии трансгена в этих клетках, сохраняя при этом предполагаемую трансдукцию ЦНС, это эффективная стратегия де-таргетинга, которая может быть использована в любом терапевтическом воздействии на баз AAV.126 Наконец, в одном известном исследовании использован новый subpial метод доставки, с воздействием AAV9-shRNA в узком пространстве между паренхимой спинного мозга и самым внутренним слоем менингиальной оболочки. Авт. достигли долговременной супрессии болезни двигательных нейронов у SOD1G37R мышей, на которых воздействовали до появления симптомов, наблюдалось мощное блокирование прогрессирования болезни у мышей, обработанных после начала болезни. Затем они использовали этот метод доставки у взрослых свиней и NHPs и выявили гомогенную и мощную экспрессию трансгена во всем спинном мозге, включая двигательные нейроны.127 Несмотря на технические затруднения продемонстрирована пригодность для этого крупных модельных животных, это указывает на большие возможности subpial доставки AAV у людей, которые обладают сравнимыми спинальной анатомией и размером.
Первое исследование с использованием CRISPR при ALS опубликовано в 2017. Авт. использовали модифицированный AAV9 для доставки происходящей из Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) и single-guide RNA (sgRNA), нацеленной на ген hSOD1, посредством лицевой вены новорожденным SOD1G93A мышам.128 Они обнаружили богатую экспрессию SaCas9 во всех клетках вентральных рогов спинного мозга, с более чем 2.5-кратным снижением уровней белка SOD1. Обработанные мыши обнаруживали сохранение двигательных нейронов с улучшенной моторной функцией, 37% задержкой начала болезни и 25% увеличением продолжительности жизни, с низкими величинами indel вне мишени трансгенов в спинном мозге.128 Др. группа использовала AAV9-SaCas9-sgRNA для лечения новорожденных OD1G93A мышей посредством i.c.v. инъекций и обнаружили также снижение SOD1 в клетках передних рогов. Это исследование сообщило также о увеличении двигательных нейронов и значительном улучшении моторной функции, а также о заметном 54.6% увеличении продолжительности жизни с низкой величиной indel вне мишени в ожидаемых последовательностях вне мишени.129 В последующем исследовании была придумана intein-обеспечиваемая trans-splicing система для in vivo редактирования одиночных оснований SOD1, чтобы минимизировать потенциальные мутагенные исходы от разрывов двойной нити ДНК. Авт. использовали двойные AAV9 векторы для доставки этой системы i.t. взрослым мышам SOD1G93A до появления симптомов и обнаружили 40% снижение SOD1 включений, что сопровождалось улучшением нейромышечаной функции и мышечной массы, а также 11% увеличение продолжительности жизни,130 несмотря на целенаправленное воздействие преимущественно на астроциты. Эти базирующиеся на CRISPR стратегии обнадеживают.

C9of72


Из-за затруднений целенаправленного воздействия на интроны, на расширения богатых GC повторов131 и вызывания нокдауна в ядре, обнаруживались преимущественно C9orf72-обусловленные фокусы РНК, и базирующиеся на RNAi подходы для C9orf72 были затруднены по сравнению с SOD1. В 2015, группа оказалась способной искусственно создать дуплексные РНК, чтобы преодолеть это узкое горлышко и эффективно воздействовать на мишень смысловых и анти-смысловых расширений G4C2 в клетках фибробластов, происходящих от пациентов с ALS.132 Путем внесения несоответствий (mismatches) в ключевые регионы, они дестабилизировали родительские дуплексы, это позволило проникновение в RISC комплекс, в результате наблюдали 40%-60% снижение фокусов ядерной РНК на обеих нитях. Авт. впоследствии создали однонитчатые молчащие РНК (ss-siRNAs) , которые функционировали подобно ASOs, но обусловливали деградацию посредством RNAi, и было установлено, что это вызывает даже более мощное подавление смысловых и анти-смысловых экспансий G4C2 повторов клетках фибробластов от людей, мутантных по C9orf72.133 Биотех. компания uniQure разработала разные двунаправленные базирующиеся на miRNA подходы, используя, сцепленные miRNA шпильки, нацеленные на C9orf72 (miC), и достигли 50% снижения смысловых и анти-смысловых фокусов ядерной РНК в (G4C2)44-экспрессирующих клетках. Затем они инкорпорировали эти miC конструкции в AAV5 и эффективно замалчивали C9orf72 в нейронах, происходящих из iPSC от FTD пациента.134 В последующем исследовании они использовали конструкции miC для снижения как ядерных, так и цитоплазматических C9orf72 мРНК в полученных от FTD пациентов iPSCs.135 Они затем доставляли свои AAV5-miC конструкции в striatum взрослых трансгенных мышей C9orf72_3 линии 112, линии, обладающей несколькими тандемными копиями человеческих C9orf72 , которые не вызывали нейродегенерации, но обнаруживали фокусы РНК и poly(GP) белка. Они обнаружили 20%-40% снижение C9orf72 мРНК и смысловых интронных транскриптов в трансдуцируемых регионах, хотя мыши не требовали достаточно продолжительного времени для обнаружения снижения poly(GP).135
Проведено немного CRISPR-обеспечиваемых исследований C9orf72, но недавняя проделана работа с использованием CRISPR-Cas9 для генерации делеций в промоторном регионе в iPSCs, происходящих от пациентов с увеличенными участками C9orf72. Они установили, что эти делеции снижают экспрессию C9orf72 варианта, содержащего расширения повторов, это в свою очередь, почти элиминирует продукцию всех дипептидных повторов и заметно снижает дегенерацию аксонов.136 Др. недавнее исследование идентифицировало Ku80 в качестве белка, репарирующего ДНК, который при избыточной экспрессии у Drosophila обнаруживает экспансии G4C2 и в iPSCs, происходящих от C9orf72-ALS пациентов, приводя к преждевременному апоптозу. Авт. использовали CRISPR-Cas9 для снижения Ku80 и обнаружили снижение путей, способствующих апоптозу; они также обнаружили снижение фокусов ядерной РНК после обусловленной CRISPR делеции экспансий G4C2 повторов.137

ATXN2


Кстати, нет публикаций о базирующихся на RNAi или CRISPR подходах, нацеленных на ATXN2. Однако, потенциал для подобных подходов может быть извлечен из родственных исследований в области spinocerebellar ataxia и из вызываемой ASO редукции Atxn2 у мышей, моделирующих SCA2138 и ALS93. Доставка вирусами базирующихся на RNAi подходов продемонстрировала успешность мышиных моделей SCA1,139,140 SCA3,141,142 и SCA7,143 , тогда как подход, базирующийся на CRISPR в iPSCs, полученных от пациентов ранее выявил перспективу для SCA3.144 Кроме того, ASO, RNAi, и базирующихся на CRISPR подходы для spinocerebellar ataxia рассмотрены в др. работе145 и продемонстрировали доступность и перспективность этого подхода, если он адаптирован к целенаправленному воздействию на двигательные нейроны с использованием AAV доставки.

AAV-mediated gene delivery


Наиболее давним применением генной терапии является доставка терапевтического трансгена. В отличие от случаев Zolgensma для SMA, однако, отсутствуют ALS-вызывающие мутации обнаруживающие исключительную потерю функционального механизма, и поэтому доставка терапевтического трансгена сконцентрирована на нейротрофных факторах, обеспечивающих поддержку для дегенерирующих нейронов (Figure 1C). Нейротрофины, как правило, секретируются белками, участвующими в росте или выживании нейронов, и было обнаружено, что некоторые нейротрофины со временем снижаются у пациентов с ALS и у животных моделей,49 это указывает на их потенциальную роль в продлении здоровья нейронов. Хотя эти методы неспецифичны и вряд ли будут лечебными, они привлекательны своим потенциалом для продления выживания при всех формах ALS.
Исследования факторов роста, не связанных с генной терапией 32,146, к сожалению, не увенчались успехом в клинических испытаниях147, что, как полагают, в значительной степени связано с недостаточной доставкой дозы в пораженные участки нервной системы. По этой причине подходы к генной терапии были применены многочисленными группами в целях улучшения доставки и дозирования в ЦНС. Ранние исследования генной терапии с целью нейротрофической поддержки были подробно рассмотрены в других местах.47,49 Здесь мы сосредоточимся на недавних работах, связанных с AAV, большинство из которых было проведено на мышах SOD1G93A. Мы также обсуждаем AAV-опосредованную доставку нетрофических факторов, включая модуляторы нервно-мышечных соединений и методы лечения, направленные на агрегацию.
Внутримышечное введение инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1) с использованием AAV9 было использовано в двух отдельных исследованиях для сохранения спинальных двигательных нейронов и умеренного увеличения продолжительности жизни у мышей SOD1G93A, получавших предсимптомно лечение или в раннем постсимптомном взрослом возрасте.148,149 Аналогичные результаты были получены с использованием системной доставки AAV9-IGF1.150 При другом подходе внутривенная доставка AAV4 использовалась для нацеливания эпендимальных клеток на секрецию IGF1 в CSF у мышей SOD1G93A с ранними симптомами. Авторы обнаружили улучшение двигательной функции и умеренное улучшение выживаемости, 151 эффект, который был немного больше при доставке AAV4-опосредованного фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), который, как предполагается, действует по тому же пути, что и IGF1.152 Доставка как AAV4-IGF 1, так и AAV4-VEGF не дала дополнительной пользы.151VEGF был адаптирован для терапии ALS как на уровне генной терапии, так и на уровне белка.153 Используя внутривенную доставку AAV9, одна группа продемонстрировала, что экспрессия VEGF у взрослых мышей SOD1G93A с симптомами улучшала двигательную функцию и увеличивала выживаемость.154 Когда AAV1 и AAV9 использовались для доставки VEGF в кошачьей модели заболевания нижних двигательных нейронов посредством i.c.v., i.v., или intra-cisterna magna (i.c.m.), только внутривенная доставка приводила к устойчивым высоким уровням экспрессии VEGF в спинном мозге; однако терапевтической пользы не было.155
Хотя ранние исследования AAV-опосредованной доставки нейротрофического фактора глиального происхождения (GDNF) показали многообещающие перспективы, эффекты 156,157 были скромными и наблюдались только после внутримышечной доставки. Исследование 2017 года с более подходящей системной доставкой AAV9-GDNF у предсимптомных крыс SOD1G93A показало умеренное улучшение силы и отсрочку паралича передних конечностей. Однако увеличения выживаемости не наблюдалось, и наблюдались неблагоприятные побочные эффекты, в том числе снижение рабочей памяти, уровня активности и веса.158 Было обнаружено, что другой нейротрофический фактор, гранулоцитарно-колониестимулирующий фактор (G-CSF), сохраняет моторные единицы и увеличивает выживаемость на 10% при доставке взрослым мышам SOD1G93A до появления симптомов с помощью прямой интраспинальной инъекции AAV1.159 Фактор роста гепатоцитов (HGF) также был оценен с использованием i.t. AAV1160 или внутримышечного введения AAV6161 для лечения взрослых мышей SOD1G93A с предсимптомным состоянием, при этом были отмечены незначительные улучшения в силе и выживаемости при использовании обоих методов доставки.
Также были оценены факторы, действующие в нервно-мышечных соединениях, включая внутримышечную доставку AAV1-нейрорегулина для стимулирования коллатерального разрастания и электрофизиологической функции у взрослых мышей SOD1G93A с симптомами. Однако не было никакого влияния на силу или выживаемость.162 Системное введение AAV9, доставляющего ген, кодирующий белок нервно-мышечного соединения DOK7, сохраняло нервно-мышечное соединение, улучшало локомоцию и незначительно увеличивало продолжительность жизни у мышей SOD1G93A с ранними симптомами , не влияя на количество двигательных нейронов.163 Считается, что оксидаза D-аминокислоты (DAO) модулирует эксцитотоксичность, и тем самым доставку AAV9-DAO мышам SOD1G93A с ранними симптомами, приводя к сохранению двигательных нейронов и незначительному увеличению выживаемости.164
Также изучаются факторы, оказывающие прямое влияние на неправильно упакованные белки, связанные с ALS. Например, цитозольный шаперон, фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (MIF), ингибирует неправильное сворачивание мутантного SOD1.165 AAV9-опосредованная экспрессия MIF после прямой интраспинальной доставки неонатальным мышам SOD1G93A или медленно прогрессирующим модельным мышам loxSOD1G37R значительно снизила уровни неправильно упакованного SOD1 в спинном мозге мышей SOD1G93A и улучшила прочность и выживаемость в обеих моделях.166 i.t.доставка AAV1, экспрессирующего моноклональные антитела, нацеленные на неправильно свернутый SOD1, до появления симптомов у взрослых мышей SOD1G93A, привела к заметному увеличению продолжительности жизни на 28%, сопровождающемуся уменьшением неправильно свернутого спинальнгого SOD1 и ослаблением сигналов нейронального стресса и глиоза.167 Аналогичная стратегия была протестирована на мышах с симптомами TDP-43G348C, у которых наблюдается цитоплазматическое накопление TDP-43, а также нарушение памяти. AAV9-опосредованная кортикальная доставка антител, нацеленных на склонную к агрегации область TDP-43, уменьшает протеинопатию TDP-43, когнитивные нарушения, двигательные дефекты и нейровоспаление. 168

Conclusions and perspectives


The ability to provide targeted, sustained treatment gives gene therapy the potential to permanently alter the therapeutic landscape for diseases of the CNS, as it has already done in the case of SMA. ALS in particular is in dire need of impactful, disease-modifying approaches capable of reaching some of the body's most protected regions, the cerebral cortex and the anterior horn cells of the spinal cord, which can increasingly be achieved through minimally invasive means by harnessing the tremendous potential of gene therapy. Once delivered to their target, these therapies can act through knockdown-mediated amelioration of gain-of-function mechanisms or through delivery of protective agents, enabling approaches ranging from targeting a specific ALS-causing mutation to modifying a common pathologic endpoint across sporadic cases. As we continue to hone our delivery methods, vector specificity, and cargo efficacy, there is great hope that truly impactful treatments for ALS will emerge in the near future.