Во второй части важно упомянуть об основных принципах и достижениях генотерапии. Начнем с того, что генная инженерия считается популярной и неоспоримо прогрессирующей областью генетики. В 1980-х годах ученые пытались использовать человеческую ДНК для решения и лечения различных генетических проблем человека [19]. Эта область в целом основана на создании целенаправленного воздействия для получения двуцепочечных разрывов в нужной части хромосомы. Развитие генной инженерии набирает обороты благодаря увеличению количества информации и экспериментов с рестрикционными ферментами и технологий рекомбинантной ДНК. Несмотря на наличие этических проблем, связанных с генной инженерией, в 1981 году было получено первое трансгенное животное (мышь) путем переноса гена кролика в мышь с помощью микроинъекции ДНК, проведенной Томасом Вагнером в Огайо [19]. После этого исследования произошла революция в экспериментах с трансгенными животными. С другой стороны, в 1982 году первый в мире генно-инженерный препарат инсулина (также известный как Humulin) был выпущен на рынок для людей и использовался для лечения пациентов с диабетом I типа [19].

С годами генная инженерия начала развиваться, и появились различные методы редактирования генома. Первым открытым методом редактирования генома была нуклеаза с цинковыми пальчиками (ZNF). ZNFs - это широко используемые гибриды между специально разработанным белком с цинковыми пальчиками Cys2-His2 и расщепляющим доменом эндонуклеазы рестрикции FokI [20]. ZFN функционируют как димеры, и благодаря наличию ДНК-связывающего домена с цинковыми пальчиками, каждый мономер распознает определенную последовательность, обычно от 9 до 18 пар оснований ДНК. Димеризация белка ZFN обеспечивается расщепляющим доменом FokI, который расщепляет ДНК в пределах спейсерной последовательности из 5-7 пар оснований. ZFN обычно состоят из 3-4 доменов цинковых пальцев, и каждый домен состоит почти из 30 аминокислотных остатков, которые расположены в виде ββα мотива. Эти остатки облегчают распознавание ДНК, располагаются в α-спиральном домене и часто взаимодействуют с тремя парами оснований ДНК благодаря перекрыванию с соседним доменом. Существует множество доменов цинковых пальцев, способных распознавать различные виды триплетов ДНК. С многими пальцами белки с цинковые пальчики, способные распознавать широкий спектр последовательностей ДНК, могут быть получены путем слияния этих доменов в тандем с использованием канонического линкерного пептида [20].

Как и во всех других методах редактирования генома, в случае с ZFNs основной проблемой и риском являются внецелевые мутации. Для снижения риска были сделаны некоторые усовершенствования, направленные на повышение специфичности, например, предотвращение нежелательной димеризации расщепляющих доменов FokI. Кроме того, эффективность расщепления FokI была повышена с помощью методов белковой инженерии [20]. В отличие от методов TALEN и CRISPR в ZFNs формирование массивов цинковых пальцев затруднено, поэтому они не считаются очень практичными и гибкими для использования в лабораториях.

Только после изучения бактерий рода Xanthomonas (патогенов, наносящих ущерб сельскому хозяйству) ZFN стали единственным инструментом редактирования генома. Однако через некоторое время появилась разработка TALEN. Бактерии выделяют в цитоплазму растительных клеток эффекторные белки, которые делают растение более восприимчивым к патогену (transcription activator-like effectors, TALEs). Дальнейшие исследования этих эффекторных белков показали, что они могут имитировать эукариотические факторы транскрипции и активировать экспрессию интересующих генов. Белки TALE могут связывать ДНК и состоят из центрального домена, сигнала ядерной локализации и активирующего домена для активации экспрессии генов [21]. ДНК-связывающий домен включает 33-34 аминокислотные последовательности с расхождением в 12-й и 13-й аминокислотах. Эти позиции называются "Repeat Variable Di-residue” (RVD); они демонстрируют изменчивость и имеют сильную корреляцию со специфичностью распознавания нуклеотидов. Неспецифический домен расщепления ДНК эндонуклеазы FokI может быть использован для создания гибридных нуклеаз, которые активны в различных типах клеток. Инженерия TALEN основана на взаимосвязи между распознаванием ДНК связывающим доменом TALE и аминокислотной последовательностью. После сборки компоненты TALEN помещаются в плазмиды, используются для трансфекции клеток мишеней, экспрессии генов и проникают в ядро. Они также могут быть перенесены с мРНК, которые не вызывают геномную интеграцию экспрессируемых генных продуктов [22]. Нуклеазы TALE, называемые TALEN, успешно использовались в редактировании генома предполагаемых мутаций в результате ремонта двухцепочечных разрывов или путем негомологичного соединение концов (NHEJ) или путем гомологично направленной репарации (HDR) у рыбок данио. По сравнению с другими нуклеазами, редактирующими геном, TALEN обладают высокой, сильной специфичностью связывания при репарации двухцепочечных разрывов с помощью NHEJ или HDR. Кроме того, в TALENs меньше ограничений на последовательности, выбираемыми в геноме, из-за сопоставимой мутагенной активности [23].

Самый популярный и предпочтительный на сегодняшний день инструмент редактирования генома, который называется CRISPR Cas9, и получил Нобелевскую премию по химии, присужденную Эммануэлю Шарпантье и Дженнифер Дудна в 2020 году. Фактически, системы CRISPR/Cas9 являются адаптивными иммунными системами прокариот, которые защищают их от вирусов. Основная функция системы - расщепление чужеродных нуклеиновых кислот вирусов у прокариот и предотвращение вирусных инфекций [24]. CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) - короткие повторяющиеся последовательности ДНК, найденные в геномах архей и бактерий. Впервые они были обнаружены в 1987 году японским ученым Йошизуми Ишино в геноме E. coli. К сожалению, функция этих повторяющихся последовательностей не могла быть понята из-за отсутствия данных о последовательности ДНК. Однако в 1993 году J.D. van Embden и его коллеги поняли, что различные штаммы Mycobacterium tuberculosis имеют различные спейсерные последовательности между повторами ДНК. Основываясь на этом, они классифицировали охарактеризованные штаммы Mycobacterium tuberculosis в соответствии со спейсерными последовательностями с помощью spoligotyping. Кроме того, эти спейсерные последовательности были обнаружены в геномах других бактерий и архей, и Francisco Mojica и Ruud Jansen назвали эти последовательности CRISPRs [24].

Прогресс информации и развитие CRISPR-систем произошел с обнаружением Mojica и его коллегами в ходе исследования механизмов адаптации галофильных архей к высокосоленой среде схожих повторяющихся последовательностей у галофильных архей. Исследователи полагали, что эти последовательности играют важную роль в регуляции экспрессии генов и способствуют преобразованию двухцепочечной ДНК из B в Z форму для обеспечения связывания регуляторного белка [25]. С другой стороны, благодаря эффективным машинам, изобретенным в 1990-х годах, секвенирование генома стало доступным, и эти повторяющиеся последовательности были идентифицированы в бактериях и археях. Последовательности были обнаружены почти во всех геномах архей и примерно в половине бактериальных геномов. Также, в свете анализа геномной последовательности, были обнаружены такие свойства CRISPR, как расположение в межгенных регионах, состоящих из коротких повторов с небольшой вариацией, неконсервативное распределение повторов и наличие общей лидерной последовательности, которая располагается с одной стороны кластеризованных повторов [25]. Функция этих повторов стала понятна, когда была обнаружена связь между Cas-генами и повторами. В 2002 году было установлено, что локусы CRISPR тесно связаны с кластером генов, называемых Cas-генами. Эти гены также обнаружены в геномах архей и бактерий рядом с локусами CRISPR. Cas-гены были обнаружены как гены, которые кодируют хеликазы и нуклеазы и могут участвовать в метаболизме ДНК [26]. После этих открытий механизм работы системы CRISPR/Cas у прокариот был хорошо изучен. Белки Cas отвечают за разрезание чужеродной ДНК, найденной у прокариот, на более мелкие фрагменты размером в 20 пар оснований и вставку их в смежные участки ДНК в виде CRISPR. Различные белки Cas после обработки и экспрессии локусов CRISPR создают РНК CRISPR (crRNA). Кроме того, crRNA и tracrRNA могут сливаться вместе, образуя однонаправленную гид РНК (sgRNA).

Благодаря гомологии последовательностей в смежных участках, crRNAs направляют нуклеазу Cas к экзогенному генетическому материалу, который включает видоспецифическую последовательность, известную как protospacer adjacent motif (PAM). Комплекс CRISPR связывает чужеродную ДНК и разрушает ее путем расщепления, спасая прокариот от вируса [27].

Система CRISPR/Cas9 использовалась как для негомологичного соединения концов, так и для гомологичной направленной репарации для создания преобразований генов и специально разработанных мутаций эукариотических клеток благодаря гибкости и простоте применения системы. Например, получение трансгенных мышей было успешно осуществлено с помощью системы CRISPR путем прямого введения sgRNA и мРНК, кодирующих Cas9, в эмбрионы. Семейство генов Cas имеет много членов, и разные белки Cas обладают различными свойствами для использования их в соответствии с требуемыми характеристиками, необходимыми для выбранных организмов [28]. Нуклеазы Cas9 имеют некоторые преимущества по сравнению с ZFNs и TALENs. Эффективность целенаправленного воздействия Cas9 выше, чем у других методов, повторное целенаправленное воздействие и настройка проще, а при использовании комбинации sgRNAs возможно более легкое целенаправленное воздействие и редактирование нескольких локусов в геноме одновременно. Однако нуклеазы Cas9, как и другие нуклеазы, имеют риск индукции внецелевых мутаций, и существуют этические проблемы их использования в геноме человека [28].

Системы CRISPR/Cas все еще пытаются развивать и делать менее рискованными. Совершенствование новых инструментов редактирования генома CRISPR-Cas делает редактирование генома более совершенным. Средства редактирования генома, созданные на основе CRISPR/Cas, можно разделить на 4 группы: нуклеазы, редакторы оснований, транспозазы/рекомбиназы и прайм-редакторы. Каждая из них приносит новые достижения, такие как повышенная специфичность, но также вносит некоторые ограничения [29]. Редакторы оснований включают 2 основных компонента: Cas-фермент для программируемого связывания ДНК и фермент, модифицирующий одноцепочечную ДНК для целенаправленного изменения нуклеотидов. Существует 2 класса, называемые редакторами адениновых оснований и редакторами цитозиновых оснований. Мутации C-T, T-C, A-G и G-A могут быть исправлены с помощью редакторов оснований, и в настоящее время для достижения высокой эффективности разрабатываются системы с двумя редакторами оснований для комбинаторного редактирования в клетках человека [30].

Помимо возможностей нуклеаз Cas и других новых инструментов системы CRISPR Cas, точность редактирования генома пытаются повысить и сделать более эффективной с помощью техники прайм-редактирования, которая выбрана для проекта BeeWare. В отличие от систем CRISPR/Cas, техника прайм-редактирования не основана на двухцепочечных разрывах. Прайм-редакторы используют слияние преобразованной обратной транскриптазы, никазы Cas9 и prime-editing guide RNA (pegRNA). PegRNA отличаются от сгРНК. Они содержат как комплементарные последовательности к сайту мишени, который направляет никазу nCas9, так и дополнительные последовательности, которые вызывают необходимые изменения последовательности [30]. Ссылаясь на механизм прайм-редакторов, первые 5' последовательности pegRNA связываются с областью primer binding site (PBS) на ДНК, обнажая некомплементарную нить. Cas9 делает вырезку на несвязанной ДНК PAM-содержащей нити, и образуется праймер для обратной транскриптазы (RT), связанной с nCas9. Затем нить, содержащая PAM, удлиняется с помощью обратной транскриптазы, используя внутреннюю часть pegRNA в качестве шаблона и модифицируя область мишени программируемым образом. В результате этого шага образуются два ненужные PAM ДНК участка (нечто прихваченное одним концом (flaps)), называемые отредактированной 3' flap (створкой), которая была обратно транскрибирована с помощью pegRNA, и оригинальной нередактированной 5' flap. Как правило, 5' лоскуты (flaps) благоприятно разрушаются клеточными эндонуклеазами, которые повсеместно распространены во время синтеза ДНК на отстающей нити. Наконец, полученный гетеродуплекс, включающий оригинальную (неотредактированную) нить и отредактированный 3' flap, разрешается и интегрируется в геном хозяина посредством клеточной репликации и процесса репарации в стабильной манере [31].

Сегодня многие заболевания, особенно редкие генетические заболевания, можно лечить с помощью технологии прайм-редактирования. Например, исследование прайм-редактирования мутации, вызывающей SCD и болезнь Тей-Сакса, показало, что максимальная и оптимизированная коррекция составила 58%, а возникновение indels - 1,4% для SCD. С другой стороны, исследование для болезни Тей-Сакса дало 33% эффективности и 0,32% indels при использовании устройства PE3b [31]. Тем не менее, исследования методов редактирования праймеров продолжаются, а информация и испытания совершенствуются. Предполагается, что в будущем большинство генетических заболеваний исчезнет с помощью праймеров.

In order to perform prime editing with the PE2 system, 2 plasmids are required for the components of PE2. A plasmid to generate pegRNAs and another plasmid for the Cas9 enzyme. For this purpose, a plasmid was designed in a way that it can contain 2 pegRNAs. The other plasmid is planned to contain Cas9 (H840A). The plasmid that contains Cas9 (H840A) is pCMV-PE2, which will be ordered from David Liu's lab (Addgene plasmid # 132775) (seen in Figure 5). For pegRNAs, pU6-pegRNA-GG-acceptor plasmid will be ordered from David Liu's lab (Addgene plasmid # 132777) as it is also seen in Figure 6 [35]. Oligos to ligation clone the pegRNA into Addgene #132777 are shown in Figure 7.

Cloning will be performed according to the described protocols of the plasmids [35]. First of all, pU6-pegRNA-GG- Vector plasmid will be digested with BsaI and the origin of replication, U6 promoter, U6 poly-T termination sequence, and AmpR gene containing fragments of the plasmid will be isolated. These ingredients will be combined in a PCR tube and will be incubated at 37 °C for 4-16 hours, to isolate approximately 2.2-kb fragment:

Afterward, oligonucleotide parts will be ordered and annealed. Oligonucleotides will be ordered from Integrated DNA Technologies. Annealing buffer will be prepared by using H2O complemented with 10 mM Tris-Cl pH 8.5 and 50 mM NaCl. These ingredients will be combined in a PCR tube, will be heated in a thermocycler at 95 °C for 3 minutes then cooled down to 22 °C:

For pegRNA assembly, Golden Gate reaction will be followed. Following reactants will be incubated at room temperature for 10 minutes or cycled between 5 minutes at 16 ?C and 5 minutes at 37 ^oC for 8 cycles:

Figure 8: Diagram pegRNA cloning by Golden gate assembly [35].

The open scheme of the plasmid planned for the review with the pegRNAs assembled can be seen in Figure 9. Figure 9: Open scheme of plasmid with pegRNAs added

Следующим основным вопросом проекта является поиск эффективного способа переноса сгенерированных плазмид в интересующие клетки. Для того чтобы эффективно осуществить такие подходы, важно использовать определенную технику для каждого этапа проекта. Для начала нашего проекта мы будем использовать клетки культур; точнее, фибробласты. Предполагается, что это будет достигнуто путем биопсии кожи у добровольных пациентов в Турции, которые являются носителями точных мутаций, на которые нацелен наш проект. Поскольку это будет процедура in vitro, согласно литературным данным, плазмида может быть легко трансфецирована такими способами, как электропорация, нуклеофекция или даже липофектамин-опосредованная трансфекция (на основе липидов) [38]. Однако в нашем проекте предполагается использовать только невирусный вектор/липосомальный подход как на стадии in vitro, так и in vivo. Несмотря на то, что вирусный вектор может быть правильным выбором для системы CRISPR/Cas9, при рассмотрении особых условий муковисцидоза преимущество отдается использованию невирусных векторов, а точнее липосом. В нашем проекте предполагается одновременная трансфекция двух плазмид в интересующие нас мишени. Это означает, что нам необходимо найти тип липосомы, размер которой будет достаточно велик для одновременной трансфекции всех двух плазмид. На втором этапе нашей работы мы будем работать с in vivo применением генотерапии, сначала на хорьках, а затем на людях. Предполагается, что доставка через носовой эпителий будет первым путем доставки катионных липосом и, возможно, с помощью небулайзера. Легкость процедуры доставки генов в случае муковисцидоза заключается в том, что это заболевание считается моногенным, а это означает, что только воздействие на легкие приведет к значительному улучшению состояния и возможному излечению от болезни.

При рассмотрении катионных липидов в качестве средств доставки мы остановились на липидах на основе холестерина, которые, как было установлено, также содержат полиамид и/или эфирную связь в своей структуре. Для того чтобы сохранить нуклеиновые кислоты плазмид от деградации, мы можем использовать невирусные пути. Они легко синтезируются, считаются безопасными инструментами и, как известно, вызывают лишь слабый иммунный ответ [41]. В случае муковисцидоза, принимая во внимание уже имеющееся воспаление в легких и многие другие факторы, внедрение липосом может рассматриваться как наиболее эффективный путь.

Предполагается, что катионный липид имеет в своей структуре гидрофобный домен, связанный с катионной головной группой [41]. Катион будет той частью липосомы, которая отвечает за перенос ДНК. Поскольку предполагается, что плазмидная ДНК имеет отрицательный заряд, ожидается, что взаимодействие на основе заряда будет происходить с аминами, расположенными в катионной части липосомы. В идеале, первичные аминные головные группы, связывающиеся с ДНК, будут наиболее эффективными среди всех, поскольку они имеют более сильный положительный заряд по сравнению с другими [41]. Кроме того, для повышения эффективности предполагается, что в состав липосомы будет входить холестериновая основа, содержащая эфирную связь, и это также при учете низкой токсичности холестерина по сравнению с другими соединениями [42]. Зная, какой невирусный вектор будет использоваться в эксперименте, остается только вопрос размера.

DOTAP/DOPE - это коммерческая катионная липосома, которая считается довольно эффективной в плане трансфекции. Соотношение между DOTAP/DOPE должно быть проверено с точки зрения размера и эффективности трансфекции. Нам необходимо иметь соответствующее распределение размеров и дзета-потенциал, чтобы обе плазмиды поместились в структуру [42]. Сначала созданные плазмиды из предыдущего раздела амплифицируются в лабораторных штаммах E. coli, и как только будет достигнуто желаемое количество плазмид, ДНК очищается [43]. Протокол приготовления предполагает соблюдение соотношения 1 мкг ДНК на 10 мкг липидов. Такое простое соотношение позволяет даже поместить более одной плазмиды/плазмиды большого размера; и так же просто образовавшийся катионный липид становится готовым к трансфекции. В случае трансфекции фибробластов in vitro достаточно дважды промыть липосомный препарат, а затем обработать его HEPES-буферным солевым раствором. Интересующие клетки, в нашем случае фибробласты, инкубируются вместе с буферным раствором и сформированными липосомами [44].

В этом случае предполагается распыление образовавшихся липосом, чтобы плазмиды попали в легкие через ингаляцию и легко обеспечили лечение генетического заболевания. Данные литературы по-прежнему показывают, что, несмотря на то, что липосомы потенциально могут повредить свои внутренние плазмиды при прохождении процедуры небулизации, комплексы на основе DOPE остаются наиболее стабильными среди всех структур [44]. При рассмотрении доставки лекарств в легкие необходимо учитывать три основных момента: анатомию самих легких, которые являются естественным защитным механизмом, патологический барьер, который в случае пациентов с муковисцидозом действительно выражен и находится в состоянии почти хронической инфекции, и иммунологический барьер, базирующийся в основном на действии макрофагов [45]. Кроме того, предлагается, чтобы ингалируемая липосомная формула была по крайней мере меньше 5-6 мкм и имела регулируемую FPF (фракцию мелких частиц), чтобы она могла безопасно достигать бронхиол и альвеол [45].

Процесс небулизации (распыления) может быть осуществлен с помощью различных ингаляторов, таких как дозированные ингаляторы под давлением, ингаляторы сухого порошка, медицинские небулайзеры и т.д. [46]. В исследовании, проведенном в 2015 году и посвященном генной терапии муковисцидоза путем небулизации гена CFTR, вводимого с помощью невирусных векторов, использовался Trudell Aero-Eclipse II для создания дозы назального спрея для пациентов с CF. [47].

Для того чтобы проект полностью прошел все возможные испытания, тестирование генотерапии должно проводиться как в системах in vivo, так и ex vivo. В данном эксперименте было решено использовать хорька, поскольку он лучше, чем мышь, отражает муковисцидоз, поскольку аминокислотная идентичность CFTR хорька на 92% сходна с человеческой, и хорьки и люди имеют общие все основные типы клеток в дыхательных путях, включая базальные клетки, реснитчатые клетки, бокаловидные клетки и промежуточные клетки, а также распределение подслизистых артерий [48][49]. Например, у людей и хорьков консерватизм белков значительно выше, чем у людей и мышей, для нескольких классов белков, которые потенциально важны для пневмонии и ремоделирования [48].

Подслизистые железы хрящевых дыхательных путей человека и хорька экспрессируют очень высокие уровни мРНК и белка CFTR [49] Это сходство является важной концептуальной особенностью, которая выбирает этот вид в качестве модели МВ. У хорька с CF суммируются почти все фенотипы, наблюдаемые у пациентов человека, от воспалительных и инфекционных заболеваний легких до диабета, связанного с CF. Кроме того, поскольку хорек имеет период беременности 42 дня и достигает половой зрелости в 4-6 месяцев, он имеет очевидные преимущества для моделирования животных по сравнению с более крупными видами [50].

Поскольку создание хорьков с CF со всеми 3 мутациями, над которыми мы будем работать, требует много времени и ресурсов, место, которое мы будем использовать для получения хорьков с CF с нужными нам мутациями, - это Национальный центр ресурсов и исследований хорьков. (https://medicine.uiowa.edu/nfrc/services).

Благодаря услугам этого сайта, специализирующегося на генерации генетических моделей хорьков, мы сократим время наших экспериментов. Но в случае затруднений у нас также будет запасной план по созданию собственных нокаутных хорьков CF [48]. Недавно для получения нокаутных хорьков была использована система CRISPR/Cas9. Если нокаутные хорьки не будут получены из упомянутого выше учреждения, будет использован этот метод [48]. Будет использован нехирургический метод сбора и переноса эмбрионов, успешно проведенный в Корнельском университете [50].

Метод, который будет использоваться для создания желаемой мутации, - это система CRISPR/Cas9. После выбора sgRNAs, подходящих для трех мутаций (F508, G542X и R553X), которые необходимо создать, мРНК Cas9 и sgRNAs будут введены в собранные яйцеклетки на стадии одной клетки. Затем зиготы, инъецированные системой CRISPR, будут перенесены к суррогатным матерям нехирургическим методом [48][51].

После рождения геномные ДНК из плаценты и хвоста будут выделены и будут проверены на геномные модификации мишени и регионы вокруг гена CFTR методом ПЦР-амплификации [52]. Будкт определено наличие и синтез функционального белка CFTR с помощью метода иммунодетекции[53]. Существует 4 типа ELISA, которые могут использоваться как для обнаружения присутствия молекул, так и для определения их концентрации. ELISA включает в себя 2 основных варианта [53]. Организация ELISA требует множества этапов. Наиболее важным этапом для обнаружения с помощью ELISA является взаимодействие антигена и антитела [53] ELISA является предпочтительным, поскольку он имеет такие преимущества, как простота процедуры, высокая специфичность, безопасность и экологичность, высокая эффективность, возможность проводить обнаружение при меньших затратах, а также возможность проведения без радиоактивных веществ и большого количества органических растворителей. С другой стороны, этот метод имеет и недостатки, такие как сложность и высокая стоимость приготовления антител, необходимость использования дорогих культуральных сред и применение сложных методик, нестабильность антител, необходимость хранения и охлаждения антитела, а также высокая вероятность получения ложноположительных или отрицательных результатов [55].

Вестерн-блоттинг - важная процедура в молекулярной биологии для идентификации и выделения специфически определенного белка из смеси сложных белков, взятых из клеток. Для идентификации вестерн-блоттинг состоит из трех этапов: разделение в зависимости от размера, перенос на твердую основу, маркировка целевого белка с помощью соответствующих первичных и вторичных антител для визуализации [56]. Вестерн-блоттинг используется как для оценки размера целевого белка, так и для измерения экспрессии целевого белка. Вначале на мембрану наносятся все полосы белка, обнаруженные в геле ранее. Затем на мембрану наносят блокирующую обработку для предотвращения неспецифических реакций. После этого проводится инкубация мембраны с первичным антителом, которое специфически связывается с интересующим белком. Затем проводится отмывка от несвязанных первичных антител и вторая инкубация мембраны со вторым антителом, которое специфически распознает первичные антитела. Имеется ряд ограничений, поскольку он возможен только при наличии первичного антитела, специфичного для интересующего белка, высокая стоимость антител, внецелевые эффекты из-за взаимодействия антитела с другими белками, кроме целевого, Таким образом, для проведения идеального и корректного вестерн-блоттинга важно качество первичного антитела, выбор подходящего стандарта нормализации, предотвращение насыщения сигнала и точное количественное определение интенсивности сигнала интересующего белка, а также определение линейного диапазона для антител, связанных с белком мишенью. [58].

Проточная цитометрия уже несколько десятилетий используется в биологических областях для измерения экспрессии белков. Проточная цитометрия - это метод на основе антител, позволяющий идентифицировать белки, которые экспрессируются на поверхности клеток, а также в цитоплазме. Проточная цитометрия является полезным и наиболее подходящим методом для анализа конкретного, заинтересовавшего типа клеток, обнаруженных в гетерогенной популяции, и может быть использована для идентификации клеток, которые отвечают на некоторые виды лечения на основе экспрессии соответствующего рецептора [59] Кроме того, многоцветная проточная цитометрия позволяет измерять несколько белков параллельно, независимо от длины белка. Проточный цитометр - это мощный метод, позволяющий избавиться от проблем, возникающих при ELISA и Вестерн-блоттинге. Проточная цитометрия требует меньших затрат, меньше времени на обработку и меньше требований к количеству вводимых клеток по сравнению с вестерн-блоттингом. Кроме того, проточная цитометрия показывает лучшую корреляцию по сравнению с ELISA, поскольку включает антитела, обладающие защитной нейтрализующей активностью [60].

Общий принцип проточной цитометрии можно резюмировать как разделение образца через узкий поток жидкости путем пропускания через лазер, что позволяет обнаружить размер, зернистость и флуоресцентные свойства каждой клетки или особенно клеток, найденных в образце [61] Сначала требуемый флуоресцентно меченый образец подключается к проточному цитометру, и частицы образца направляются путем гидродинамической фокусировки в тонкий поток, окруженный жидкостью с более высокой скоростью. Лазерный луч ориентируется на поток жидкости и разное количество детекторов направляется в одну точку с лучом лазера. Детекторы воспринимают комбинацию рассеянного света и флуоресцентного света, исходящего от химических веществ, находящихся внутри частицы. Оценка колебаний яркости для каждого детектора дает информацию о физико-химической структуре и свойствах каждой частицы [61]. Проточный цитометр имеет такие преимущества, как быстрота и количественность, многопараметричность, высокая точность и высокая специфичность, идентификация жизнеспособных и мертвых клеток. С другой стороны, этот метод имеет недостатки, такие как техническая сложность, отсутствие визуального подтверждения специфичности клеток и ограниченная чувствительность [62]. Учитывая недостатки и преимущества трех методов, проточная цитометрия была выбрана для обнаружения экспрессии белка CFTR в нашем проекте из-за надежности, простоты, более высокой корреляции и низкой стоимости. Это лучший выбор для обнаружения белка CFTR при муковисцидозе, который используется для эпителиальных клеток носа и лейкоцитов, чтобы обнаружить экспрессию белка CFTR с помощью проточной цитометрии.

Взяв клетки эпителия носа от больных муковисцидозом и здоровых пациентов и проведя непрямое окрашивание с использованием изотип-специфических вторичных антител путем сочетания mIgG1 анти-пан-цитокератина с не-mIgG1 CFTR mAbs и mIgG2a анти-Е кадхерина с CFTR-специфическими mIgG1 mAbs, можно проанализировать характер окрашивания. Для этого клетки назального эпителия собирают в DMEM и центрифугируют при 800xg в течение 5 мин, при 4°C. Затем, для получения одноклеточной суспензии, их ресуспендируют в PBS и EDTA 5 мМ в течение 15 мин и фильтруют через чашку Filcons 50 мкм. Наконец, проводится подсчет клеток методом проточной цитометрии с использованием бусинок flow-count. В данной экспериментальной процедуре используются CFTR-специфические антитела в виде моноклонального антитела (mAb) 24-1 (мышиный IgG2a), mAb L12B4 (mIgG2a) и mAb M3A7 (mIgG1), mAb 217, 432, 450 и 570 (mIgG1) 596 (mIgG2b) и 769 mAb (mIgG1), mIgG1 mAb anti pan-Cytokeratin , mAb mIgG2a anti-E cadherin получены и использованы [63].

Опять же, с этической точки зрения, вторым вариантом обнаружения экспрессии CFTR является взятие лейкоцитов у пациентов с муковисцидозом и здоровых людей. Это определение основано на взятии определенных количеств периферической цельной крови у пациентов и здоровых добровольцев и инкубации со специфическими флуоресцентными зондами, распознающими белок CFTR, экспрессированный на плазматической мембране лейкоцитов. Иммунопреципитация белка в этой экспериментальной процедуре может быть проведена с помощью кроличьих антител и сефарозы Protein G. Кроме того, лизис эритроцитов, центрифугирование образца и инкубация с мышиным антителом против CD14, конъюгированным с тандемным флуорофорами PE-Cy7 (λnm = 488ex/>750em) или с флуорохромом аллофикоцианина (λnm = 635ex/670em), а также промывка и фиксация клеток - другие необходимые разделы этой экспериментальной процедуры [64].

Как показано в других исследованиях, для проведения процедуры проточной цитометрии можно использовать как клетки эпителия носа, так и лейкоциты. Сначала предполагалось взять клетки носового эпителия у пациентов, имеющих желаемые мутации Fdel508&G542X и R553X после проведения генотерапии. В то же время, будут взяты клетки носового эпителия у здоровых добровольцев, и после экспериментальной процедуры - о которой говорилось выше - результаты были бы сравнены, и можно было бы понять эффективность генотерапии. Вторая часть состоит из применения анализа экспрессии CFTR с помощью проточной цитометрии с использованием лейкоцитов в соответствии с экспериментальной процедурой, которая была описана ранее. Сначала у пациентов с мутациями Fdel508&G542X и R553X после проведения генотерапии берется периферическая кровь, и результаты экспрессии сравниваются с другими здоровыми людьми, чтобы понять, насколько она эффективна. Наконец, мы подумали о сравнении результатов, полученных с клетками эпителия носа и лейкоцитами, чтобы убедиться в эффективности нашей генотерапии.

Редактирование праймеров будет осуществляться путем целенаправленного воздействия на fdel508, G542X и R553X путем конструирования 2 PegRNAs для 3 мутаций муковисцидоза. PegRNAs будут выбраны с более высоким содержанием G-C и более низкими относительными показателями вырезок (nick). Для доставки плазмид будут использованы липосомы благодаря их преимуществам по вместимости и меньшему иммунному ответу. Поскольку имеются данные о безопасности клинических испытаний in vivo без серьезных побочных эффектов, хотя эффективность доставки низкая, мы планируем провести испытания ex vivo и на животных с использованием липидов. Для проверки и эффективности будут проведены секвенирование Сэнгера и секвенирование следующего поколения. Фибробласт - это клеточная линия проекта, которая используется на этапе эксперимента ex vivo. Хорек будет животной моделью на следующих этапах, так как симптомы нокаутного хорька совпадают с симптомами пациентов в большей степени. Для проверки экспрессии белка CFTR на последнем этапе выбран метод иммунодетекции - проточная цитометрия.