Посещений:
ДИАГНОСТИКА И ТЕРАПИЯ COVID-19



Редактирование генов и RNAi

Gene editing and RNAi approaches for COVID-19 diagnostics and therapeutics
• Burak Berber, • Cihan Aydin, • Fatih Kocabas,et al.
Gene Therapy volume 28, pages290–305 (2021)





Основные моменты


  • SARS-CoV-2 - это РНК-вирус, на который можно целенаправленно воздействовать и диагностировать с помощью новых CRISPR-подходов.
  • В ответ на пандемию SARS-CoV-2 может быть разработана АСО-терапия, направленная на транскрипт, кодирующий вирусный белок или саму геномную РНК.
  • Антисмысловые пептидные нуклеиновые кислоты, обладающие значительным потенциалом в качестве противовирусных агентов, являются важными терапевтическими кандидатами, которые могут быть нацелены на РНК SARS-CoV-2 с высоким сродством к гибридизации и стабильностью.
  • Хотя технологии рибозимов и аптамеров относительно более старые, чем другие технологии редактирования генов, они все еще являются прекрасными кандидатами в борьбе с пандемией COVID-19 благодаря своей высокой специфичности и низкой токсичности, кроме того, аптамеры обладают высокой воспроизводимостью.
  • siRNAs, нацеленные на структурные или неструктурные белки SARS-CoV-2, могут подавлять сборку и репликацию SARS-CoV-2.

    Introduction to the basic structure of SARS-CoV-2 to understand the potential targets for the novel diagnostic and therapeutic approaches


    Коронавирусы имеют высокую распространенность и широко распределены по всему миру. Они обладают широким генетическим разнообразием благодаря своим геномам на основе РНК с высокой частотой мутаций. Учитывая повторяющиеся [1-11] вспышки, вполне вероятно, что новые коронавирусы будут периодически появляться у людей [12, 13]. Последняя коронавирусная пандемия, получившая позднее название "Коронавирусная болезнь 2019" (COVID-19), вызвана коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома 2, а именно SARS-CoV-2 [14]. SARS-CoV-2 имеет геном из 29 903 оснований одноцепочечной РНК (штамм SARS-CoV-2 Wuhan Hu-1. Accession: NC_045512), кодирующий несколько структурных и неструктурных белков (nsps) [15, 16]. В то время как SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2 могут вызывать тяжелые заболевания, HKU1, NL63, OC43 и 229E ассоциируются с легкими симптомами [17]. SARS-CoV-2 имеет несегментированный РНК геном, который кодирует четыре основных структурных белка вирионов: нуклеокапсидный (N) белок, трансмембранный (M) белок, оболочечный (E) белок и шипиковый (S) белок [18-20]. Белок N принимает участие в репликации вирусной РНК и клеточном ответе хозяина на вирусную инфекцию [21]. Гликопротеин S является мембранным гликопротеином 1 типа с различными функциональными доменами, включая амино (S1) и карбокси (S2) концы. В то время как субъединица S2 является трансмембранным белком, опосредующим слияние вирусной и клеточной мембран, субъединица S1 связана с функциями связывания рецепторов [21, 22]. Белок M вируса SARS-CoV-2 играет центральную роль в сборке вируса, превращая вирус и факторы хозяина в новые вирионы на клеточных мембранах [23]. В то время как белок E локализован в ER, Golgi и промежуточном компартменте ER-Golgi, что связано со сборкой и почкованием SARS-CoV-2 в месте внутриклеточной транспортировки [18]. nsps и структурные белки, которые являются стержнем патофизиологии и механизмов вирулентности SARS-CoV-2, являются потенциальными мишенями для новых инструментов молекулярной биологии, включая CRISPR-Cas, антисмысловые олигонуклеотиды (ASO), пептиды нуклеиновых кислот (PNAs), рибозимы и siRNA. В этом обзоре мы обсудим важные молекулярно-биологические подходы, которые могут быть использованы в диагностике SARS-CoV-2 и терапии против инфекции COVID-19 высокоспецифичным, стабильным и эффективным способом.

    CRISPR-Cas diagnosis and therapeutic tools for SARS-CoV-2 infection


    Системы CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas (CRISPR-associated) улучшили нашу способность редактировать гены и модулировать экспрессию генов. Этот механизм естественным образом защищает бактерии от вторжения бактериофагов и других чужеродных нуклеиновых кислот [24]. Нацеленные на ДНК эффекторы, такие как Cas9, обеспечивают защиту от ДНК-бактериофагов, а нацеленная на РНК активность эффекторов III и VI типа обеспечивает защиту от РНК-патогенов. Это позволяет предположить, что эффекторы CRISPR могут быть перепрограммированы, чтобы помочь клеткам млекопитающих защищаться как от ДНК-, так и от РНК-вирусов. Действительно, недавнее использование Cas9 показали, что эффекторы CRISPR могут подавлять репликацию двухцепочечных ДНК-вирусов или одноцепочечных РНК-вирусов (ssRNA) с ДНК-посредниками в клетках млекопитающих [24-31]. Кроме того, многие ssRNA-вирусы являются патогенами человека и не имеют одобренных Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) методов лечения [32], это подчеркивает необходимость разработки новых противовирусных стратегий. Недавно охарактеризованные РНК- и ДНК-мишени ортологи Cas9 с меньшей вероятностью смогут решить эти проблемы, поскольку они обладают низкой эффективностью расщепления РНК и могут стимулировать действие вне мишени на клеточную ДНК [27, 33]. CRISPR-системы чрезвычайно разнообразны с точки зрения разнообразия Protospacer Adjacent Motif (PAM), а также количества и типа Cas-белков. CRISPR-Cas механизмы с регионом CRISPR и содержимым Cas генов подразделяются на три основных типа (I, II и III) и 11 подтипов (I-A - I-F, II-A - II-C и III-A - III-B) [34]. Приспособление типа II является наиболее изученным, а механизм - наиболее освещенным среди этих систем. Основной механизм системы CRISPR-Cas9 начинается с попадания чужеродного вируса или плазмидной ДНК в клетку млекопитающего. Инородные нуклеотиды идентифицируются с помощью Cas complex, разделяются на фрагменты длиной ~30 пар оснований, и эти фрагменты вставляются в последовательность CRISPR. Эта последовательность состоит из небольших фрагментов чужеродной вирусной или плазмидной ДНК, с которыми он ранее сталкивался. Чужеродная олиго-ДНК с последовательностью PAM может быть вставлена в направляющую РНК в центре с повторяющимися генами. Белки Cas специфичны и обрабатывают окрестности CRISPR для производства CRISPR РНК (crRNAs). В системе типа II некодирующая РНК, трансактивирующая crRNA, действует как каркас, который связывает crRNAs с Cas9 и помогает преобразованию предшественников crRNAs, созданных из последовательностей CRISPR, в зрелые crRNAs. Используя коллекционную гомологию, эти crRNAs направляют нуклеазу Cas к диагностируемой границе экзогенной генетической ткани, следующей за PAM вида, и разбивают участок ДНК мишени на фрагменты для формирования инсерционно-делеционной мутации [35-38]. Была выдвинута гипотеза, что это увлечение также может быть частью пути запрограммированной гибели клеток у бактерий, позволяя клеткам совершать клеточное самоубийство или впадать в состояние покоя, если они не преодолеют инфекцию. К счастью, побочная активность не обнаруживается в клетках млекопитающих и растений, что позволяет разрабатывать множество программ РНК-таргетинга с использованием Cas13. Кроме того, было создано множество программ с использованием Cas13 в клетках млекопитающих: нокдаун транскриптов, визуализация транскриптов в живых клетках [39] и редактирование оснований РНК [40]. В то время как Cas13a вызвала определенный интерес к нокдауну РНК, некоторые ортологи Cas13b оказались более стабильными и сильными в клетках млекопитающих для нокдауна и редактирования РНК. Совсем недавно были обнаружены дополнительные ортологи Cas13, а также Cas13d, который был использован для зеленого и сильного нокдауна многих эндогенных транскриптов [41]. Konermann et al. также подтвердили, что Cas13d может быть использован для модуляции сплайсинга эндогенных транскриптов и что кодирующая коллекция для Cas13d достаточно мала, чтобы вписаться в пределы ёмкости упаковки AAV для доставки in vivo [41].
    Нацеленные на РНК эффекторы CRISPR могут стать перспективным противовирусным подходом в будущем. Недавние исследования CRISPR-эффектора Cas13 класса 2 типа VI показали его способность эффективно целенаправленно воздействовать на РНК и расщеплять ее в нескольких модельных системах, включая клетки млекопитающих [39-46]. Более того, Cas13 может преобразовывать свой CRISPR массив и выпускать индивидуальные crRNA [47], что позволяет применять мультиплексное целенаправленное воздействие. Помимо активности по преобразованию массива CRISPR, Cas13 обладает второстепенной активностью по разрезанию, которая была использована для диагностических целей, в качестве specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking (SHERLOCK) подхода [8, 48, 49]. Более того, различные ортологи Cas13 оказывают минимальное внецелевое воздействие на транскриптом хозяина, как было установлено в нескольких недавних исследованиях на клетках млекопитающих [39-42]. Это позволяет предположить, что нуклеаза Cas13 может быть запрограммирована на поражение и уничтожение широкого спектра вирусов млекопитающих и может быть полезна в качестве новой противовирусной платформы.

    Recent advances in CRISPR diagnostic toolbox


    Хотя CRISPR приобрел популярность как инструмент редактирования генома, его диагностический потенциал также был замечен исследователями. За последние несколько лет функциональность CRISPR проявилась как инструмента поиска местоположения, а не как инструмент расщепления конкретного участка. Cas12a (специфичная для ДНК) и Cas13 (работает с РНК) - две особенно популярные нуклеазы в CRISPR-диагностике. Частично их механизм напоминает механизм Cas9 - направляющая гид РНК, комплементарная последовательности мишени, необходима для специфического связывания, а нуклеаза Cas12a/Cas13a разрезает в этом месте ДНК. Удивительной особенностью нуклеаз Cas12 и Cas13 является то, что они проявляют свою режущую активность транс- или коллатеральном положении . Найдя мишень, нуклеазы будут разрезать и другие молекулы нуклеиновой кислоты вне мишени в близлежащей области. Это свойство используется для создания репортерных систем для визуального считывания данных в CRISPR. диагностике.

    CRISPR-Cas13 diagnostic


    В 2017 году группа Feng Zhang объявила о создании первого метода обнаружения нуклеиновых кислот на основе CRISPR под названием SHERLOCK [50]. Этот метод позволяет мультиплексно, портативно и сверхчувствительно обнаруживать РНК или ДНК в клинически значимых образцах. SHERLOCK анализирует рекомбиназа-опосредованную полимеразную предварительную амплификацию ДНК или РНК и последующую Cas13- или Cas12-опосредованную детекцию с помощью флуоресцентных и колориметрических показаний, которые дают результаты менее чем за 1 час при времени установки <15 минут. SHERLOCK анализирует опосредованную рекомбиназой полимеразную пре-амплификацию ДНК или РНК и последующую Cas13- или Cas12-опосредованную детекцию с помощью флуоресцентных и колориметрических считывающих устройств, которые позволяют получить результаты менее чем за 1 ч при времени настройки менее 15 мин. Протоколы исследования SHERLOCK с открытым доступом и дизайнерские ресурсы для SARS-CoV-2 используют CRISPR-Cas13. Ферменты Cas13 относятся к программируемым РНК-направляемым ферментам CRISPR типа VI с нуклеазной активностью. Ферменты Cas13 могут нацелены на ген и вырубать (knockdown) его без редактирования генома, что делает их потенциальным терапевтическим средством для вмешательства в экспрессию генов без необратимого изменения последовательности генома.
    Недавняя вспышка коронавируса (COVID-19) представляет огромные проблемы для глобального здравоохранения. Zhang и др. разработали протокол исследования вместе с диагностикой на основе CRISPR-Cas13 для SARS-CoV-2 [51]. Аналогичным образом, Metsky et al. разработали инструмент для создания анализа и метод исследования для специфической детекции SARS-CoV-2 и 66 родственных вирусов, как описано в препринте bioRxiv [51].
    Описанные методы исследования обеспечивают базовую основу для создания тестов COVID-19 на основе системы SHERLOCK с использованием бумажных полосок. Система SHERLOCK основана на CRISPR-Cas13 и может специфически обнаруживать различные РНК-вирусы в образцах пациентов. Система ищет уникальные последовательности нуклеиновых кислот и использует тест-полоску, напоминающую тест на беременность, для визуального считывания информации. При проведении простого теста с бумажной полоской вместе с подготовленным образцом на полоске появляется линия, определяющая наличие или отсутствие вируса. Для этого они разработали и проанализировали две РНК-направляющие, распознающие две сигнатуры COVID-19, используя синтетические фрагменты РНК SARS-CoV-2. Благодаря рибопротеиновому комплексу CRISPR-Cas13, образующему систему SHERLOCK, удалось обнаружить присутствие вирусной РНК SARS-CoV-2 в образце пациента с COVID-19 [8, 50, 52]. Можно использовать образцы РНК, выделенные для текущих тестов qPCR. В своем недавнем методе Zhang et al. [52] в качестве тестов положительного контроля использовали два гена, S-ген и Orf1ab, специфичные для генома COVID-19, а также синтетические фрагменты РНК вируса COVID-19 [52].

    The SHERLOCK COVID-19 virus detection method involves two major steps:


    1. (1) Для амплификации синтетической вирусной РНК используется технология рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA), за которой следует транскрипция in vitro амплифицированной ДНК обратно в РНК, 2. (2) Cas13 РНК-детекция и crRNA целенаправленно воздействуют на специфические последовательности. Визуальное считывание цвета с помощью коммерчески доступного бумажного щупа фиксирует расщепленную репортерную РНК с мечеными концами на специфических полосах антител. Исследование показало, что SHERLOCK может обнаруживать последовательности мишени РНК коронавируса с чувствительностью 10-100 копий/мкл образца пациента [52]. Это позволяет предположить, что РНК, очищенная из назальных образцов пациентов, может быть проанализирована на наличие COVID-19 менее чем за 1 ч без специального оборудования.
    Sabeti et al. разработали веб-платформу, позволяющую проводить анализы на основе CRISPR-Cas13 для идентификации 67 вирусов, включая SARS-CoV-2 и родственные респираторные вирусы, причем пользователи могут выбирать одну или мультиплексные панели [51]. Каждый из этих анализов должен быть (1) всеобъемлющим по геномному разнообразию за счет учета большой доли известного разнообразия последовательностей (в основном более 97 процентов), (2) предсказанным моделью машинного обучения, чтобы иметь большую активность обнаружения для всего целевого геномного разнообразия, и (3) оцененным как обладающий высокой точностью в отношении мишени, чтобы их можно было сгруппировать в панели, которые являются целевыми [51].
    Исследователи также разместили препринт в bioRxiv с подробным описанием этих инструментов, сосредоточившись на SHERLOCK SARS-CoV-2 [51]. Они проверили тест на синтетических фрагментах РНК, используя как флуоресцентное, так и визуальное считывание, с чувствительностью 10 копий на микролитр. Представленный протокол может быть легко адаптирован к другим 66 вирусам [51].
    В 2018 году компания Mammoth Biosciences анонсировала новый инструмент под названием DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter (DETECTR) для обнаружения ДНК с помощью Cas12a [53]. Белки CRISPR-Cas12a (Cpf1) - это ферменты, управляемые РНК, которые связывают и разрушают ДНК, являясь компонентами бактериальной адаптивной иммунной системы. Как и CRISPR-Cas9, на основе своей способности производить управляемые двухцепочечные разрывы ДНК, Cas12a используется для редактирования генов [53]. Сообщается, что РНК-управляемое связывание ДНК приводит к неизбирательному разрезанию одноцепочечной ДНК (ssDNA) с помощью Cas12a, которая полностью разрушает молекулы ssDNA. Кроме того, активируемая мишенью неспецифическая дезоксирибонуклеаза (ssDNase), расщепляющая одноцепочечную ДНК, является особенностью других также др. ферментов CRISPR-Cas12 типа V [53]. Активация ssDNase Cas12a вместе с методом изотермической амплификации DETECTR позволяет обнаружить ДНК мишени в очень низкой концентрации [51, 53]. DETECTR позволяет быстро и точно идентифицировать в образцах пациентов вирус папилломы человека, тем самым обеспечивая новую платформу для молекулярной диагностики [53]. Команда Mammoth Biosciences протестировала идентификацию двух генов, N-гена и E-гена, из генома SARS-CoV-2 из сконструированных образцов на основе CRISPR [51].

    В их протокол были включены следующие шаги: 1. (1) Амплификация РНК, выделенной из образцов, с помощью изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции.

    2. (2) Обнаружение ДНК с помощью Cas12a и поставляемой компанией Synthego crRNA, нацеленной на определенные последовательности.

    3. (3) Визуальное считывание с использованием имеющихся в продаже dip-полосок, как и при использовании метода SHERLOCK.
    При сравнении протокола DETECTR (диапазон чувствительности 70-300 копий/мкл) с протоколом на основе SHERLOCK (диапазон чувствительности 10-100 копий/мкл) платформа DETECTR обеспечила более быстрое обнаружение ( в течение 30, а не 60 мин). В значительной степени это было обусловлено тем, что система экономила время, затрачиваемое на дополнительные этапы IVT, необходимые для детекции на основе Cas13a [51].
    Метод DETECTR может быть в дальнейшем модифицирован для выявления РНК SARS-CoV-2 всего за 30 мин. Такой метод быстрой диагностики был бы особенно полезен в зонах повышенного риска, таких как аэропорты и больницы [51]. Результаты работы алгоритма охватывают все геномное разнообразие и, как ожидается, будут высокочувствительными и точными. Прототипы SARS-CoV-2 были экспериментально проверены с помощью системы обнаружения CRISPR-Cas13. Исследователи разработали дизайн анализа для идентификации 67 видов и подвидов вирусов, включая SARS-CoV-2, филогенетически родственные вирусы и специфичные для клиники вирусы [51]. С другой стороны, платформа DETECTR компании Mammoth Biosciences все еще "медленная" по сравнению, например, с продуктом Assay Genie, который обеспечивает надежные результаты за 15 минут.

    CRISPR-Cas13 адаптирован в качестве противовирусной системы против SARS-CoV-2


    Около двух третей вирусов, способных заразить человека, включая смертельно опасные вирусы Эбола, Зика и гриппа, имеют геном из ssRNA, и не существует одобренного FDA лечения ни для одного из этих типов вирусов. Вакцины стали преобладающим решением в борьбе с инфекционными заболеваниями, но только против 16 вирусов есть вакцины, одобренные FDA [32]. Для разработки противовирусных препаратов было предпринято много новых попыток, таких как методы скрининга мелких молекул для классификации ингибиторов вирусных и хозяйских мишеней. Выявление мощных ингибиторов этих мишеней также требует биологического или механического понимания, что в условиях лекарственной устойчивости или появление новых патогенов может задержать разработку противовирусных препаратов [54]. Более того, вирусные патогены человека очень сложны и быстро эволюционируют, это обуславливает как проблему разработки, так и большую потребность в адаптируемых противовирусных терапевтических платформах. Этот метод использует программируемую нацеленную на РНК активность Cas13 для создания сквозной платформы разработки под названием Cas13-assisted Viral Expression and Readout (CARVER), которая сочетает Cas13-опосредованное расщепление вирусной РНК с быстрым диагностическим считыванием на основе Cas13 с использованием платформы SHERLOCK [50, 54]. Ученые из Wide Institute of Massachusetts Institute of Technology and Harvard объявили о разработке технологии на основе фермента CRISPR-Cas13 под названием CARVER (Cas13-aided viral expression and readout restriction), которая может быть запрограммирована на уничтожение вирусов на основе РНК в клетках человека [54]. Считается, что это исследование является одним из первых, в котором Cas13 или любое другое устройство CRISPR используется в качестве противовирусного средства в культивируемых клетках человека [54]. Совсем недавно исследователи адаптировали белок Cas13, который естественным образом нацелен на вирусную РНК в бактериях, как метод для разрезания и редактирования человеческой РНК, а также как тест для обнаружения существования вирусов, бактерий или других целей. Исследователи хорошо изучили фермент в клетках млекопитающих, и его можно направлять на различные последовательности РНК. Cas13 довольно легко доставить в клетки. CRISPR-эффектор Cas13 может быть эффективным антивирусом для ssRNA-вирусов, поскольку он дополняет свою crRNA программируемыми расщепляющими РНК. Белок Cas13 образует комплекс с направляющей гид РНК посредством короткой шпильки в составе crRNA, а специфичность мишени кодируется посредством 28-30-нтного спейсера, комплементарного области мишени. В сотнях видов ssRNA-вирусов, которые потенциально могут заразить человека, Freije и др. с помощью компьютерного анализа описали тысячи возможных сайтов-мишеней crRNA для Cas13 [54]. Прежде всего, они изучили широкие возможности Cas13 в целенаправленном воздействии на ssRNA-вирусов млекопитающих, путем компьютерного анализа более 350 вирусных геномов из видов, известных или прогнозируемых для заражения людей [54]. В ходе исследования была экспериментально проверена способность Cas13 подавлять вирусную репликацию трех различных ssRNA-вирусов: вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вируса гриппа А (IAV) и VSV. Затем исследователи провели геномный тест LCMV и далее оптимизировали этот противовирусный подход, изучив значение локализации Cas13 и мультиплексирования crRNAs, а также сравнили успех Cas13 и short hairpin RNAs (shRNAs) в создании CARVER. как сильной противовирусной и диагностической технологической платформы для широкого спектра ssRNA-вирусов [54].

    CRISPR-Cas13-based PAC-MAN approach to fight COVID-19


    PAC-MAN (prophylactic antiviral CRISPR in human cells), которая представляет собой технологию на основе CRISPR-Cas13, может эффективно разрушать последовательности SARS-CoV-2 и живой геном IAV в эпителиальных клетках легких человека [55]. Они разработали и проверили группу crRNAs, нацеленных на консервативные вирусные регионы, и диагностировали crRNAs мишени для расщепления SARS-CoV-2. Исследование показало, что подход PAC-MAN может снизить репликацию вируса респираторных клеток для H1N1 IAV [55]. Биоинформационная оценка также рекомендовала минимальный пул из шести crRNAs, который может покрыть более 90% секвенированных коронавирусов. Биоинформационный анализ, проведенный в ходе исследования, показал, что система PAC-MAN может быть нацелена на все секвенированные коронавирусы с 22 пулами crRNAs. Таким образом, PAC-MAN может целенаправленно воздействовать на различные регионы вируса или различные штаммы коронавирусов одновременно с помощью пула crRNAs, предотвращая возможную сохранность вирусов, и является перспективной стратегией борьбы с панкоронавирусами, которые будут возникать при пандемиях [55]. Они также перепрофилировали РНК-управляемую эндонуклеазную активность Cas13d в клетках млекопитающих для борьбы с новыми вирусными мишенями, SARS-CoV-2 и IAV, в стратегии PAC-MAN. Это расширяет пакеты CRISPR-Cas13 систем в дополнение к их использованию для диагностики наряду с SHERLOCK и визуализацией живых клеток [48, 50, 54,55,56]. Предыдущие работы показали, что системы Cas13a/b могут ингибировать вирусы ssRNA, а также гриппа, что согласуется с наблюдаемой нами высокой эффективностью ингибирования репортера SARS-CoV-2 и IAV при использовании подхода PAC-MAN [54]. PAC-MAN продемонстрировал, что инструмент на основе Cas13d может успешно целенаправленно воздействовать и расщеплять последовательности РНК фрагментов SARS-CoV-2 и IAV в культурах эпителиальных клеток легких. Хотя этот подход является доказательством концепции и требует тестирования с использованием готовых к репликации вирусов SARS-CoV-2 и проверки на животных моделях до клинических проверок на людях, он представляет собой уникальный метод создания быстрой и обширной противовирусной защиты у человека против растущих патогенов, против которых не существует мощных вакцин. Традиционные вакцины основаны на создании иммунной системы к вирусным белкам или пептидам, часто полученным из поверхностных белков, которые демонстрируют высокую скорость мутации, что увеличивает шансы вируса уклониться от иммунного ответа хозяина [57]. В отличие от этого, подтверждена генетическая стратегия, способная целенаправленно воздействовать на достаточно консервативные регионы, что, как можно предсказать, делает гораздо более низкой вероятность того, что вирус избежит ингибирования посредством мутации. Кроме того, Cas13d может скринировать вирусный геном с помощью массива crRNAs таким образом, что несколько crRNAs, сконцентрированные на разных областях, могут быть доставлены одновременно [41], что может снизить вероятность избегания вирусами гибели.

    ASO as a COVID-19 therapeutic


    Технология ASO нацелена на мРНК, малые РНК или длинные некодирующие РНК. ASO химически синтезированные нуклеотиды длиной 15-50 нуклеотидов, которые предназначены для связывания РНК-мишеней посредством комплементарной пары оснований. ASO могут действовать и модулировать функцию РНК двумя различными механизмами в клетках; (1) в цитоплазме ASO взаимодействует с мРНК и предотвращает трансляцию мРНК рибосомой, блокируя синтез белка; (2) в ядре ASO связывают комплементарную последовательность мРНК. Комплементарная пара оснований между ASO и мРНК приводит к эндонуклеазному нокдауну транскрипта, поскольку гибрид РНК-ДНК становится субстратом для РНКазы Н. Транспорт мРНК в цитоплазму блокируется, что препятствует производству белка [58]. Преимуществом ASO-терапии является ее применение против любой вирусной РНК, представляющей интерес. ASO-терапия является новым успешным методом, применяемым при миопатиях, нейродегенеративных заболеваниях, онкологии и многих других заболеваниях [59-63] Клиническая пригодность АСО-препаратов была продемонстрирована во многих клинических испытаниях на людях [64-68]. Предыдущие исследования продемонстрировали эффективность ASO при высокопатогенных вирусных инфекциях, вызванных рибовирусами, таких как Эбола, грипп, гепатит С, японский энцефалит [69-72].
    ASO технологии были также разработаны и для SARS-CoV, чтобы снижать тяжесть инфекции, для лечения и диагностики сопутствующих заболеваний, а также для обнаружения вируса в образцах человека. Было опубликовано три патента, в которых используются ASO для изучения патогенеза и вирулентности SARS-CoV. В патентной заявке WO2005023083, опубликованной компанией Ionis Pharmaceuticals, описано изобретение ASO, направленного на различные регионы вирусной РНК для снижения активности вируса SARS, для профилактики или лечения и диагностики ассоциированного с вирусом SARS заболевания. В этом исследовании гибридные ДНК/РНК ASO были использованы для разрушения ложного узелка в сайте сдвига рамки считывания SARS-CoV [73]. AVI BioPharma, Inc. опубликовала патент WO2005013905, относящийся к модифицированным олигонуклеотидным соединениям, нацеленным на 3' терминальный конец отрицательной нити для лечения ssRNA вирусных инфекций, таких как флавивирус, коронавирус, пикорнавирус, тогавирус, калицивирус и вирус гепатита Е [74]. Другой патент US20030224353, опубликованный Stein David, описывает антисмысловой противовирусный агент ASO ORF1 для SARS региона 217-245 bp и метод лечения ssRNA вирусной инфекции [75].
    ASO может быть направлен против любой геномной вирусной РНК, представляющей интерес. По сравнению с вирусами с ДНК-геномом, РНК-вирусы (кроме ретровирусов) подходят для воздействия на них ASO, поэтому геномная РНК может быть нарушена или полностью разрушена. Однако вирусы с ДНК-геномом и ретровирусы стабильно интегрируются в геном хозяина. В этом случае зрелый транскрипт мРНК может стать мишенью для ASO, и вирусная экспансия может быть остановлена. Таким образом, стратегии ASO-терапии для блокирования инфекции вируса SARS-CoV-2 могут быть направлены на сам вирус путем связывания транскриптов, кодирующих вирусный белок, связанный с репликацией и транскрипцией. Недавно Barrey et al. разработали ASO, направленные на вирусную РНК, кодирующую белок, связанный с репликацией и транскрипцией SARS-CoV-2, для блокирования инфекции [76]. В данном исследовании были разработаны пять кандидатов ASO, нацеленных на геномные 5'-UTR, ORF1a и ORF1b, экспрессию комплекса репликазы/транскриптазы, а также ген N, кодирующий геном-ассоциированный нуклеопротеин. Однако для подтверждения эффективности каждого из этих ASO необходимо провести экспериментальную проверку [76].
    Benjamin et al. продемонстрировали, что ASO-ассоциированное подавление репликации SARS-CoV может быть достигнуто путем воздействия на консервативные элементы РНК, необходимые для синтеза и трансляции вирусной РНК [77]. Однако SARS-CoV вырвался на свободу и выработал устойчивость к препарату ASO [77]. Помимо воздействия на вирусные белки, для уничтожения SARS-CoV-2 можно было бы использовать ASO против РНК генома вирусов. Хотя геном вируса недавно был секвенирован, лечение с помощью ASO затруднено, поскольку консервативные последовательности РНК SARS-CoV-2 все еще неизвестны. Выявление консервативных последовательностей важно для улучшения таргетинга ASO и предотвращения выживания вирусов.
    В большинстве случаев для лечения олиго используется системная доставка внутривенно или подкожно. Тем не менее, SARS-CoV-2 вызывает острое повреждение легких и острый респираторный синдром [78]. Доставка препаратов ASO в легкие будет одной из самых сложных задач для лечения COVID-19. Для SARS-CoV-2 необходима ингаляционная форма доставки, чтобы олигосомы попадали непосредственно в дыхательные пути и легкие [79].
    Для лечения редких заболеваний выпускаются ASO-терапевтические препараты. Однако благодаря их низкому токсическому эффекту, высокой специфичности, низкой стоимости производства и простоте разработки, ASO-терапия может быть разработана для пандемии SARS-CoV-2 [80].

    PNAs as antisense agents


    Антисмысловая терапия является одной из важных стратегий, разработанных для лечения злокачественных и вирусных заболеваний, и характеризуется ингибированием трансляции генов специфическими ASO, которые связываются с РНК мишенью [81]. PNAs представляют собой важный класс олигонуклеотидов, который определяется как антигенные и антисмысловые терапевтические соединения. Впервые PNAs были описаны в 1991 году как синтетические олигомеры из нуклеотидных оснований, в которых фосфодиэфирная основа нуклеиновой кислоты была заменена на N-(2-аминоэтил) глициновые единицы через метилкарбонильную связку [82]. Эти химически стабильные синтетические нуклеиновые кислоты долговечны in vivo и in vitro, поскольку они устойчивы к действию нуклеаз и протеаз. Эти стабильные PNAs, имеющие низкое или полное сродство к белкам сыворотки крови и обладают низкой токсичностью даже в относительно высоких концентрациях, и являются важными кандидатами в качестве антисмысловой терапии или антигенных технологий [83, 84].
    Благодаря гибкой полиамидной и незаряженной основе PNAs, геометрии оснований и высокому сходству структуры с молекулами природных ДНК и РНК, они могут легко гибридизироваться с комплементарной ДНК или РНК в соответствии со спариванием оснований Уотсона-Крика [85]. Они могут связываться с двухцепочечной ДНК в В-форме, с одноцепочечной ДНК или РНК в В-форме, которая была открыта Джеймсом Д. Уотсоном и Фрэнсисом Криком. Хотя PNAs могут быть легко сконструированы для любой целевой последовательности, существуют некоторые ограничения при попытке создания триплексных структур с двухцепочечной ДНК. Благодаря сильным гибридизационным свойствам, стабильности и низкой токсичности олигомеры PNAs являются важными соединениями для применения в антисмысловых и антигенных системах. Однако медленное поглощение PNAs клетками оказалось проблемой, которую пытались решить с помощью различных модификаций PNAs [85, 86], а в последнее время и с помощью нано-технологических подходов. Например, PNAs, соединенные с наночастицами золота (AuNPs), стали важными кандидатами благодаря их низкой токсичности, высокому биораспределению и биосовместимости, регулируемому размеру и форме, а также простоте синтеза [84, 87].

    Use of PNAs as antisense agents


    Потенциал PNAs действовать как антисмысловые агенты был продемонстрирован Hanvey и др. в 1992 году путем последовательного и дозово-зависимого ингибирования транскрипции ДНК-матрицы, экспрессирующей большой Т-антиген SV40, с помощью ядерной микроинъекции 15-мерных PNAs [88]. Они связываются с РНК в 5' нетранслируемой области и в кодирующей последовательности и таким образом ингибируют связывание рибосом или трансляционную элонгацию. Помимо этого, они также действуют, связываясь с участками РНК, которые обеспечивают перенос белков из ядра в цитоплазму [89].
    В данном исследовании изучается потенциал ингибирования обратных транскриптаз (RTs) HIV-1, MMLV и AMV PNAs, связанных с триплексной или дуплексной гибридизацией с определенными областями гена gag вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1). Было показано, что все RTs были остановлены комплексом PNA/RNA, когда они находились в достаточной концентрации в клетке, таким образом, они действуют как важный ингибитор обратной транскрипции. Кроме того, поскольку не наблюдалось признаков деградации РНК, было высказано предположение, что действие PNA связано исключительно со стерической блокадой, а не связано с RNase-H [90].
    PNAs могут быть нацелены на более чем одну специфическую область, такую как сайт инициации димеризации для предотвращения упаковки геномной РНК, на последовательности U3 и U5 линейной провирусной ДНК для предотвращения интеграции вирусного генома с геномом хозяина и на область LTR для ингибирования реакции переноса нити во время обратной транскрипции. Таким образом, он может блокировать обратную транскрипцию на многих этапах и проявлять более эффективное противовирусное действие [91-93].

    PNA approaches for SARS-CoV-2


    В лечении COVID-19 будут важны подходы, способные ингибировать жизненный цикл вируса на разных стадиях. В этом направлении нет четких исследований по использованию , которые считаются подходящими кандидатами. Однако, как упоминалось в предыдущем разделе, антисмысловые PNA были разработаны для лечения ВИЧ, индуцированного ретровирусами. В одном из исследований антисмысловые PNAs использовались против SARS-CoV, который генетически на 79% похож на штаммы SARS-CoV-2 [94]. Был создан репликон SARS-CoV, экспрессирующий репортерный ген люциферазы для клеточного анализа противовирусной активности, и сигнал -1 рибосомального сдвига рамки (-1 PRF), который контролирует синтез полипротеинов репликаз вирусной РНК, участвующих в репликации генома вируса, был заблокирован полностью совместимой PNA, специфичной по последовательности. В результате было снижено внутриклеточное количество репликазных белков, кодируемых связанным с сигналом ORF1b, подавлена репликация репликона SARS-CoV и достигнута эффективная антисмысловая стратегия. Тот факт, что структура сигнала -1PRF была чрезвычайно стабильной и консервативной, превратил эту область в важного кандидата для противовирусного лечения. В то же время было обнаружено, что PNA, имеющая разницу в два основания с мишенью, была менее эффективна в ингибировании сдвига рамки 1 по сравнению с полностью совместимой PNA (94% эффективности при определенной концентрации) [95]. Этот результат свидетельствует о том, что олигомеры PNAs требуют большей специфичности при связывании с ДНК или РНК по сравнению со связыванием между нитями ДНК.
    Существуют некоторые важные трудности в использовании PNAs в качестве противовирусной терапии против РНК-генома SARS-CoV-2. Одной из них является тот факт, что консервативные области генома SARS-CoV-2 еще не полностью известны [96]. Однако одной из основных проблем, известных для PNAs, является их медленное поглощение клетками. Сообщалось, что из-за отрицательно заряженной фосфатной основы PNAs в растворе склонны сворачиваться в сложные глобулярные структуры, возможно, из-за внутри- и межмолекулярного сродства между их гидрофобными нуклеотидными основаниями. Гидрофобность и склонность к агрегации PNAs накладывают различные ограничения. Гидрофобность, поддерживающая агрегацию PNAs, способствует относительно неспецифической адгезии как с другим макромолекулам, так и с большим поверхностям [97]. Используя липосомы в качестве модели клеточных мембран, исследователи выявили, что PNAs с трудом поглощаются клетками, хотя они нейтральны. Это указывает на то, что PNAs являются более липофильными, чем олигонуклеотиды, но присутствуют в водных участках липосом, а не растворяются в липидной мембране [98].
    Хотя для решения этой проблемы применялись такие нано-технологические средства, как золотые наночастицы и некоторые их модификации, исследования для противовирусной терапии SARS-CoV-2 не проводились. Хотя существуют исследования по передаче siRNA в легкие с помощью таких средств передачи, как липидные наночастицы [99], применимость этого подхода для PNAs, определение и оптимизация эффективной дозы представляют значительные трудности, которые необходимо преодолеть.

    Ribozymes and aptamers in the fight with SARS-CoV-2


    Научные исследования молекулы РНК за последние 50 лет позволили лучше понять сложную структуру этой молекулы. Рибозимы - это молекулы РНК с каталитической функцией. Эта каталитическая функция обеспечивается за счет связывания и расщепления фосфодиэфирных связей в нуклеиновой кислоте мишени. Таким образом, предотвращается синтез белка из участка мишени. Рибозимы классифицируются в зависимости от их размера и механизмов реакции [100]. Специфическая инактивация РНК-мишеней рибозимами позволяет предположить, что они могут быть эффективны в лечении вирусных заболеваний посредством редактирования генов. Действительно, исследования регуляции генов на основе рибозимов проводились при заболеваниях, вызванных РНК-вирусами, включая HCV, HIV и грипп. В большинстве исследований по редактированию генов, проведенных с помощью рибозимов, использовались легко модифицируемые малые рибозимы, такие как головка молотка, шпилька, гепатит-дельта и рибозим Varkud satellite (VS) [101-106].
    При проведении противовирусной терапии на основе рибозимов следует учитывать некоторые важные моменты. Например, целевой регион должен быть консервативным и жизненно важным для вируса, этот регион мишени должен быть доступным, а рибозим должен легко связываться с регионом мишенью. Также важным фактором, повышающим надежность терапии, является эффективный механизм доставки.
    Основным недостатком рибозимов является то, что их расщепляющее действие in vivo не такое, как in vitro. Более того, не модифицированные рибозимы дают кратковременный эффект при одиночном введении in vivo [107-109]. Возможной причиной этого может быть участие рибозима в клеточном трафике и его период полураспада. Тем не менее, это не означает, что технология рибозимов полностью неудачна и непригодна для использования. Напротив, совершенствование этой технологии будет способствовать дальнейшему повышению ее функциональности и успешности. Долгосрочная экспрессия рибозимов in-vivo и постоянное лечение заболевания могут быть возможны с помощью молекул-медиаторов или химических модификаций. Некоторые химические модификации, внесенные в молекулы рибозимов, предотвратили их деградацию в клетке [110].
    Пока не разработана эффективная, быстрая, постоянная и надежная стратегия лечения инфекций SARS и MERS. Поскольку они происходят из одного семейства и их генетические структуры схожи [111], многие стратегии лечения SARS-CoV-2 были вдохновлены этими методологиями. Поскольку все они являются РНК-вирусами и очень склонны к новым мутациям, которые негативно влияют на разработку стратегий лечения, найти окончательное лечение для SARS-CoV-2 также стало сложнее. Однако в 2007 году японские ученые разработали и получили патент на химерный рибозим ДНК/РНК, который может быть использован для лечения общего коронавируса (JP2007043942). Этот химерный рибозим представляет собой рибозим, который нацелен на консервативные области в семействе коронавирусов и разрезает их, и может быть адаптирован к стратегиям или исследованиям лечения SARS-CoV-2 также.
    Lee et al. [112] объединили молекулу рибозима в качестве gRNA с системой CRISPR/Cas9 и проверили их эффективность как in vitro, так и на эмбрионах рыбок данио [112]. Сообщалось, что сочетание технологий рибозима и CRISPR/Cas9 усиливает разрушение генов в области мишени. Кроме того, аналогичное исследование было проведено и для лечения малярии [113]. Одним словом, использование рибозимной технологии в сочетании с Cas9 или даже нуклеазой Cpf1 может повысить эффективность стратегий [114]. Рибозимная терапия является важным методом лечения благодаря таким ее особенностям, как высокая специфичность и отсутствие иммуногенного ответа по сравнению с некоторыми другими методами лечения [115]. Поэтому сочетание рибозимной технологии с противовирусными препаратами для лечения инфекции SARS-CoV-2 может усилить эффективность лечения, как это было показано при ВИЧ генотерапии [116, 117].
    Аптамеры - это тип олигонуклеотидов, которые могут быть использованы в генотерапии и лечении вирусных заболеваний. Это небольшие и одноцепочечные олигонуклеотиды, которые связываются с молекулой-мишенью с высоким сродством. Их предпочитают использовать в различных исследованиях из-за их значительных преимуществ, таких как высокое сродство, простота химической модификации, низкая стоимость, чувствительность к низким температурам, быстрый синтез и крупномасштабное производство. РНК-аптамеры использовались для подавления вирусной инфекции при исследовании вируса папилломы человека типа 16, вируса птичьего гриппа и вируса гепатита С (HCV) [118-120]. Однако самым большим недостатком аптамеров является их нестабильность внутри клетки, но с помощью некоторых модификаций аптамеры могут стать более стабильными. Существует множество химических модификаций, приводящих к стабилизации аптамеров [121, 122].
    Аптамеры объединяются с рибозимами для получения каталитических молекул, называемых аптазимами. Сообщалось, что сочетание аптамеров с системой CRISPR/Cas в качестве gRNA повышает эффективность редактирования генов [123]. Кроме того, сообщалось об аптамерах, которые были объединены с технологией siRNA для остановки экспрессии ВИЧ-1 [124]. Также сообщалось о двух патентных заявках в Корее (KR2009128837 и KR2012139512), связанных с ингибированием вируса SARS [125]. Поэтому, используя аналогичные методы и изобретения, аптамерная технология может стать полезной стратегией для лечения инфекций SARS-CoV-2.
    Технология аптамеров может быть использована не только в лечении, но и в диагностике COVID-19 путем связывания с антигенными вирусными белками. Aptamer Group планирует в ближайшем будущем использовать комбинацию энзимно-связанного олигонуклеотидного анализа с технологией аптамеров для диагностики COVID-19 [126, 127]). Более того, нано-сенсор на основе аптамеров, разработанный компанией Pinpoint Science, как ожидается, сможет быстро диагностировать COVID-19. Существует также подробное проектное предложение по использованию аптамеров в лечении COVID-19 [128]. Наконец, некоторые исследования в период эпидемии SARS показали, что технология аптамеров может работать для диагностики COVID-19 [129, 130].

    RNAi based approaches for COVID-19 therapy


    Механизм РНК-интерференции (RNAi) используется для подавления генов, связанных с раком, вирусными инфекциями и аутоиммунными заболеваниями. МикроРНК, siRNAs и shRNAs являются ключевыми молекулами для активации механизмов RNAi. siRNAs, короткие интерферирующие РНК, представляют собой некодирующие молекулы dsRNA длиной 21-25 п.н. [9, 50, 131-133]. siRNAs, в зависимости от гомологии и благодаря наличию 2-х nt 3' выступов, которые распознаются PAZ доменом Dicer, важных для управления процессингом Dicer и генерации подходящей направляющей нити. siRNAs связываются с мРНК мишенью в зависимости от гомологии. Связывающие комплексы распознаются механизмами RNAi, которые вызывают деградацию мРНК матрицы, или посредством активации RISC (RNA-induced silencing complex) трансляция может быть подавлена [131, 132]. Для siRNA-опосредованной РНК-интерференции были использованы два различных метода. Один из них - стратегия на основе РНК; синтетически полученные siRNA могут быть перенесены в клетки-мишени с помощью специфических транспортеров. Другой метод - внутриклеточное производство siRNA с помощью стратегии на основе ДНК. В этом методе были разработаны и использованы плазмиды, кодирующие shRNA. В ядре shRNA производится и расщепляется Drosha и DGCR8, переносится в цитоплазму с помощью экспортина 5. В результате расщепления Dicer в цитоплазме, shRNA превращаются в siRNA, которые запускают механизм RNAi [132].
    siRNA могут быть использованы для подавления экспрессии генов SARS-CoV-2, которые кодируют структурные и nsps. Геномы SARS-CoV-2 кодируют четыре структурных белка: оболочку (E), мембрану (M), нуклеокапсид (N) и шип (S), которые имеют решающее значение для сборки вириона и подавления вирусной репликации в организме человека. Для разработки лекарств гены, кодирующие эти вирусные структурные белки, были направлены на разработку siRNAs [133]. Было показано, что siRNAs при этом подавляют экспрессию генов SARS-CoV [134]. Наряду с подавлением экспрессии генов, они также ингибируют репликацию вируса. Были проанализированы различные исследования по 3енараправленному воздействию siRNA на гены SARS-CoV E, M, N и S. В качестве другого подхода, вместо нацеливания siRNA на гены SARS-CoV, целенаправленное воздействия оказывали на лидерные последовательности генов SARS-CoV. Лидерные последовательности генов S, E, M, N были проанализированы, и общие последовательности для всех четырех генов стали целью для siRNA. С помощью siRNA было осуществлено ингибирование репликации вируса в клетках Vero E6, инфицированных SARS-CoV [135]. Согласно подходу и результатам данного исследования, целенаправленное воздействие siRNA на несколько генов путем поиска общих последовательностей из лидерных последовательностей может оказаться более эффективным в ингибировании репликации вируса. В рамках современного подхода к изучению siRNA вируса SARS-CoV-2 исследователи выявили потенциальные siRNA, которые могут быть направлены против вируса SARS-CoV-2. В данном исследовании были проанализированы девять консервативных областей siRNA, которые могут быть нацелены на геном SARS-CoV-2 (MN908947, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947) [136] (Таблица 1).

    Table 1

    siRNAs that are characterized by SARS-CoV and potential siRNA targeting the SARS-CoV-2 genome.

    В китайском патенте (CN101173275) были разработаны две различные siRNA для глушения гена, кодирующего белок M вируса SARS-CoV. siRNA-M1, одна из siRNA, комплементарна последовательности мРНК белка M, нуклеотиды 220-241, а другая siRNA комплементарна её 460-480 нуклеотидам. С помощью этих двух siRNA было показано ингибирование мРНК белка М, а эффективность интерференции siRNA была определена как более 70% [131, 137-139]. Патентная заявка (US20050004063) включает шесть siRNA (SARSi-1 -6), которые нацелены на последовательности мРНК в области гена репликазы A1, и экспериментальные результаты показали, что инфекция и репликация вируса была подавлена в клетках FRhk-4, особенно с помощью SARSi-4 (CAS RN821121-38-4) [133]. В патенте CN1569233 разработанные siRNA, нацеленные на нуклеопротеин N и протеолитический фермент, подавляли около %90-95 SARS-CoV в штамме BJo1 (Таблица 1).
    SARS-CoV-2 также имеет 15 nsps Nsp1 - Nsp10 и Nsp12 - Nsp16, которые кодируются генами ORF1ab и ORF1a. Nsp3, папаиноподобная протеаза, отвечает за расщепление полипротеина 1a для образования Nsp1, Nsp2 и Nsp3. Nsp5 (основная, 3С-подобная протеаза) и Nsp12 (РНК-зависимая РНК-полимераза) регулируют вирусную репликацию [133]. Комплексы Nsp10/Nsp16 (2'О-метилтрансферазы) и Nsp10/Nsp14 способствуют активности метилтрансфераз. Согласно исследованию, отдельно экспрессированные Nsp9 и Nsp10 вызывают индукцию IL-8 и IL-6 посредством целенаправленного действия на NKRF в эпителиальных клетках легких A549. Нацеливание на Nsp9 и Nsp10 с помощью siRNA позволяет снизить индукцию IL-8/IL-6, тем самым минимизируя связанное с нейтрофилами повреждение легких [138]. Целенаправленное воздействие на nsps также важно для ингибирования вирусной репликации и снижения вирусных симптомов.
    В качестве другого подхода гены, кодирующие человеческие белки, связанные с белками SARS-CoV-2, также являются мишенью для разработанных siRNAs. Существует одно предложение, направленное на подавление гена ACE2 для лечения SARS-CoV-2 с помощью siRNA-опосредованной RNAi [140]. В этой предложенной стратегии инфекция вируса будет предотвращена, так как область RBD белка spike не может связываться с рецептором ACE2 [140]. Эта стратегия была использована для SARS-CoV и привела к снижению репликации вируса в клетках Vera E6 [141]. Стратегии доставки siRNAs планируются с использованием стабильных липидных частиц нуклеиновой кислоты (SNALP-липосом) или с использованием инактивированного вируса в качестве носителя siRNA [140]. Однако неспецифические мишени siRNA могут вызвать нежелательную иммуногенность, а подавление гена ACE2 может вызвать различные симптомы у людей. В другом исследовании для лечения SARS-CoV и MERS-CoV были разработаны siRNA, направленные на киназы ABL (Abl1 и Abl2), которые регулируют несколько клеточных процессов. Согласно экспериментальным результатам, нокдаун ABL2 с помощью siRNA в клетках Vero E6 вызывает значительное подавление репликации SARS-CoV и MERS-CoV [142].
    Для лечения COVID 19 соответствующая стратегия транспортировки in vivo должна быть выбрана после завершения анализа in vitro и характеристики siRNAs, нацеленных на гены SARS-CoV-2. Голые молекулы siRNA не могут эффективно проходить через клеточную стенку из-за своего большого размера и высокой плотности отрицательных зарядов. Также было установлено острое повреждение легких из-за того, что вирусы SARS-CoV и SARS-CoV-2 инфицируют эпителиальные клетки легких второго типа [143]. Для COVID-19, респираторного заболевания, разработанные siRNA могут вводиться пациентам легочным путем посредством ингаляции, интратрахеальной аэрозольной доставки, интраназальной доставки [99]. Интенсивный слой слизи, альвеолярные макрофаги, легочные протеазы являются барьером для достижения siRNA клеток-мишеней из-за воспаления, вызванного острым повреждением легких [99]. Введенные в легкие голые siRNA разрушаются макрофагами и нейтрофилами, которые чувствительны к инородным частицам [99]. Эти ограничения могут быть смягчены при аэрозольном введении с помощью нано-носителей siRNA липидного, полимерного, пептидного или неорганического происхождения и дополнительных антимукозальных агентов. Для доставки siRNAs можно использовать наночастицы на основе липидов (LNPs). siRNAs инкапсулируются с помощью LNPs, которые обеспечивают способность проникновения в ткани-мишени и большую стабильность [144]. Кроме того, для доставки siRNAs можно использовать SNALPS, разработанные компанией Alnylam (Patisiran, препарат на основе siRNA) [144].

    Conclusion


    Коронавирусная болезнь (COVID-19) - это особо заразное респираторное заболевание, вызываемое недавно открытым коронавирусом SARS-CoV-2. Появление и вспышка нового коронавируса выявили острую необходимость в новых терапевтических технологиях, быстрых, точных, стабильных, простых в производстве и специфичных для мишеней, для наблюдения и лечения. Инструменты молекулярной биологии, включающие подходы к редактированию генов, такие как CRISPR-Cas12/13 на основе SHERLOCK, DETECTR, CARVER и PAC-MAN, ASO, антисмысловые пептидные нуклеиновые кислоты, рибозимы, аптамеры и терапия подавления RNAi, произведенные с использованием передовых научных достижений по сравнению с традиционными методами диагностики или лечения, могут стать жизненно важными при COVID-19 и других будущих вспышках. От более короткой и легкой диагностики до более целенаправленного обнаружения и уничтожения вируса, эти инструменты могут войти в нашу жизнь как методы диагностики и лечения нового поколения. Таким образом, в данном обзоре мы обобщили надежный молекулярно-биологический инструментарий, изучаемый для диагностики SARS-CoV-2 и лечения против вирусной инфекции, который в будущем может стать альтернативой биотехнологическим препаратам обычным вакцинам и лекарствам.
    Также в данном обзоре мы создали сравнительный график, обсудив информацию, полученную в результате исследований, проведенных с помощью этих молекулярно-биологических инструментов, которые могут быть использованы в будущем при лечении вирусных инфекций, специфичных для SARS-CoV-2 (рис. 1). В частности, мы создали идею сравнения между долговечностью, специфичностью, обращением, доступностью, токсичностью и стоимостью производства (рис. 1). Основываясь на опубликованных исследованиях, мы считаем, что CRISPR и ASO/пептидные нуклеиновые кислоты более устойчивы по сравнению с чисто РНК-сайленсингом и рибозимами/аптамерами, хотя таких статистических сравнительных публикаций пока нет. Несмотря на это, мы предполагаем, что системы CRISPR могут оказаться более дорогостоящими и, возможно, токсичными, чем все остальные системы (рис. 1). Однако мы считаем, что самым дешевым методом будет АСО или пептидная нуклеиновая кислота. Сравнительные исследования, которые будут проводиться в будущем, дадут нам более четкое представление о том, какая или какие из этих систем войдут в нашу жизнь быстрее, проще, эффективнее и дешевле (рис. 1).



    Fig. 1: This figure was created by compiling the data of many articles.

    In the figure, the activities indicated by a plus, relatively. One plus (+) shows the lowest and three-plus (+++) the highest activity. Gene editing and RNAi approach for COVID-19 diagnostics and therapeutics are classified based on stability, specificity, delivery, ease of use, toxicity, and cost of production. Full size image