Система CRISPR / Cas9 (сгруппированные с регулярными интервалами короткие палиндромные повторы / связанные с CRISPR 9) допускает модификацию генов, ответственных за наследственные заболевания [1]. Эта система доказала свою эффективность и надежность в различных генетических контекстах [2, 3]. Cas9, полученный из Streptococcus pyogenes (SpCas9), был первым и остается наиболее широко используемым ортологом Cas9 для редактирования генома. Постнатальная генотерапия нервно-мышечных заболеваний - возможности и ограничения[4]. Cas9 из Campylobacter jejuni (CjCas9) также используется, потому что эта нуклеаза достаточно мала, чтобы доставляться вместе с двумя sgRNA с помощью одного аденоассоциированного вируса (AAV) [5]. В нашей лаборатории технология CRISPR используется для разработки терапевтических подходов к определенным генетическим патологиям, таким как мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) и атаксия Фридрейха [6,7,8].
Для МДД система CRISPR была использована для получения гибридного экзона 50-54 для восстановления нормальной рамки считывания гена DMD, который был модифицирован путем делеции экзонов 51-53 .. Образование гибридного экзона 50-54 восстановило экспрессию усеченного изнутри белка дистрофина. содержащего правильные спектриноподобные повторы [6]. При атаксии Фридрейха технология CRISPR / Cas9 также успешно использовалась для удаления патогенной экспансии повтора GAA (GAAr) в интроне 1 гена FXN [7]. Однако для обеспечения эффективности и безопасности технологии редактирования генов CRISPR / Cas9 требуется несколько улучшений. Для прямого введения in vivo использовался AAV, поскольку в настоящее время он является лучшим вектором доставки для трансдукции клеток in vivo. Однако этот вектор доставки страдает от проблем, связанных с ограничением упаковки, иммуногенностью и продолжительностью экспрессии трансгена Cas9, что способствует мутациям [9].
Подход, названный "терапия считывания стоп-кодона", был разработан для восстановления экспрессии генов, содержащих преждевременный стоп-кодон (PTC), с помощью аминогликозидов, приводящих к трансляции полноразмерного белка [17,18,19,20,21 ]. Аминогликозиды действуют, связывая центр декодирования рибосом и провоцируя структурные изменения, которые делают возможным спаривание близкой к родственной аминоацил-тРНК с PTC и, таким образом, включение аминокислотного остатка вместо терминации трансляции. [17, 22]. Это привело нас к выводу, что можно подавить экспрессию Cas9, введя PTC и индуцируя его экспрессию в течение выбранного периода, обрабатывая клетки и, в конечном итоге, и пациентов аминогликозидом.
В этой работе мы показали, как амино гликозид G418 можно использовать для индукции экспрессии гена Cas9, содержащего PTC. Контролируемая экспрессия гена Cas9 позволила редактировать гены
DMD и FXN в клетках HEK293T, HeLa или YG8sR. С этой целью мы использовали PCR-направленный мутагенез для введения PTC (т.е. кодона TGA) в последовательности генов от SpCas9 и CjCas9, тем самым подавляя их экспрессию. Затем мы обрабатывали клетки различными дозами аминогликозида (т.е. G418) для стимуляции экспрессии Cas9.
Этот подход, названный CRISPR-SCReT (CRISPR-Stop Codon Read Through), очень перспективен для генной терапии CRISPR, чтобы ограничить вредные эффекты конститутивной экспрессии этой нуклеазы.
Discussion
Векторы AAV широко используются для доставки компонентов CRISPR / Cas9, особенно для редактирования терапевтических генов. Эта система в настоящее время является лучшим средством доставки для переноса или коррекции генов in vivo [27]. Тем не менее, AAV сталкивается с некоторыми проблемами: (1) предел упаковки 4,7 т.п.н., (2) долговременная экспрессия нуклеазы Cas9 представляет собой проблему безопасности, потому что было показано, что она увеличивает расщепления вне мишени [9], и ( 3) индукция иммунной реакции против этого чужеродного белка [28].
Для клинической трансляции идеально подходит упаковка Cas9 и sgRNA в один вектор AAV. Это может обеспечить оптимальную экспрессию Cas9 и sgRNA, чтобы максимизировать эффективность редактирования на мишени и минимизировать требуемую дозу вектора, которая должна быть доставлена [29]. Это можно сделать с помощью CjCas9, который достаточно мал, чтобы доставлять две sgRNA с помощью одного AAV.
Временная экспрессия Cas9 будет более безопасной для многих терапевтических применений. Было предложено несколько белков против CRISPR для контроля активности системы CRISPR [15]. Несмотря на эффективность, их использование потребует дополнительного AAV или вектора с большей полезной нагрузкой. Кроме того, эти чужеродные белки анти-CRISPR могут запускать иммунную реакцию, и, следовательно, их использование потребует устойчивой иммуносупрессии у пациентов на протяжении всей их жизни [30].
Также возможны химические ингибиторы Cas9. Эти небольшие молекулы проницаемы для клеточной мембраны, обратимы, протеолитически стабильны и неиммуногенны. Эти ингибиторы обладают быстрой кинетикой, подавляя активность ферментов всего за несколько минут и позволяя точно контролировать время [31]. Однако эти молекулы не ингибируют синтез нуклеазы Cas9, которая является чужеродным белком, а скорее замедляют ее редактирующую активность. Таким образом, эти химические ингибиторы обладают определенным преимуществом в уменьшении мутаций вне мишени, но они не предотвращают иммунную реакцию против нуклеазы Cas9. Такая иммунная реакция может привести к гибели клеток, экспрессирующих Cas9, которые будут единственными генетически скорректированными клетками [11]. Более того, эти химические ингибиторы необходимо вводить на протяжении всей жизни пациента.
Невирусные методы доставки также могут использоваться для доставки мРНК или белков, которые в конечном итоге будут разлагаться в клетках [32, 33], но их эффективность доставки или их специфичность в отношении определенных тканей в настоящее время низка по сравнению с векторами AAV [9, 34].
Другие исследователи предложили самоотщепление AAV-CRISPR. Они временно контролировали систему экспрессии Cas9 путем слияния Cas9 с сконструированным мутантным человеческим белком FKBP12 (DD-Cas9). Этот дестабилизирующий пептид вызывает быструю деградацию слитого белка протеосомами. Тем не менее, в присутствии синтетического лиганда (Shield-1) пептид и партнер слияния эффективно "защищены" от деградации [16]. Таким образом предотвращается накопление белка SpCas9 и уменьшается количество мутаций вне мишени. Разложение DD-Cas9 полностью зависит от активации протеосом. Однако будет трудно предсказать активацию протеосом в разных типах клеток на разных фазах клеточного цикла, когда ген Cas9 вводят системно in vivo с вектором AAV. Более того, белок DD-Cas9 будет непрерывно продуцироваться и, таким образом, будет производить мутации вне мишени, а также вызывать иммунный ответ, что также приводит к неудовлетворительному результату. Более того, пептид DD (108 аминокислотных остатков) представляет собой дополнительную последовательность, которая должна доставляться AAV, который имеет низкий предел упаковки
Некоторые авторы использовали sgRNA для нокаута гена Cas9 [35]. В этой стратегии, названной стратегией самоограничивающейся цепочки, Cas9 доставлялся с одним ориентиром, нацеленным на ген хозяина, и другой частью, нацеленной на ген Cas9. Интересный подход, но он требует использования другого вектора или вектора высокой емкости, если рассматривать возможность использования двух sgRNA для делеции, как в случае с атаксией Фридрейха. Более того, хотя соединение концов за счет индуцированных NHEJ INDEL, которые могут изменять рамку считывания и генерировать нокауты генов, многие indels будут поддерживать правильную рамку считывания и, таким образом, будет сохраняться экспрессия Cas9. Guo et al. [36] показали, что большинство (до 70%) DSBs, индуцированных Cas9, без ошибок репарируются в клетках млекопитающих, компетентных для классического пути NHEJ. Также возможно, что INDELs, которые поддерживают правильную рамку считывания гена Cas9, модифицируют последовательность Protospacer или соседний с protospacer мотив, таким образом предотвращая любую последующую инактивацию гена Cas9. Таким образом, инактивация Cas9 может быть неполной или потребовать времени.
Другой группе, использующей аналогичную стратегию, самоудаление системы AAV-CRISPR, удалось in vivo снизить на 79% экспрессию SaCas9 в печени, доставив два AAV (то есть один AAV с геном SaCas9 и один AAV с SgRNA, нацеленным на SaCas9 ген) [37]. Однако их попытки разработать единую векторную систему, в которой самоустраняющаяся gRNA коэкспрессировалась в цис-форме с SaCas9, оказались безуспешными. Без единого вектора это может представлять риск того, что некоторые клетки, экспрессирующие SaCas9, не получат саморегулирующуюся gRNA.
В нашем подходе использовалась индуцируемая система редактирования генома с одной молекулой без добавления другого трансгена в систему CRISPR с возможностью активации или инактивации экспрессии нуклеазы. Интересно, что количество нуклеазы, продуцируемой после индукции, достаточно для реализации редактирования гена.
Мы использовали G418 для восстановления в клетках HEK293T, HeLa и YG8sR экспрессии SpCas9 или CjCas9, содержащих нонсенс-мутацию. Аминогликозиды были исследованы как потенциальные "сквозные" терапевтические средства [38]. G418 является наиболее сильным аминогликозидом в отношении активности считывания [26]. Однако некоторые авторы сообщают о нефротоксичности G418 in vivo, и в настоящее время он не используется в клинических условиях в качестве считываемого (readthrough) агента [26].
Для клинического применения можно было бы использовать гентамицин X2, который так же эффективен, как G418, но менее токсичен [26]. Другие авторы идентифицировали молекулы-активаторы, которые могут увеличивать потенциал считывания G418 [39,40,41]. Лучшим из этих соединений является CDX5, который позволяет значительно увеличить эффект считывания G418 до 180 раз по сравнению с G418, используемым в качестве единственного агента [39]. Таким образом, небольшое количество G418 может быть использовано для достижения хорошей эффективности с низкими токсическими эффектами [42]. Также были предприняты усилия по оптимизации активности G418 в качестве индукторов считывания стоп-кодонов с помощью химических модификаций [43].
Нонсенс-опосредованный распад мРНК (NMD) выполняет функцию наблюдения, предотвращая синтез вредного белка, ускоряя оборот мРНК, несущей PTC. При этом NMD снижает экспрессию мРНК, содержащей PTC, ограничивая потенциал антисмысловой супрессивной терапии [44]. Интересно, что мРНК Cas9 ускользает от системы NMD, потому что, не имеет интрона, лишена комплекса соединения экзонов, необходимого для рекрутирования факторов NMD [45].
Природа стоп-кодона имеет решающее значение для эффективности считывания. Мы использовали кодон UGA, который обычно обеспечивает более эффективное считывание, чем кодон UAG, который сам по себе более эффективен, чем UAA [46]. Однако некоторые исследования показали, что стоп-кодон UGA допускает остаточную экспрессию, которая не может быть обнаружена методом вестерн-блоттинга [47]. В наших экспериментах скорость редактирования, обнаруженная с помощью ddPCR на экспрессирующих CjTGA клетках (без G418), составляла менее 0,1%. Потребуются дополнительные эксперименты, чтобы определить, достаточно ли этой утечки экспрессии для индукции иммунной реакции. Для клинического использования было бы идеально полностью исключить экспрессию белка Cas9. Для этого необходимо определить выбор более жесткого стоп-кодона (TGA, TAG или TAA) или более эффективного положения в гене Cas9.
Нуклеотидный контекст может влиять на эффективность завершения трансляции в стимулировании близкой к родственной тРНК и / или ухудшении фактора терминации для связывания с сайтом А рибосомы [46, 48]. В настоящее время не существует правила прогнозирования скорости чтения в зависимости от последовательности рядом со стоп-кодоном. Измерение скорости считывания данной мутации в клетке - единственный ключ, который позволяет предсказать, будет ли она чувствительна к молекулам, обеспечивающим считывание. Определение лучшего сайта для вставки PTC в ген Cas9 для повышения эффективности чтения будет предметом нашей следующей работы.
Следующим шагом будет оценка подхода in vivo; можно было бы определить дозу и время обработки, необходимые для полезного действия. Доза аминогликозида, необходимая для терапевтического введения гена-мишени с помощью Cas9, может зависеть от гена-мишени и от ткани, в которой должна быть произведена модификация. Большое преимущество в лечении пациента аминогликозидом то, что он может повторно использоваться несколько раз (возможно, в более высоких дозах) до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое клиническое улучшение.
Временный контроль, который требуется для всех лекарств, также важен для системы CRISPR / Cas9. Наши результаты показывают, что можно контролировать экспрессию SpCas9 и CjCas9 с помощью метода CRISPR-SCReT. Этот подход очень многообещающий для генной терапии, чтобы предотвратить устойчивую экспрессию Cas9 и снизить вероятность мутаций вне мишени и иммунной реакции против этого чужеродного белка.