Идентификация мышечной дистрофии как первичного заболевания мышц произошла в 19 веке, и это отличало мышечные дистрофии от заболеваний, при которых мышечная слабость была вторичной по отношению к заболеванию двигательных нейронов и их корешков [1]. DMD относится к этому семейству заболеваний и является смертельным заболеванием с истощением мышц, которое поражает 1 из 5000 новорожденных мужского пола [2]. Заболевание было первоначально описано Edward Meryon (1807-1880) и отмечено Emery как мышечное заболевание, при котором нарушается целостность сарколеммы [3]. Meryon наблюдал за девятью мальчиками из трех разных семей и отметил некоторые клинические проявления прогрессирующего истощения мышц, такие как увеличение икроножных мышц [1]. Позднее болезнь была более подробно описана Гийомом Б.А. Дюшенном де Булонь (Guillaume B.A. Duchenne de Boulogne )(1806-1875), который провел комплексное обследование первого пациента с "прогрессирующей мышечной атрофией с дегенерацией" (которая впоследствии получила название мышечной дистрофии Дюшенна) [1]. По мере проведения дальнейших патологических исследований Дюшен де Булонь изменил первоначальное описание болезни на "псевдогипертрофический мышечный паралич" или "миосклеротический паралич" [1]. Позднее сэр William Richard Gowers дополнил клиническую картину DMD, сообщив о наследственном характере заболевания, преимущественном поражении мужчин и характерном способе, с помощью которого пациенты поднимаются с пола в положение стоя (так называемый "признак Gower's") [4].

В одном из первых использований новой молекулярной генетики позиционного клонирования Koenig и др. обнаружили ген DMD, связанный с фенотипом заболевания [5]. Белковый продукт гена DMD был назван дистрофином [6]. Прогрессирующее Х-сцепленное заболевание носит дегенеративный характер, и пациенты становятся прикованными к инвалидной коляске в подростковом возрасте. Помимо дыхательной недостаточности и легочной инфекции, кардиомиопатия также вносит большой вклад в раннюю смерть пациентов с DMD [7]. В предыдущие десятилетия пациенты с DMD умирали в подростковом возрасте, однако использование респираторной и кардиологической поддержки способствовало увеличению продолжительности жизни и выживанию пациентов даже до 30 лет [8]. Сочетание физиотерапии и кортикостероидов также помогло улучшить качество жизни пациентов; тем не менее, эти паллиативные методы лечения не являются лечением. Выживание пациентов в четвертом десятилетии - редкость [9, 10].

Ген DMD - один из крупнейших белок-кодирующих генов в геноме человека, занимающий более 2,6 млн пар оснований с 79 экзонами, которые кодируют семейство изоформ белка дистрофина [11]. Большой размер гена делает его подверженным мутациям, таким как делеции (около 60%), дупликации (около 6%), транслокации и точечные мутации, которые нарушают рамку считывания и в конечном итоге приводят к синтезу аномальных усеченных фрагментов дистрофина [11]. Большая в 427 кД изоформа дистрофина скелетных и сердечных мышц является цитоплазматическим сарколемным белком, который связывает внеклеточный матрикс (ECM) и кортикальный цитоскелет [12]. Дистрофин широко экспрессируется в скелетных, сердечных и гладких мышцах, а также в небольшом количестве в определенных местах в ЦНС [13, 14]. Дистрофин локализуется на сарколемме посредством дистрофин-ассоциированного белкового комплекса (DAPC) (рис. 1) [12].



Fig. 1 Full length dystrophin and dystrophin-associated protein complex (DAPC). The dystrophin protein contains an actin binding domain (which is also the N-terminal domain), a rod domain made of 24 spectrin repeats (labelled R), four hinges (labelled H1-H4), a cysteine-rich domain and a C-terminal domain. Dystrophin is attached to the DAPC via the cysteine-rich domain (which bind dystroglycan) and C terminus (which bind syntrophins and dystrobrevin), linking the internal cytoskeleton and extracellular matrix (12) (13). R16 and R17 contains nNOS binding site that is important for localisation of nNOS at the sarcolemma (19).

Структурная роль, которую дистрофин играет, связывая цитоскелет с ECM, как полагают, позволяет передавать силу от сократительных элементов внутри клетки к структурам внеклеточного матрикса, одновременно поддерживая целостность мышечных волокон [15]. Синтрофины (Syntrophins) рекрутируют множество белков к DAPC (показан на рис. 1), а также нейрональную синтазу оксида азота (nNOS) к сарколемме [16]. Стержневой домен дистрофина также содержит домен связывания nNOS (R16 и R17), который необходим для локализации nNOS на сарколемме [17, 18]. Считается, что этот феномен обеспечивает немедленную диффузию оксида азота в кровеносные сосуды для содействия расширению сосудов в сокращающихся мышцах, обеспечивая достаточное снабжение кровью [19]. Было предположено, что де-локализация nNOS из-за отсутствия функционального дистрофина вызывает (i) функциональную ишемию и (ii) nitrosative стресс, который повреждает клетки, снижая продукцию силы в мышце [19].

DAPC состоит из множества трансмембранных, цитоплазматических и внеклеточных белков, и у пациентов с DMD отсутствие функционального дистрофина дестабилизирует DAPC [20, 21]. Клеточная передача сигналов, опосредованная дистрофин-гликопротеиновым комплексом, также нарушается из-за потери дистрофина [22]. Многие белки, входящие в состав DAPC, включая альфа-дистробревин, саркогликан, дистрогликан и саркоспан, являются важными компонентами клеточной передачи сигналов, поддерживающей здоровое функционирование и развитие мышц [10], и при мутациях ассоциируются с различными мышечными дистрофиями.

В отсутствие функционального дистрофина в скелетных и сердечных мышцах нарушается целостность мембраны мышечных клеток (также известной как сарколемма), что делает мышечные волокна более подверженными повреждениям, вызванным сократительной активностью [23]. Отсутствие функционального белка дистрофина вследствие мутаций в гене DMD приводит к прогрессирующему истощению мышц у пациентов, с потерей миофибрилл и замещением их жировой и фиброзной тканью [24].

Одна из менее тяжелых форм дистрофинопатий называется Becker muscular dystrophy (BMD) [8]. Как и DMD, BMD также вызывается мутациями в том же Х-сцепленном гене, однако заболевание протекает гораздо мягче, чем DMD, и возраст начала BMD может достигать 30-40 лет [25]. При BMD рамка считывания транскрипта, фланкирующая мутации, не нарушается, но аберрантные транскрипты кодируют более короткие формы дистрофинов, которые частично и вариабельно функциональны, и часто со сниженной экспрессией и/или стабильностью [11]. Гипотеза "рамки считывания" предполагает, что у пациентов с делеционными мутациями при BMD вырабатываются полу-функциональные, с внутренней делецией белки дистрофина, что приводит к менее тяжелой форме дистрофинопатии [26]. В одном из поразительных случаев был выявлен 61-летний пациент с BMD, который все еще передвигался, несмотря на то, что 46% кодирующей информации было потеряно в результате делеции в гене DMD [25]. С другой стороны, гипотеза "рамки считывания" предполагает, что у пациентов с DMD вырабатывается усеченный белок, который нестабилен и вызывает более тяжелую форму дистрофинопатии [26]. Анализ 258 независимых делеционных мутаций в локусе DMD/BMD показал, что в 92% случаев существует корреляция между фенотипом и типом делеционных мутаций; и на самом деле, многие "внутрикаркасные" делеции гена DMD не обнаруживаются, поскольку люди с такими мутациями либо бессимптомны, либо имеют клинические признаки, не связанные с DMD/non-BMD [26]. Этот вывод не только интригует, предполагая, что размер делеций в гене DMD не обязательно связан с тяжестью заболевания, но и открывает возможность манипулирования и инженерии большого транскрипта DMD в нескольких стратегиях генной терапии и анти-смысловой терапии для восстановления функции мышц у больных.

Первоначально AAV был случайно обнаружен в препарате аденовируса обезьян [27], вскоре было установлено, что он присутствует в тканях человека [28]. В яслях (младенцы в возрасте от шести месяцев до трех лет) в Junior Village, Вашингтон, округ Колумбия, которые часто заражались различными серотипами аденовирусов, появилась возможность выделить и охарактеризовать штаммы AAV человеческого происхождения [28]. Путь к пониманию базовой биологии AAV было вызвано исключительно научным любопытством, т.к. в то время, когда потенциал этого вируса в качестве вектора генной терапии был неизвестен [29]. Девятнадцать лет спустя, в 1984 году, AAV был векторизован с целью переноса генов [30]. Через 11 лет после этого, в 1995 году, вирусный вектор был впервые использован для лечения пациента с муковисцидозом [31]. Если забежать вперед, то в 2012 году EMA одобрила первый препарат генотерапии на основе AAV Glybera для лечения дефицита липопротеинлипазы [32], затем в 2017 году FDA одобрило Luxturna для лечения наследственного заболевания сетчатки [33], а в 2019 году FDA одобрило Zolgensma для лечения спинальной мышечной атрофии [34].

Дальнейший прорыв в этой области произошел, когда Samulski с коллегами описали метод производства рекомбинантных AAV (rAAV) с использованием так называемой двухплазмидной системы, в которой конечная вирусная структура не содержала AAV дикого типа (wtAAV) [35]. В этой системе гены rep и cap в геноме wtAAV заменяются на интересующие гены для получения rAAV [36]. Однако инвертированные терминальные повторы (ITR) вируса необходимы в цис-положении для репликации и упаковки rAAV [37], и поэтому ITR являются единственными последовательностями происходящими из wtAAV, которые включаются в rAAV [29]. Гены rep, cap и гены помощники вируса передаются в trans-положении [37]. Важно отметить, что в отличие от wtAAV, рекомбинантные AAV не подвергаются сайт-специфической интеграции в локус AAVS1 хромосомы человека, и большая часть геномов rAAV существует как вне-хромосомные эписомы в трансдуцированных клетках [38]. Очень надежным и популярным методом получения rAAV является трансфекция плазмид адгезивных клеток эмбриональной почки человека 293 (HEK293), при которой трансген между ITRs доставляется в цис-положение, а гены rep, cap и хелперы - в транс положении [29]. Модифицированная версия этого метода - суспензионная культура HEK293, которая позволяет быстро производить rAAV и увеличивать выход, что очень важно для клинического применения [39]. После производства rAAVs очищают с помощью колоночной хроматографии или градиентного центрифугирования; стоит отметить, что чистота отличается в зависимости от используемого метода, что может повлиять на результаты доклинических и клинических исследований [40].

Разнообразие и встречаемость многочисленных серотипов AAV в тканях человека и нечеловеческих приматов впервые было выявлено в исследованиях, проведенных Gao и другими [41]. Эпидемиологические исследования показывают, что 40-80% человеческой популяции содержат антитела против AAV, это указывает на предыдущий контакт с вирусом, а некоторые серотипы AAV, AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 и AAV9, являются эндемичными для человека [29].

Различия между исследованиями создают определенные трудности в точном установлении тканевого тропизма серотипов AAV [42]. Тропизм вирусных капсидов в значительной степени обусловлен наличием соответствующих вирусных рецепторов на клетках-мишенях, которые могут различаться у разных видов [43, 44]. Разница в экспрессии рецепторов у разных видов вызывает вариации в потенции различных капсидов AAV, и этот факт иногда упускается из виду в трансляционных исследованиях [44].

Длина кодирующей последовательности мРНК ORF гена DMD составляет около 11,5 кб, и такой большой размер представляет собой огромную проблему при разработке методов терапии по переносу генов [19]. Однако наблюдения, проведенные на пациентах с BMD, показали, что перенос полноразмерного ORF дистрофина может быть необязательным при разработке генотерапии, а фенотип заболевания может быть облегчен с помощью меньшей генной конструкции [25]. Хотя AAV обладают многими желательными качествами для использования в генотерапии мышц, этот маленький вирус способен упаковывать геномы и трансгены только ограниченного размера (соотв. ~4.7 kb и ~4.5 kb) [45-47].

Доступность полноразмерной последовательности дистрофина и знание соответствующих белковых доменов позволили ученым разработать дизайн осторожного удаления некоторых кодирующих последовательностей в гене, стремясь при этом максимально сохранить функцию белка. В результате были созданы рекомбинантные гены, кодирующие множество вариантов мини-/микродистрофинов с клиническим потенциалом [9, 48-50] (рис. 2). Крупные животные модели DMD показали значительные патофизиологические улучшения после системной доставки разработанных микродистрофинов с помощью AAV, что привело к клиническим испытаниям на людях [19]. Успешная одной дозой терапия по замене генов при спинальной мышечной атрофии (СМА) с использованием AAV с дозой до 2,0 x 10¹⁴ vg на килограмм обеспечила доказательство принципа системной передачи генов с использованием AAV у людей [19, 51]. В настоящее время в США проводятся три клинических испытания, организованные компаниями Sarepta Therapeutics, Pfizer и Solid Biosciences, в каждом из которых используются несколько иные конструкции мини/микро-дистрофина, доставляемые с помощью AAV разного серотипа (rh74 и AAV9 соответственно, рис. 2). Еще одно клиническое исследование в Европе с использованием AAV8-микродистрофина компанией Genethon в сотрудничестве с Sarepta Therapeutics началось в апреле 2021 года, где первому пациенту был введен исследуемый препарат генотерапии GNT 0004 [52-54]. Стоит также отметить, что стратегия лечения генотерапии AAV-микродистрофином применима ко всем пациентам с DMD, независимо от того, какие мутации они несут в своем гене DMD.



Fig. 2 Clinically relevant miniaturised dystrophin constructs. (Top) The promoters utilised in the therapeutic constructs are shown by yellow arrows. These promoters are shown to be muscle and heart specific and will preferentially express the transgene in those tissues. The transgene of all the constructs contain the coding sequence for protein domains that are clinically relevant and functional. The AAV serotype of choice is also based on tissue tropism, where they are muscle and heart tropic. Clinical constructs for Sarepta Therapeutics (in partnership with Roche), Pfizer, Solid Biosciences and Genethon adapted from (48) (49) (50) and (9) respectively. ABD: Actin-binding domain; H: hinge; R: rod; CRD: cysteine-rich domain; CTD: C-terminal domain. (a) The localisation of microdystrophin-1 (MD1) protein (utilised by Sarepta Therapeutics and Genethon) to the DAPC. (b) The localisation of mini-dystrophin protein utilised by Pfizer to the DAPC. There remains a possibility of the recruitment of nNOS to the sarcolemma by the mini-dystrophin via an unknown mechanism (114) (115). (c) The localisation of microdystrophin protein utilised by Solid Biosciences to the DAPC.

В ходе клинических испытаний были получены некоторые обнадеживающие данные, в частности от компаний Sarepta Therapeutics и Pfizer (Таблица 1). Эти данные являются принципиальным доказательством того, что перенос генов AAV для воздействия на мышцы человека возможен с клинической и производственной точки зрения [55]. Несмотря на то, что перевод в клинику был возможен и успешен во многих ситуациях [32-34], все еще предстоит решить ряд вопросов для полной оптимизации дозировки, иммунного контроля и проблем производства и поставок в генотерапии DMD с помощью AAV.

Table 1 Clinical trial history and early data on outcomes of the AAV-microdystrophin trials

У пациентов с DMD с мутациями в гене DMD вырабатывается нефункциональный белок дистрофин; однако у некоторых пациентов рамка считывания может быть восстановлена для получения частично функционального белка дистрофина [11]. Важно отметить, что эта стратегия лечения зависит от мутации, и отдельные стратегии удаления экзонов применимы только к небольшому числу пациентов с DMD. Тем не менее, в совокупности с несколькими лекарственными препаратами, стратегия пропуска экзонов потенциально может вылечить до 60% пациентов с DMD. На сегодняшний день четыре анти-смысловых олигонуклеотидных препарата с использованием специфического морфолино (PMO) были одобрены Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) для лечения DMD, нацеленные на экзон 51 (ExonDys-51), экзон 53 (VyonDys-53 и Viltolarsen) и экзон 45 (AmonDys-45); однако эти препараты имеют очень скромные результаты лечения (варьирующее увеличение уровня дистрофина на 0,4-5% после многих недель лечения) [55]. Еще один AON с другим химическим составом, нацеленный на экзон 51 (Дрисаперсен), был остановлен в разработке, так как не смог получить разрешение FDA и продемонстрировал очень низкий клинический эффект и значительную токсичность [56]. Хотя точный механизм неудачи препарата неизвестен, высокие дозы препарата с химией 2'-OMePS AON и способ доставки подкожно могли способствовать возникновению опасной для жизни токсичности [57, 58]. Другой анти-смысловой препарат Spinraza с химическим составом 2'-OMOEPS, доставляемый интратекально для лечения спинальной мышечной атрофии (SMA), был эффективен и одобрен FDA. Метод интратекальной доставки мог привести к повышению эффективности доставки препарата в центральную нервную систему [59].

Экзон 2 DMD является одним из наиболее часто дуплицируемых экзонов, приводящих к образованию неправильного белка дистрофина [60]. Для этой мутации дуликации гена DMD пропуск экзона может восстановить рамку считывания для производства полноразмерного дистрофина. Эта стратегия в настоящее время исследуется компанией Audentes Therapeutics, где вектор AAV используется для доставки четырех копий модифицированной small nuclear RNA (snRNA) U7, которая содержит антисмысловые последовательности, нацеленные на доноры сплайсинга (2 копии) и акцепторы сплайсинга (2 копии) экзона 2 гена DMD [60, 61]. Данные трехмесячного пост-инфузионного исследования у первых двух испытуемых, получивших дозу вектора 3,0 х 10¹³ vg/кг показали экспрессию, по-видимому, полноразмерного белrtf дистрофина и стабильные или улучшенные функциональные результаты.

Редактирование генома позволяет исправлять мутации на уровне ДНК для производства функционального белка дистрофина [62]. Нуклеаза Clustered Regular Interspaced Palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 [CRISPR/Cas9] используется для создания двунитевых разрывов (DSB) в определенных последовательностях ДНК [63]. Затем активируется клеточный механизм репарации ДНК для восстановления DBS либо посредством негомологичного соединения концов (NHEJ), либо посредством гомологично направленной репарации (HDR) [64]. Путь NHEJ более подвержен ошибкам, так как при соединении разрывов ДНК возникают небольшие вставки или делеции, которые могут быть использованы для (i) нарушения геномных последовательностей или (ii) направленной делеции, когда DSBs возникают на каждом конце целевой последовательности, которая удаляется, когда NHEJ обеспечивает соединение концов [64]. С другой стороны, HDR - это более точный путь, где гомологичная донорская матрица используется для репарации повреждения с целью восстановления исходной последовательности; однако этот подход не нашел широкого применения при DMD, поскольку это редкое событие, особенно в пост-митотических клетках [65]. В контексте DMD технология редактирования генома направлена на получение полноразмерного белка дистрофина; однако, если в гене имеются большие делеции, то будет получен усеченный, функциональный белок дистрофина [62]. Несмотря на то, что многие исследования in vitro и на моделях мышей mdx и собак с DMD были успешными в восстановлении функционального усеченного дистрофина, подход редактирования генов имеет множество недостатков, таких как: (i) очень низкая эффективность при удалении нескольких экзонов, (ii) недостаточная эффективность доставки системы CRISPR-Cas9 in vivo, (iii) возможная необходимость повторных процедур, и (iv) проблемы безопасности в отношении нецелевого воздействия активности Cas9 [55]. На сегодняшний день клинических испытаний с использованием методов редактирования генома для лечения DMD не проводилось. Тем не менее, следует отметить, что поскольку CRISPR-терапия может эффективно редактировать мышечные стволовые клетки, возможно, что повторная терапия не потребуется [66, 67]. Однако иммунитет к Cas9 является серьезной проблемой для CRISPR-терапии [68].

Несмотря на то, что мышиные модели были чрезвычайно полезны для доказательных исследований, они не отражают масштабы потенциального иммунного ответа, вызванного доставкой AAV, и часто не вызывают опасений по поводу безопасности исследований [19]. Первый барьер, создаваемый иммунной системой, направлен против капсида rAAV, как и wtAAV, путем выработки нейтрализующих антител (NAbs), которые в конечном итоге препятствуют доставке генов с помощью rAAV [29]. Приблизительно 80% человеческой популяции, по оценкам, являются серо-позитивными к AAV из-за естественного воздействия вируса [69], что позволит им выработать NAbs после такого воздействия [70]. Таким образом, иммуногенность вектора может быть обусловлена такими уже существующими нейтрализующими антикапсидными антителами, а также клетками, которые были успешно трансдуцированы rAAV, где капсидные антигены rAAV отображаются на комплексе MHC-I, вызывая цитотоксический ответ CD8+ Т-клеток [40]. Хотя исследования на мышиных моделях показали многообещающие результаты, капсид AAV и трансгенный продукт, однако, похоже, вызывают цитотоксический Т-клеточный ответ в более крупных моделях животных, таких как собаки [71], которые являются лучшими и более чувствительными моделями для прогнозирования потенциальных неблагоприятных иммунных реакций против генотерапии AAV [62].

Системная доставка генов AAV в высоких дозах от 10¹³ до 10¹⁴ векторных геномов/кг также вызвала активацию врожденного иммунного ответа в крупных животных моделях [19]. В одном исследовании на модели собак с дефицитом дистрофина в неонатальном возрасте двух щенков, которых лечили в 4-дневном возрасте, пришлось эвтаназировать в возрасте 16 недель, так как наблюдалась токсичность, связанная с врожденным иммунным ответом [72]. Еще один тревожный сигнал поступил из исследований на ювенильных нечеловеческих приматах (NHP) и поросятах, где все три поросенка и один NHP были эвтаназированы из-за наблюдаемой токсичности, а у оставшихся двух NHP наблюдался повышенный уровень трансаминаз (фермента печени) и тромбоцитопения (дефицит тромбоцитов в крови) [73]. Важно также отметить, что ни одно из этих исследований не предоставило убедительных доказательств, подтверждающих клеточный иммунный ответ [19].

Детерминанты иммуногенности векторов AAV все еще неясны, но вероятность того, что AAV вызовет иммунный ответ, высока, и ее не следует недооценивать [74]. Если доставка AAV вызывает иммунный ответ, опосредованный cytotoxic T lymphocyte (CTL), это приведет к кратковременной экспрессии генов [74, 75]. Такой CTL-опосредованный иммунный ответ после трансдукции AAV, приводящий к устранению трансдуцированных клеток, будет представлять проблему в клинических условиях, поскольку эффективная генная терапия требует стабильной и долгосрочной экспрессии терапевтического гена [29, 74]. В случае AAV, нацеленных на скелетные мышцы, эффект CTL-опосредованного иммунного ответа может быть не таким пагубным, как считалось ранее, благодаря роли, которую играют регуляторные T (Treg) клетки в подавлении эффекта CTL [76]. В исследовании Mueller и др., 2013 [76], также сообщалось о стойкой, долгосрочной экспрессии трансгенов в течение 12 месяцев, и поэтому иммуномодуляция популяций Т-клеток может не потребоваться для направленной доставки генов AAV в мышцы. Кроме того, здоровые клетки скелетных мышц имеют низкую экспрессию MHC I, что также может способствовать снижению иммунного ответа, опосредованного Т-лимфоцитами [74]. В другом клиническом случае образцы скелетных мышц пациента с тяжелой формой гемофилии B, которому ввели человеческий фактор IX, кодируемый AAV, оказались положительными на фактор IX через 10 лет после лечения [77].

После введения AAV врожденная иммунная система также может спровоцировать пагубный адаптивный иммунный ответ через toll-like receptor 9 (TLR9)-MyD88 путь [78]. Активация пути TLR9-MyD88 может привести к цитокиновому шторму, который индуцирует выработку интерферонов I типа [79]. TLR9 является pathogen recognition receptor (PRR), который связывается с неметилированными кластерами CpG-последовательностей, а содержание CG значительно повышено в кодон-оптимизированных геномах векторов AAV [80]. Показано, что само-комплиментарные геномы вызывают более сильный TLR9-зависимый иммунный ответ в зависимым от дозы способом [81]. Такой дозозависимый врожденный иммунный ответ в конечном итоге инициирует адаптивный иммунный ответ против вирусного капсида и против трансгена [81]. Удаление CpG из геномов векторов rAAV [82] и усовершенствование стратегии производства векторов путем искусственного увеличения метилирования CpG может облегчить эти проблемы, связанные с врожденным иммунным ответом против AAV [80].

Барьер, создаваемый NAbs, потенциально может быть преодолен с помощью некоторых из разрабатываемых в настоящее время стратегий, таких как плазмаферез, капсидная инженерия и использование пустых капсидов в качестве приманок [29]. Тем не менее, исключение серо-позитивных пациентов из испытаний в настоящее время является единственной практической стратегией в преодолении проблем, связанных с NAbs [19]. В случае DMD глюкокортикостероиды (ГК), которые широко используются в качестве стандарта лечения [83], также помогают справиться с некоторыми осложнениями со стороны иммунной системы благодаря иммуномодулирующей активности этих препаратов [84].

Высокие дозы вектора при генотерапии AAV потенциально могут вызвать нежелательные иммунные реакции, однако такие высокие дозы также эффективны для устранения фенотипа заболевания [72]. Генотерапия AAV в собачьей модели Х-сцепленной миотубулярной миопатии (МТМ) показала значительное улучшение мышечной силы и выживаемости собак в зависимой от дозы манере, где самый высокий уровень выживаемости наблюдался в группе, получавшей самую высокую дозу rAAV, экспрессирующую терапевтический ген myotubularin (МТМ1) [85]. Однако высокая доза капсида может также вызвать нежелательный иммунный ответ, поэтому для хорошего клинического результата необходимо достичь баланса между дозой капсида и терапевтической эффективностью [74]. Недавнее клиническое исследование генотерапии МТМ с использованием AAV8 показало три случая смерти в группе с высокой дозой, что еще раз подтверждает необходимость тщательного управления дозой вектора для обеспечения безопасности и терапевтической эффективности [86]. Это также напоминает о том, что как в положительном, так и в отрицательном смысле наиболее важные данные в области генотерапии действительно получены в ходе исследований на людях, поскольку доклинические исследования имеют некоторые ограничения в определении полного эффекта лечения.

Выбор подходящего серотипа AAV для воздействия на соответствующие ткани также имеет решающее значение для клинического результата, поскольку он может непосредственно влиять на дозу, необходимую для лечения. Следует также быть осторожным, поскольку некоторые серотипы AAV, которые эффективно трансдуцируют ткани в одном штамме мышей, могут не показать аналогичный профиль трансдукции в другом штамме мышей, не-человекообразных приматах или людях, возможно, из-за молекулярных различий между штаммами и видами [87]. В случае переноса мышечных генов, ранее наиболее часто используемым способом введения векторов AAV была прямая внутримышечная (IM) инъекция [71]. Однако многочисленные исследования показали, что большие дозы векторов, введенные в одно место, например, в мышцу, могут потенциально вызвать иммунный ответ против трансгена [75]. С годами способ доставки меняется: в настоящее время планируются и проводятся клинические испытания на людях с использованием системного внутрисосудистого (IV) введения для доставки продуктов генотерапии [9, 62, 72, 88, 89]. Внутривенный (IV) способ доставки вектора в принципе позволяет осуществлять трансдукцию по всему организму, что необходимо для любой комплексной генотерапии мышечных заболеваний, затрагивающих все или многие из 700 мышц человека. Однако большая доза вектора, доставленная системно, потенциально может вызвать серьезные врожденные и адаптивные иммунные реакции против вирусного капсида [75]. Поэтому необходимо тщательно планировать, выбирать и проводить испытания на безопасность при увеличении дозы вектора. Однако обычная эскалация дозы проблематична, поскольку пациенты, получающие субклинические дозы, могут стать иммунизированными и, таким образом, не подходить или быть невосприимчивыми к последующему клиническому дозированию. Это сложная этическая проблема, поэтому необходим тщательный подбор дозировки для ранней фазы клинических испытаний на основе доклинических данных, чтобы обеспечить безопасность пациентов, которые, тем не менее, могут получить пользу.

Возникли опасения по поводу генотоксичности, поскольку при определенных обстоятельствах, похоже, существует зависимая от дозы корреляция между доставкой генов AAV и гепатоцеллюлярной карциномой (ГЦК), что указывает на то, что увеличение дозы AAV может повысить генотоксичность [90]. Теоретически, как wtAAV, так и rAAV, содержащие трансгены, могут интегрировать часть или весь свой геном в геномную ДНК хозяина, возможно, нарушая или активируя онкогены и таким образом предрасполагая пациентов к возникновению рака [91]. Однако это генотоксическое явление при использовании векторов AAV, по-видимому, более выражено в моделях грызунов и не очень заметно в моделях более крупных животных, таких как собаки и не-человекообразные приматы [40]. У пациентов в клинических испытаниях гемофилии-B, получивших генную терапию AAV (более 9 лет после переноса генов), до сих пор не развилось никаких опухолей [92]. Исследования, изучающие местоположение событий интеграции, происходящих из генома rAAV, также сообщили об отсутствии генотоксичности системно вводимых rAAV у не-человекообразных приматов и людей [93]. Хотя до сих пор не было высказано никаких опасений по поводу генотоксической безопасности у людей, это риск, который должен оставаться на слуху в исследованиях генотерапии AAV, и по-прежнему рекомендуется длительный период наблюдения [40].

Стабильная, долгосрочная экспрессия трансгена является ключевым фактором в достижении терапевтической эффективности после генотерапии AAV, и это еще более важно при хронических заболеваниях, таких как DMD, требующих постоянной экспрессии модифицированного дистрофина [19]. Самыми большими проблемами в обеспечении постоянной экспрессии трансгена являются регенерация мышц, характерная для заболевания, и иммунные реакции на капсид AAV и трансген. Иммуносупрессия может частично устранить иммунные реакции, также могут быть полезны и другие подходы для предотвращения иммунных реакций, такие как индукция толерантности [44]. В пост-митотических и медленно реплицирующихся тканях взрослого человека может быть достигнута персистенция, и при переносе наблюдений, полученных в исследованиях на животных моделях, на человека необходимо учитывать различия в скорости оборота различных тканей у разных видов [40]. Было показано, что в здоровых мышцах AAV-опосредованная доставка трансгенов может сохраняться более десяти лет. Однако при DMD, если экспрессия трансгенов ниже порога, необходимого для профилактики заболевания, то дегенерация и регенерация миофибрилл приведут к постепенному уничтожению эписомальных трансгенов и экспрессии микродистрофина. В дополнение к этим соображениям при DMD существует требование трансдукции в мышцы и сердце почти всего тела, а также опосредованного миобластами роста пациентов, получающих лечение в раннем возрасте. Таким образом, весьма вероятно, что потребуется повторное использование любой генотерапии DMD. Однако необходимый интервал между процедурами и механизм управления присутствием циркулирующих AAV NAbs, индуцированных первичным лечением, еще предстоит определить [19].

DMD является смертельным педиатрическим генетическим заболеванием, и до сих пор не существует лекарства от этого заболевания. Многие терапевтические стратегии тестируются в клинических испытаниях, но генотерапия AAV показывает наиболее многообещающий успех на сегодняшний день [94, 95]. Генотерапия AAV также обладает потенциалом лечения большинства пациентов с DMD независимо от нарушений генотипа. Поскольку перенос генов микродистрофина с помощью AAV доказал свою эффективность в доклинических моделях и относительную безопасность в ранних клинических испытаниях [55], в настоящее время исследования направлены на успешный перевод этого ATMP в клинику, изучение вопросов, касающихся уровней дозы, повторного лечения, иммунной модуляции, производства и поставок в фармацевтических масштабах.

В генотерапии AAV еще предстоит решить несколько проблем, одна из которых - потенция и эффективность [40]. Системный характер DMD, требующий восстановления дистрофина во всем организме, также означает, что для лечения этого заболевания может потребоваться высокая доза AAV. Хотя AAV является безопасным вирусом, он все же может вызывать неблагоприятные иммунные реакции при высоких дозах [74]. Это снижает эффективность лечения. Более мощная кассета для экспрессии генов теоретически означает, что для достижения терапевтического эффекта потребуется меньше вируса. Одним из способов усиления экспрессии генов является добавление в кассету экспрессии генов регуляторных элементов, таких как новые промоторы и интроны [96]. Помимо того, что терапия станет более безопасной из-за снижения вероятности провоцирования иммунной системы, более мощная кассета экспрессии генов также будет способствовать решению проблемы крупномасштабного производства AAV, поскольку для лечения каждого пациента потребуется меньше вируса. Это, в свою очередь, может снизить стоимость терапии, поскольку в настоящее время даже самый "дешевый" препарат генотерапии AAV имеет шестизначную цену.

С тех пор как более 20 лет назад было впервые заявлено о перспективности клинической генотерапии с помощью rAAV, постоянно ведется работа по созданию и выделению новых капсидов AAV с новыми свойствами [29]. Поскольку генотерапия AAV активно продвигается к клиническим испытаниям на людях, существует постоянная необходимость и желание улучшить свойства вируса с точки зрения эффективности трансдукции, тропизма тканей и иммуногенности [97]. В случае DMD серотип AAV, который является мышечно-тропным и преимущественно переносит гены в мышечные клетки, был бы идеальным [98], особенно потому, что в настоящее время для лечения DMD требуется высокая доза для достижения трансдукции по всему организму. Доставка терапевтических конструкций с помощью специфических для мышц AAVs улучшит клинические результаты лечения. Кроме того, для лечения потребуется меньшая доза, что снизит потенциальный иммунный ответ, а также неизбежно снизит стоимость лечения.

Следует отметить, что в эффективности системной трансдукции AAV могут существовать плохо изученные и даже, возможно, пока не идентифицированные различия, связанные с возрастом, массой тела или полом. Например, в контексте генотерапии СМА эффективность, наблюдаемая у новорожденных, по-видимому, снижается при лечении более поздних форм [99]. В контексте генотерапии DMD основной орган-мишень, скелетная мускулатура, подвергается прогрессирующему истощению, уменьшению и фиброзному ремоделированию по мере старения пациентов [100]. Более того, влияние соответствующих иммунных реакций также может меняться с возрастом в когортах пациентов. В настоящее время ГК регулярно используются профилактически или реактивно для контроля повышенных сывороточных уровней ферментов-маркеров печени, которые обычно считаются результатом аутоиммунной реактивности на гепатоциты, трансдуцированные AAV, и, по-видимому, являются успешной стратегией у молодых пациентов. В настоящее время также проводится оценка нескольких альтернативных схем иммуномодулирующих препаратов для подавления существующего или дозореактивного иммунитета к AAV, что может позволить первичное дозирование у AAV-серо-позитивных людей или повторное дозирование генной терапии [101, 102]. Предотвращение, обход или контроль неблагоприятного иммунитета - это область продолжающихся исследований как в клинических условиях, так и в системах на животных моделях, которая имеет решающее значение для будущего развития области генотерапии AAV в целом. Кроме того, несмотря на то, что современные микродистрофины, находящиеся в клинических испытаниях, показали высокую эффективность на грызунах и собачьих моделях DMD [9, 50, 103], а также признаки безопасности и некоторой клинической пользы у людей (табл. 1), остается формальная возможность того, что они окажутся менее эффективными в контексте клинических испытаний на людях. Только время покажет, но кажется маловероятным, что нынешние AAV-микродистрофины и нынешние режимы введения доз приведут к полной ремиссии заболевания.

Область генотерапии AAV расширяется экспоненциально, и мы находимся только в начале важной эры [29]. Другие методы лечения, такие как пропуск экзонов, считывание стоп-кодона, новые стероиды, противовоспалительные и анти-фиброзные средства, также могут оказаться полезными, хотя иногда только для части пациентов с DMD, несущих определенные мутации, но, тем не менее, существует реальный потенциал комбинации методов лечения для достижения большей клинической эффективности.