Посещений:
БУЛЕЗНЫЙ ЭПИДЕРМООЛИЗ и др. ГЕНОДЕРМАТОЗЫ



Заместительная генотерапия

Gene Replacement Therapies for Genodermatoses: A Status Quo
Ulrich Koller* and Johann W. Bauer
Front. Genet., 30 April 2021 | https://doi.org/10.3389/fgene.2021.658295



Буллезный эпидермолиз (Epidermolysis bullosa (EB)) - это генодерматоз, характеризующийся образованием обширных волдырей и повреждений на коже и слизистых оболочках при минимальной механической травме. Заболевание вызывается мутациями в генах, кодирующих белки, которые необходимы для стабильности кожи. Функциональное нарушение, снижение или отсутствие одного из этих белков приводит к хрупкости кожи из-за снижения связи между дермой и эпидермисом. В настоящее время генотерапия представляет собой единственный метод лечения, способный излечить это тяжелое заболевание кожи с волдырями. Две перспективные формы генотерапии потенциально применимы при EB: замена генов и редактирование генома. В то время как редактирование генома при генодерматозах остается на доклинической стадии, подходы к замене генов являются клинически продвинутыми и уже были применены к небольшому числу пациентов с функциональной и дистрофической формами EB. В этом случае вирусная трансдукция трансгена "дикого типа" в стволовые клетки кожи с последующей аутологичной трансплантацией исправленных эпидермальных клонов привела к регенерации более стабильной кожи. Последние разработки в области дизайнерских стратегий редактирования генов на основе нуклеаз позволяют создать альтернативные варианты восстановления функции генов при генодерматозах. Это особенно актуально в тех случаях, когда генетические нарушения препятствует замене генов с помощью генотерапии.

Epidermolysis Bullosa as a Suitable Target for Gene Therapy


В мире около 500 000 человек страдают от этого генетически неоднородного кожного заболевания (Murauer et al., 2015; Has et al., 2020), вызванного мутациями в генах, кодирующих белки, которые необходимы для стабильности кожи. Основные типы EB можно различить по мутировавшему гену и пораженному слою кожи. Мутации в кератинах 5 и 14 и плектине приводят к EB simplex (EBS), связанному с внутриэпидермальными волдырями. Junctional EB (JEB) вызывается мутациями в генах, кодирующих ламинин-332, коллаген XVII типа и интегрин-α6β4. Эта форма EB характеризуется появлением волдырей в пределах lamina lucida базальной мембраны. Мутации в коллагене VII типа ответственны за особенно тяжелую и изнурительную форму EB - dystrophic EB (DEB) (Fine et al., 2014; Has et al., 2020). В настоящее время лечение EB в основном ограничивается лечением ран, что усугубляет экономическое бремя, лежащее на семьях больных. Поэтому разработка новых методов лечения, которые в настоящее время либо основаны на белках (Remington et al., 2009; Woodley et al., 2013), либо на фибробластах (Ortiz-Urda et al., 2003; Woodley et al., 2007; Wong et al., 2008), либо опираются на аллогенную трансплантацию костного мозга (Wagner et al., 2010), имеет решающее значение. В настоящее время в центре внимания исследований в области EB находятся подходы к длительной терапии ex vivo, такие как терапия стволовыми клетками/генами (рис. 1).



Figure 1. Autologous ex vivo gene therapy. In the course of an autologous ex vivo gene therapy, epidermal stem cells are initially isolated from a skin biopsy of a patient. Upon gene correction via gene replacement or genome-editing strategies, the genetically corrected cells are expanded to epidermal sheets, which are subsequently transplanted back onto the patient. Images courtesy of Rudolf Hametner.

Две перспективные формы генотерапии потенциально осуществимы при EB: замена генов и редактирование генома. Разительное различие между этими двумя подходами заключается в необходимости использования вирусных векторов для заместительной терапии. Поскольку целью замены генов является стабильное поддержание экзогенных экспрессионных кассет, то требуется эффективная опосредованная вирусом доставка в ядро и интеграция трансгена в геном клетки-хозяина. Обычно случайный характер этого подхода исключает возможность определенного контроля места интеграции или активности трансгена. Кроме того, случайная интеграция сопровождается геномной токсичностью из-за инсерционного мутагенеза (Hacein-Bey-Abina et al., 2003). В отличие от этого, редактирование генома направлено на то, чтобы целенаправленно воздействовать на мутантный локус. Эти подходы обычно базируются на надежной, но скоротечной экспрессии молекул редактирования генов. Это позволяет постоянно исправлять мутации, тем самым восстанавливая нормальную экспрессию эндогенных генов без необходимости в интеграции генома вирусов. В то время как редактирование генов для лечения генодерматозов остается на доклинической стадии (March et al., 2020), подходы к замене генов являются клинически продвинутыми и уже успешно применяются для лечения EB (Mavilio et al., 2006; Siprashvili et al., 2016; Bauer et al., 2017; Hirsch et al., 2017).

Gene Replacement Therapy for EB


Первым пациентом, получившим генетически скорректированные аутологичные эпидермальные трансплантаты, был гетерозиготный носитель стоп-кодона (R635X) и точечной мутации (E210K) в гене LAMB3 (Mavilio et al., 2006). Пациент страдает от волдырей или инфицированных корок, сопровождающихся менее сильно пораженными участками кожи. Кератиноциты были выделены из нескольких различных участков тела путем биопсии кожи. Ладони пациента оказались лучшим источником для получения клонов. Они представляют собой клоны клеток с наибольшей репродуктивной способностью, необходимой для успешной регенерации эпидермиса. После выделения клеток первичные кератиноциты обрабатывали ретровирусным вектором, полученным из вируса лейкемии Молони (MLV) и несущим полноразмерную кДНК LAMB3, что приводило к экспрессии мРНК и белка LAMB3 в обработанных клетках. Генетически исправленные кератиноциты были впоследствии размножены до эпидермальных трансплантатов перед их пересадкой пациенту (Mavilio et al., 2006) (рис. 1). Полная регенерация эпидермиса была видна на 8-й день, что привело к длительному сохранению кожи без волдырей (De Rosa et al., 2014). Гистологический анализ трансплантатов выявил нормальный и полностью дифференцированный эпидермис, включая развитие типичных слоев кожи и дермально-эпидермального соединения (DEJ). Анализ ретровирусной интеграции в ДНК, выделенной из регенерированного эпидермиса, с помощью опосредованной линкером использования ПЦР выявил многочисленные межгенные места вирусной интеграции, а также сайты интеграции либо в пределах транскрибируемой области, либо менее 30 кб вверх или вниз по течению от соответствующего гена (Mavilio et al., 2006). Эти результаты коррелируют с известным паттерном интеграции гамма-ретровирусных векторов в клетках человека (Bushman et al., 2005). Однако, в отличие от генотерапии Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита (X-SCID) (Hacein-Bey-Abina et al., 2003, 2008), при которой активация инсерционного прото-онкогена Т-клеток приводила к лимфопролиферативному заболеванию, в клинических испытаниях для EB (De Rosa et al., 2014) или SCID с дефицитом аденозиндезаминазы (Aiuti et al., 2002) о подобных серьезных нежелательных явлениях не сообщалось. Кроме того, кожные заболевания представляют собой наилучшие мишени для генотерапии, поскольку пересаженные участки кожи легко контролируются на предмет новообразований и могут быть просто иссечены в случае отклонений.
Безопасность и долгосрочность генетически скорректированного эпидермиса была оценена через 6,5 лет после фазы I/II клинических испытаний (De Rosa et al., 2014). Регенерированный эпидермис выглядел нормальным, нет волдырей, индуцированных спонтанно, или в ответ на механические нагрузки. Более того, белок ламинин 332 точно откладывался в зоне базальной мембраны (БМЗ) регенерированного эпидермиса. Очень важно, что in vivo не было обнаружено развития опухоли или признаков клональной экспансии. Далее De Rosa et al. (2014) показали, что эпидермис поддерживается популяцией долгоживущих трансгенных эпидермальных стволовых клеток, обладающих способностью к самообновлению. Эпидермальные стволовые клетки генерируют голоклоны, которые обладают долгосрочным регенеративным потенциалом. Авт. предположили, что в образце культивированного эпидермиса площадью 10 мм2 присутствовало около 150 стволовых клеток, в то время как ожидалось бы наличие ~3000 из ~15000 клоногенных кератиноцитов. Более 95% из них представляют собой временно-амплифицированные предшественники, а трансгенный эпидермис поддерживается несколькими прижившимися стволовыми клетками (De Rosa et al., 2014). Авт. продемонстрировали, что через 6,5 лет после лечения регенерированный трансгенный эпидермис был полностью функциональным и сравнимым с таковым у здорового добровольца. Благодаря этому многообещающему первоначальному клиническому испытанию, второй пациент с JEB был пролечен с помощью этого комбинированного метода генной и аутологичной клеточной терапии ex vivo в соответствии с рекомендациями надлежащей производственной практики (Murauer et al., 2015; Bauer et al., 2017). Это было совместное исследование Центра регенеративной медицины в Модене, Италия, и EB-House Austria на кафедре дерматологии и аллергологии в Зальцбурге, Австрия. Аналогичным образом, клоногенные клетки, скорректированные по гену, были размножены до эпидермальных листов и пересажены обратно пациенту после подготовки раневого ложа (Bauer et al., 2017). В третьем клиническом испытании 7-летний мальчик с JEB, потерявший почти всю кожу из-за угрожающего жизни состояния, был успешно вылечен. Кератиноциты пациента, выделенные из биоптата кожи, были генетически скорректированы и размножены для создания 0,85 м2 трансгенных эпидермальных трансплантатов. Таким образом, в ходе трех операций было заменено 80% кожи пациента. Через восемь месяцев после применения почти весь эпидермис происходил из голоклонов, что обеспечило его сохранение (Hirsch et al., 2017). Это спасительное клиническое испытание подчеркивает возможность использования этой стратегии в клинических исследованиях и других генов, связанных с EB, хотя предварительно необходимо учесть несколько соображений.
Что касается фенотипа заболевания JEB, De Rosa et al. (2019) недавно описали обширное истощение эпидермальных стволовых клеток. Это явление может быть результатом нарушения регуляции пути Yes-ассоциированного белка (YAP) и транскрипционного ко-активатора с PDZ-связывающим мотивом (TAZ). Ламинин 332-опосредованная активность YAP обычно поддерживает человеческие голоклоны. Истощение голоклонов вызывается устранением YAP, в то время как усиление YAP блокирует преобразование стволовых клеток в клетки предшественники и неограниченно продлевает продолжительность жизни кератиноцитов. Неактивный, фосфорилированный YAP является доминирующим вариантом белка, присутствующим в кератиноцитах при JEB (De Rosa et al., 2019). Следовательно, терапия с использованием гена ламинина 332 (Mavilio et al., 2006; Bauer et al., 2017; Hirsch et al., 2017) восстанавливает активность YAP и, таким образом, эпидермальные стволовые клетки. Это может, отчасти, объяснить эффективное и длительное воздействие генотерапии на пациентов с JEB (De Rosa et al., 2014). Тем не менее, эти наблюдения показывают, что замена генов не является универсальным методом лечения EB, поскольку для каждого из 16 генов ожидается различная терапевтическая эффективность (Has et al., 2020). Это будет выяснено в ходе текущих клинических испытаний для JEB (www.clinicaltrials.gov: NCT03490331) и DEB (www.clinicaltrials.gov: NCT04227106, NCT02984085, NCT01874769).
В результате этих успехов более тяжелый вариант DEB стал следующим объектом дерматологической генотерапии. Здесь болезненные эрозии, изнурительное рубцевание и развитие агрессивной клеточной карциномы в раннем взрослом возрасте представляют собой серьезные первичные и вторичные проявления (Siprashvili et al., 2016; Has et al., 2020). Первоначально Siprashvili et al. (2010) успешно установили долгосрочную экспрессию COL7A1 в регенерированных эпидермальных ксенотрансплантатах человека с рецессивным DEB (RDEB) путем обработки кератиноцитов пациентов ретровирусным вектором MLV, несущим соответствующую кДНК. Впоследствии шесть ран четырех пациентов с RDEB были обработаны эпидермальными слоями, полученными из генетически откорректированных кератиноцитов, в которых экспрессировался полноразмерный коллаген человека VII типа (Siprashvili et al., 2016). В исследовании было описано улучшение заживления ран и экспрессия коллагена VII типа. Закрепляющие фибриллы были обнаружены на дермально-эпидермальной базальной мембране без серьезных побочных эффектов. Не наблюдалось ни рекомбинантного ретровируса в крови, ни наличия плоскоклеточной карциномы в местах пересадки. Кроме того, во время исследования ни у одного пациента не было выявлено цитотоксической Т-клеточной активности, связанной с коллагеном VII типа.
Однако в местах трансплантации экспрессия коллагена VII типа в BMZ значительно снизилась в течение первых 12 месяцев исследования (Siprashvili et al., 2016). Авторы выявили корреляцию между экспрессией коллагена VII типа в BMZ и клиническим улучшением в течение года исследования (Marinkovich and Tang, 2019). Решающее значение для успеха исследования имела способность правильно иммобилизовать трансплантаты в течение первых дней после трансплантации, что, возможно, способствовало изменчивости результатов, полученных в ходе исследования (Marinkovich and Tang, 2019). Снижение экспрессии трансгена может быть результатом нескольких факторов, таких как низкая эффективность трансдукции, большой размер кДНК COL7A1 (9,3 кб), случайная интеграция трансгена, фланкированного вирусными последовательностями, или пост-транскрипционное нарушение регуляции целевых эндогенных генов в результате аберрантного сплайсинга (Montini et al., 2009; Cavazzana-Calvo et al., 2010; Titeux et al., 2010). Еще одним ограничением испытания RDEB по сравнению с исследованиями JEB может быть количество приживленных стволовых клеток, поскольку в ходе первого испытания RDEB не проводился анализ голоклонов (Marinkovich and Tang, 2019). Долгосрочное наблюдение за результатами этого клинического испытания фазы I/II, в котором приняли участие в общей сложности семь пациентов с RDEB, выявило стойкую экспрессию коллагена VII типа у двух пациентов через 2 года после лечения. Кроме того, улучшение скорости заживления ран на участках трансплантации по сравнению с контрольными ранами, не подвергавшимися лечению, было выявлено в следующие сроки: 6 месяцев, 1 год и 2 года (Eichstadt et al., 2019).
Другой проект, направленный на разработку безопасной и эффективной генной терапии RDEB посредством трансплантации аутологичных кожных аналогов, под названием GENEGRAFT (www.clinicaltrials.gov: NCT01874769), реализует самоинактивирующийся (SIN) COL7A1-экспрессирующий ретровирусный вектор для лечения RDEB с целью исследования пациентов с RDEB на предмет их иммунной толерантности к коллагену VII типа и способности исправленных клеток кожи к регенерации тканей. Результаты предварительного отбора пациентов для этого испытания терапии ex vivo фазы I/II были недавно опубликованы Gaucher et al. (2020).
Помимо лечения кератиноцитов ex vivo и последующей трансплантации генетически откорректированных эквивалентов кожи пациентам с EB, существует также возможность внутрикожного введения генетически откорректированных фибробластов. Недавно это было доказано как перспективный вариант терапии на ксено-трансплантационной мышиной модели (Jack?w et al., 2016), поскольку наряду с кератиноцитами фибробласты также участвуют в производстве и секреции коллагена VII типа. Полученные от пациентов с RDEB фибробласты были скорректированы с помощью ретровирусного вектора SIN COL7A1 класса, который впоследствии продемонстрировал, помимо восстановления коллагена VII типа, нормальные пролиферативные способности и улучшенные адгезивные свойства in vitro (Jackоw et al., 2016). Эти первые многообещающие результаты привели к разработке платформы лентивирусного (LV) вектора SIN, включающего кДНК COL7A1 полной длины, оптимизированную по кодонам, под контролем промотора фосфоглицерат-киназы (PGK) человека (Georgiadis et al., 2016). Первые доклинические данные, полученные на иммунодефицитной ксенотрансплантационной мышиной модели, выявили восстановление коллагена VII типа и связующих фибрилл при DEJ (Georgiadis et al., 2016). Проведенное впоследствии клиническое исследование генотерапии фибробластами LV при RDEB, проведенное Lwin et al. (2019), выявило увеличение средней флуоресценции коллагена VII типа в 1,26 до 26,10 раз в коже пациентов, получивших инъекции фибробластов, по сравнению с кожей без инъекций у трех из четырех пациентов. У одного участника клинического испытания присутствие трансгена COL7A1 можно было обнаружить в инъецированной коже через 12 месяцев после лечения. В целом генно-модифицированные фибробласты хорошо переносились, и серьезных побочных эффектов, включая аутоиммунные реакции против рекомбинантного коллагена VII типа, выявлено не было (Lwin et al., 2019).

Genome Editing Strategies for Genodermatoses


В отличие от заместительной генотерапии, постоянное устранение мутации, вызывающей заболевание, путем редактирования генома - это стратегия, которая одинаково хорошо работает для любого гена, связанного с заболеванием. Поэтому редактирование генов как терапевтический метод требует дальнейшего развития в отношении клинического применения, особенно для COL7A1. Конструктивные нуклеазы, такие как нуклеазы с цинковыми пальчиками (ZNF), нуклеазы с эффектором, подобным активатору транскрипции (TALEN), и нуклеазы с кластеризованными регулярно перемежающимися короткими палиндромными повторами (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9), являются современными инструментами редактирования генома, которые применяются для восстановления функции генов при генодерматозах (March et al., 2018, 2020). Редактирование генома обычно основано на образовании специфических двунитевых разрывов (DSB) в соответствующем локусе ДНК и их устранении с помощью путей репарации DSB. Таким образом, эффективность редактирования генома определяется стратегией доставки, природой и контекстом DSB, а не выбором нуклеазы. При образовании DSB клеточные пути репарации ДНК активируются в зависимости от клеточного цикла и контекста. Наиболее частый из них, путь негомологичного соединения концов (NHEJ), приводит в основном к небольшим вставкам и делециям (indels) в сайте-мишени (Davis and Chen, 2013). Следовательно, этот путь хорошо подходит для методов, основанных на перестройке генов (Kocher et al., 2020), разрушении генов (Aushev et al., 2017; March et al., 2019) или делеции экзонов (Bonafont et al., 2019). В присутствии матрицы ДНК-донора, имеющей гомологию с сайтом мишенью, нуклеазы могут быть активированы путём направленной на гомологи репарации (HDR), которая ассоциируются с идеальными результатами репарации DSB (Kocher et al., 2019; March et al., 2020). Однако известно, что современные стратегии редактирования генома на основе HDR менее эффективны по сравнению с подходами к редактированию генома, использующими репарацию DSB на основе NHEJ.

Gene Disruption or Gene Reframing Strategies


Подходы, основанные на нарушении работы генов, особенно подходят для лечения доминантно-отрицательных заболеваний, таких как EBS (Aushev et al., 2017), DEB (Shinkuma et al., 2016), эпидермолитический ихтиоз (EI) (March et al., 2019) или эпидермолитическая ладонно-подошвенная кератодермия (EPPK) (Luan et al., 2018). Здесь опосредованное нуклеазами разрезание ДНК приводит к образованию indels в сайте мишени. Следовательно, сдвиги рамки считывания, образующиеся в аллеле-мишени, вызывают образование преждевременных стоп-кодонов (PTCs), преимущественно приводящих к non-sense-обусловленному распаду мРНК (NMD) (Brogna and Wen, 2009). В 2017 году Aushev и коллеги создали протокол редактирования генов, основанный на скрининге и выделении отредактированных кератиноцитов. Он оказался функциональным в иммортализованных кератиноцитах EBS (Aushev et al., 2017). Они представили беспристрастную стратегию таргетинга для разрушения мутантного KRT5, потенциально пригодную для более широкого круга пациентов с EBS. Недавно наша группа использовала TALENs для разрушения мутантного гена KRT10 при EI (March et al., 2019). В этом исследовании ген KRT10 был нарушен выше известного PTC (Terheyden et al., 2009), который индуцирует NMD образующихся транскриптов KRT10. В результате обработки TALEN эффективность редактирования генов в первичных кератиноцитах EI составила более 20%. Кроме того, наблюдалась нормализация экспрессии K10 и отсутствие укороченных кератинов (March et al., 2019). Потенциал нокаута генов на основе концевого соединения (EJ) in vivo недавно продемонстрировали Luan et al. (2018). С помощью зависимого от мутации специфического подхода на основе CRISPR/Cas9 эффект доминантно-отрицательной мутации KRT9, вызывающей EPPK, был частично обращен вспять (Luan et al., 2018). Для лечения доминантной формы DEB Shinkuma et al. (2016) представили аллель-специфическую стратегию редактирования генов, направленную на разрушение доминантно-отрицательного аллеля COL7A1, несущего делецию в 15 нт. Это исследование подчеркнуло важность предварительного определения NMD-индуцирующих PTCs в подходах по нарушению генов, поскольку в данном случае усеченные коллагены VII типа были обнаружены в обработанных индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPSCs), полученных из первичных фибробластов пациента (Shinkuma et al., 2016).
Помимо разрушения генов, для изменения интересующего гена можно использовать стратегии редактирования генома на основе EJ. В связи с фенотипической тяжестью мутаций сдвига рамки считывания, вызывающих RDEB, все существующие на сегодняшний день подходы к восстановлению рамки считывания генов сосредоточены на целенаправленном воздействии на COL7A1 (Chamorro et al., 2016; Mencia et al., 2018; Takashima et al., 2019; Kocher et al., 2020). Подходы к восстановлению рамки считывания ex vivo были успешно применены для целенаправленного воздействия на фибробласты (Takashima et al., 2019) и кератиноциты (Kocher et al., 2020) с эффективностью редактирования генов более 50% и более 70%, соотв. Takashima et al. нацелились на делецию цитозина в экзоне 70 COL7A1 зависимым от типа мутации образом, что привело к экспрессии функционального коллагена VII типа. Кроме того, восстановление белка было обнаружено примерно в половине обработанных клеток, а введение обработанных образцов в мышиную модель привело к восстановлению коллагена VII типа в BMZ (Takashima et al., 2019). Недавно наша группа продемонстрировала точную стратегию нацеливания CRISPR/Cas9, направленную на исправление мутации со сдвигом рамки считывания внутри экзона 73 COL7A1 (Kocher et al., 2020). В первичные кератиноциты пациентов с RDEB были доставлены специфические для последовательности рибонуклеопротеины, которые вызывали и точную и предсказанную вставку одного аденина смысловой нити в соотв. локус COL7A1. Секвенирование следующего поколения сайта-мишени выявило точную модификацию перед патогенной мутацией по крайней мере в 17% всех проанализированных аллелей COL7A1. Кроме того, восстановление коллагена VII типа было обнаружено у более 70% кератиноцитов RDEB, обработанных нуклеазой Cas9. Данное исследование подчеркнуло, что точная репарация ДНК на основе соединения концов представляет собой эффективную и подходящую стратегию для изменения ассоциированных с болезнью проявлений генодерматозов.

"Traceless" Restoration of Gene Function in Genodermatoses


Направленная на гомологи репарация (HDR) - это элегантный метод модификации ДНК или точной вставки больших фрагментов ДНК в определенный сайт-мишень (March et al., 2020). Этот путь репарации конкурентоспособен с путями репарации на основе NHEJ. Кроме того, гомологичная рекомбинация активна только в поздней фазе S/G2 клеточного цикла, что приводит к её низкой эффективности (Yao et al., 2017). Для лечения генодерматозов, в частности EB, было описано несколько различных подходов по редактированию генов на основе HDR. Однако эти подходы, как правило, страдают от низкой эффективности коррекции или требуют отбора для обогащения клонов отредактированных клеток (Sebastiano et al., 2014; Webber et al., 2016; Hainzl et al., 2017; Kocher et al., 2017, 2019; Benati et al., 2018). Помимо вставки целых экзонов и генов (Benati et al., 2018), стратегии на основе HDR могут использоваться для прямой реверсии вызывающего болезнь варианта гена посредством изменения одиночного нуклеотида. Эти специфические для каждого пациента подходы HDR были успешно продемонстрированы для аутосомно-доминантных и аутосомно-рецессивных заболеваний, таких как пигментная ксеродерма (Dupuy et al., 2013), EBS (Kocher et al., 2017) и RDEB (Izmiryan et al., 2016, 2018). Izmiryan et al. (2018) недавно представили подход по редактированию COL7A1 на основе CRISPR/Cas9 без отбора для лечения первичных фибробластов и кератиноцитов с RDEB. Используя стратегию редактирования генов на основе HDR, они добились функционального восстановления экспрессии коллагена VII типа в обработанных клетках и точного формирования якорных фибрилл в ксено-трансплантационной модели ex vivo, используя трансплантаты кожи RDEB после редактирования гена. Доставка специфической для последовательности нуклеазы CRISPR/Cas9 и донорской матрицы для HDR в клетки RDEB привела к восстановлению 11% коллагена VII типа. В дальнейшем этот показатель увеличился до 20-26% при непрерывном линейном окрашивании в ходе DEJ после трансплантации эквивалентов кожи с генной коррекцией (Izmiryan et al., 2018). Чтобы снизить риск Cas9-опосредованных внецелевых эффектов, наша группа использует Cas9-мутант D10A (Jinek et al., 2012), который предпочтительно индуцирует однонитевые разрывы в ДНК (Hainzl et al., 2017; Kocher et al., 2017, 2019). В недавних исследованиях (Kocher et al., 2017, 2019) мы показали, что совместное применение двух никаз в double-nicking конфигурации является эффективной и потенциально безопасной стратегией редактирования генов при EB. Мы применили стратегию двойных никаз для исправления доминантной мутации в экзоне 6 гена KRT14, которая вызывает генерализованный тяжелый EB (Kocher et al., 2017). Мы добились этого путем совместной доставки в кератиноциты EBS пары никаз Cas9 D10A вместе с донорским вектором Minicircle, содержащим донорскую гомологичную матрицу. После отбора антибиотиками мы достигли эффективности рекомбинации более 30%, что привело к эффективности коррекции KRT14 более 16%. В рамках аналогичного подхода, основанного на отборе двойных никаз, мы недавно целенаправленно воздействовали на мутацию сайта сплайсинга в экзоне 3 COL7A1 (Kocher et al., 2019). В результате мы получили высокую эффективность HDR на уровне ~89% и эффективность экспрессии коллагена VII типа на уровне ~77%.

Conclusion


В настоящее время ген-терапевтические подходы для кожи основаны на коррекции клеток пациента ex vivo и их экспансии в эпидермальные слои, которые затем пересаживаются обратно пациенту. Первые клинические исследования по генной заместительной терапии при EB показали, что успех применения ex vivo зависит от выбора вирусного вектора для доставки, наследственности и биологии мутировавшего гена, размера и состава трансгена, и, что очень важно, от качества пересаженных эпидермальных стволовых клеток. В частности, исследования генной терапии JEB (Mavilio et al., 2006; Bauer et al., 2017; Hirsch et al., 2017) показали, что ограниченное количество эпидермальных стволовых клеток достаточно для поддержания всего эпидермиса пациентов, прошедших лечение. Этот вывод важен с точки зрения будущих разработок в области генотерапии. Однако только пренатальная генотерапия может спасти пациента от тяжелой нестабильности кожи в последующей жизни. Кроме того, это позволило бы нацелить стволовые клетки на слизистые оболочки, что не представляется возможным с помощью современных методов генотерапии. Muhle et al. (2006) исследовали применимость пренатальной генотерапии для наиболее тяжелой функциональной формы EB, первого в своем роде исследования, касающегося наследственных заболеваний кожи с волдырями. Это исследование показало, что пренатальная инъекция кДНК LAMB3-экспрессирующих вирусных векторов в амниотическую полость LAMB3-дефицитных мышей обеспечила терапевтический эффект. Однако продолжительность жизни обработанных мышей увеличилась лишь незначительно (Muhle et al., 2006). Несмотря на предполагаемые преимущества пренатального подхода к генной терапии, его применению в клинике препятствует огромное количество технических проблем, соображений безопасности и этических вопросов.
Главным преимуществом кДНК заместительной терапии является возможность воздействовать на большое количество пациентов и мутаций с помощью одной терапевтической стратегии. Однако терапия по замене генов часто зависит от использования вирусных векторов для доставки и экспрессии кДНК, применение которых связано с риском инсерционного мутагенеза. Кроме того, доминантно-негативные заболевания, такие как EI или EBS, не поддаются коррекции путем замены генов ex vivo. Хотя эти изнурительные заболевания менее тяжелы, чем другие кожные заболевания с волдырями, они значительно ухудшают качество жизни и требуют разработки новых генетических методов лечения. В совокупности эти факторы препятствуют более широкому клиническому применению данной технологии. Подходы к редактированию генома, например, с помощью CRISPR/Cas9, представляют собой перспективный подход к терапевтическому облегчению этих доминантно-негативных заболеваний, включая EBS и другие кератинопатии (Aushev et al., 2017; March et al., 2019, 2020). Эти подходы могут быть направлены на конкретного пациента и мутацию, хотя и ограничены в некоторой степени контекстом мутации и последовательностью мишени. Связанные с этим вопросы безопасности должны быть точно определены и улучшены до их применения в клинических условиях. Однако развитие подходов в будущем, основанных на замене генов и редактировании генома, выявит область их оптимального применения в медицине.