Посещений:
БОЛЕЗНЬ ФАБРИ



Успехи в редактирование генов

Gene therapy for Fabry disease: Progress, challenges, and outlooks on gene-editing
Jakob M.DommaSarah K.WoottonbJeffrey A.Medinc et al.
Molecular Genetics and Metabolism Volume 134, Issues 1–2, September–October 2021, Pages 117-131



Болезнь Фабри (FD) - это моногенное, Х-сцепленное расстройство лизосомного накопления (LSD), вызванное дефицитом активности α-галактозидазы A (α-gal A) (EC 3.2.1.22), которая кодируется 12-kbp геном GLA [1]. GLA имеет кодирующую область длиной 1290 п.н. [1], и известно более 1000 мутаций гена GLA, обнаруженных у пациентов с болезнью Фабри (Human Gene Mutation Database, http://www.hgmd.cf.ac.uk). Болезнь Фабри поражает как мужчин, так и женщин, обычно с меньшей тяжестью у женщин из-за их гетерозиготного генотипа, так как Х-инактивация вызывает мозаицизм клеток, где пагубные мутации GLA на одном аллеле могут проявляться или быть инактивированы в каждой отдельной клетке [2]. Этот дефицит вызывает накопление гликосфинголипидов, таких как глоботриаозилцерамид (Gb3) в лизосомах, в таких типах клеток, как эпителиальные клетки эндотелия сосудов, подоциты, кардиомиоциты, мезангиальные клетки и тубулярные клетки почек, что приводит к повреждению сердца, почек и цереброваскулярных сосудов и, в конечном итоге, к смерти [3]. Общие симптомы включают нейропатическую боль в конечностях, так называемую акропарестезию, и желудочно-кишечные расстройства [3]. Средняя продолжительность жизни в США в 2008 году для мужчин с FD составила 58,2 года и 75,4 года для женщин, при этом 81,3% и 41,7% умерших мужчин и женщин, соответственно, получали заместительную ферментную терапию (ERT) [4]. Однако продолжительность жизни может увеличиться, поскольку все больше пациентов начинают целенаправленное лечение в более раннем возрасте. Предполагается, что раннее лечение пациентов с FD может продлить жизнь без осложнений [5,6], но диагностика этих пациентов в более молодом возрасте оказалась сложной из-за распространенности заболевания, ряда мутаций, вызывающих болезнь, и часто неспецифических проявлений. В 1999 году сообщалось, что распространенность FD составляет 1 на 117 000 в Австралии [7], но в последних отчетах отмечается более высокая распространенность мутаций GLA при скрининге новорожденных - 1 на 5495 в США [8] или 1 на 3100 у итальянских мальчиков [9] в зависимости от географического положения и метода скрининга. Хотя неизвестно, отражают ли эти результаты скрининга клинически значимый FD, тяжесть симптомов и исходов заболевания делает наличие вариантов коррекции заболевания высокоприоритетным.
Современные целенаправленные методы лечения FD включают ERT (она же энзимная терапия, ET) и терапию шаперонами, а также новые схемы субстрат-редуктазной терапии (SRT) или модифицированной ERT, которые в настоящее время проходят испытания. ERT проводится в виде инфузии рекомбинантного человеческого фермента α-gal раз в две недели [10,11], а терапия шаперонами - это пероральный препарат, который стабилизирует определенные мутанты α-gal A и, следовательно, облегчает транспортировку α-gal A в лизосому [12,13]. Субстрат-редуцирующая терапия снижает продукцию Gb3 путем снижения активности фермента, находящегося выше по течению [14]. Модифицированная ERT, такая как пегунигалсидаза альфа, как было показано, обнаруживает свое действие в сыворотке крови гораздо дольше, чем современные ERT [15]. Многие из этих методов лечения в разной степени снижают уровень Gb3 в плазме и/или тканях, а также улучшают симптомы и результаты болезни [[16-19]]; однако эти методы лечения имеют свои ограничения. Ни один из них не является лечебным. Шаперонная терапия приносит пользу только пациентам с определенными мутациями, вызывающими болезнь Фабри. Шаперонная терапия, так же как и ERT, стоит до 300 000 долларов США в год [20]. Пациенты, получающие ERT, по-прежнему теряют функцию почек и имеют сердечные осложнения, хотя и реже и позже, чем те, кто не получает лечение [21,22]. У ERT есть и другие проблемы, такие как влияние на качество жизни из-за необходимости введения раз в две недели, реакции на введение, такие как лихорадка и ригидность [10], потенциальная выработка нейтрализующих антител против препарата [23], иногда в таком высоком титре, что обычная доза ERT будет совершенно неэффективной [24], короткий период полураспада ~2 ч [25,26] и часто минимальное количество препарата, обнаруживаемое в мозге [27,28] или почках [27]. Терапия шаперонами не показана для применения у пациентов с FD с прогрессирующим почечным или сердечным заболеванием, поскольку такие пациенты были исключены из первоначальных исследований. Модифицированная ERT и SRT пока не лицензированы для использования у людей, поскольку их польза еще не доказана. Эти проблемы с традиционными методами лечения FD открыли путь для разработки новых терапевтических средств с использованием методов генной терапии и редактирования генов. 2. Gene therapy for Fabry disease: overview Генная терапия может быть разработана для воздействия на конкретные ткани и экспрессии терапевтического трансгена. Адено-ассоциированный вирус (AAV), аденовирус, лентивирус (LV), а также невирусные методы введения мРНК и голой плазмидной ДНК были использованы для доставки терапевтической нагрузки в качестве лечения FD (рис. 1) (табл. 1). Основная генетическая кассета, которую они доставляют, состоит из промотора для запуска транскрипции, человеческого GLA-кодирующего трансгена, оптимизированного по кодонам для высокой экспрессии, сигнала полиаденилирования для обеспечения стабильности мРНК и удаления механизмов, необходимых для вирусной репликации, что является мерой повышения безопасности [29]. В случае стратегий на основе LV, где целью является вставка кДНК GLA в геном человека, необходимо дополнительное оборудование для обратной транскрипции вирусной РНК в ДНК и для интеграции этой ДНК в геном человека [29].



Fig. 1. Overview of gene therapy techniques being used in preclinical and clinical trials to treat Fabry disease.

Table 1. Comparison of gene therapy approaches that have been applied to Fabry disease.

Основная предпосылка современной генной терапии FD заключается в том, что клетки, получающие терапию, избыточно экспрессируют α-gal A, выделяют его, и он впоследствии поглощается другими клетками посредством маннозо-6-фосфатных рецепторов и перемещается в лизосомы [36,37]. Medin et al. продемонстрировали, что α-gal A может быть поглощен соседними клетками при инкубации с различными количествами супернатанта, содержащего α-gal A [37]. Они наблюдали более чем 16-кратное увеличение активности фермента в клетках с перекрестной коррекцией болезни Фабри и отметили, что эта перекрестная коррекция может быть уменьшена за счет конкуренции с рецепторами маннозы-6-фосфата [37]. Эта перекрестная коррекция, или метаболическая кооперация, отменяет необходимость доставки терапии в каждую отдельную клетку, поскольку неоднократно было продемонстрировано, что избыточная экспрессия α-gal A способна перекрестно корректировать и другие клетки в различных моделях и типах тканей [29,36,37, [84-90]]. Более того, она может обеспечивать долгосрочную перекрестную коррекцию ферментов в соседних и удаленных клетках в зависимости от типа клеток, которые изначально трансдуцируются. Например, целенаправленное воздействие на клетки с длительным сроком жизни, такие как гемопоэтические стволовые и клетки предшественники [85] или гепатоциты печени [91,92], может привести к длительной экспрессии фермента и к поглощению его другими клетками. Структура вектора важна для обеспечения такой тканевой и клеточной направленности.
Важным решением при конструировании вектора является выбор промотора. Хороший промотор может обеспечить соответствующие уровни экспрессии трансгена в течение длительного времени и в соответствующих тканях. Промоторы можно разделить на эндогенные, вирусные и гибридные синтетические промоторы. Эндогенные промоторы используются для обеспечения физиологической экспрессии, как, например, минимальный промотор WAS, используемый для лечения синдрома Вискотта-Олдрича в испытаниях на людях [60,61]. Эндогенные промоторы также могут использоваться для обеспечения органоспецифической экспрессии, например, в почках [93] или печени [44,48]. Фактически, промотор, ограниченный печенью, используется в текущих испытаниях FD на основе AAV на людях [44,48]. Вирусные промоторы, с другой стороны, обеспечивают сильную и быструю экспрессию генов, но могут быть подвержены замалчиванию [94,95]. Промотор MND, полученный из вируса мышиной лейкемии, использовался в испытаниях на людях для лечения церебральной адренолейкодистрофии путем доставки генов в гемопоэтические стволовые клетки и предшественники (HSPCs) и, как было показано, обеспечивал высокий уровень экспрессии в течение длительного времени [64]. Гибридные синтетические промоторы, такие как промотор CASI, часто приводят к высоким уровням экспрессии трансгенов [96]. Balazs et al. продемонстрировали, что промотор CASI приводил к более значительной терапевтической экспрессии трансгенов после внутримышечной инъекции у мышей, чем синтетический CAG, вирусный CMV или эндогенный промотор EF1α [96]; однако из-за подавления CASI в эмбриональных стволовых клетках человека эндогенный конститутивный промотор EF1α может быть лучшим выбором для обеспечения устойчивой экспрессии в примитивных стволовых клетках [97]. Поэтому в первом испытании генотерапии болезни Фабри на человеке использовался промотор EF1α для обеспечения длительной экспрессии в HSPC (NCT02800070 и NCT03454893). Для болезни Фабри идеальным вариантом промотора будет тот, который активен в тканях с фенотипом заболевания, таких как почки или сердце, не подвержен инактивации или достаточно силен, чтобы инициировать секрецию высоких уровней α-gal A в кровообращении для поглощения тканями-мишенями. Аналогичным образом, идеальным методом целевой доставки был бы метод, направленный на органы, наиболее пораженные FD, или направленный на долгосрочную популяцию клеток, таких как мышечные клетки, гепатоциты или HSPCs, для экспрессии α-gal A и для поглощения близлежащими клетками.
Возможным недостатком многих подходов генотерапии, применяемых в настоящее время для лечения болезни Фабри, является то, что векторы или мРНК/кДНК не направлены на системы органов и типы клеток, наиболее часто затрагиваемые при болезни Фабри, такие как сердечная, почечная и цереброваскулярная ткани (табл. 1). Современные методы основаны на внутривенном введении терапии для системного поглощения [[30-32],38,39]] или направлены на печень [[44-47]] или HSPCs [[57-59]] для избыточной экспрессии α-gal A в кровообращении для поглощения другими клетками. Эти методы имеют сходство с ERT в том, что они основаны на поглощении фермента клетками; однако они отличаются тем, что приводят к сверхфизиологической экспрессии фермента с помощью механизмов хозяина в течение длительных периодов времени и, как было показано, не вызывают появления антител против α-gal A [[30-32],38,39,[44-47], [57-59]]. Кроме того, стратегии, направленные на печень или HSPC, продемонстрировали активность α-gal A и последующую очистку от Gb3 в различных других органах, таких как сердце и почки [[44-47], [57-59]]. Например, Jeyakumar et al. использовали направленную на печень экспрессию α-gal A из AAV у мышей Fabry и наблюдали снижение Gb3 на 64% в почках, 98% в сердце и 99% в печени [45], Yasuda et al. наблюдали vtytt 10% Gb3 в плазме, печени, сердце, Yasuda et al. наблюдали менее 10% Gb3 в плазме, печени, селезенке и почках у мышей Фабри по сравнению с контролем после лечения с помощью целевой AAV-терапии печени [46], а Huang et al. использовали ex vivo LV-трансдукцию HSPCs и наблюдали последующую активность фермента и значительное снижение Gb3 в различных тканях мышей Фабри, таких как селезенка и сердце [29]. Тем не менее, в настоящее время изучаются альтернативные целевые подходы, такие как использование терапии на основе AAV, активность которой была показана ghb трансдукции кардиомиоцитов [[49-52]]. Мониторинг активности α-gal A и уровня Gb3 в этих ключевых тканях в доклинических моделях, а также отслеживание симптомов у пациентов, активности α-gal A в плазме, уровня Gb3 в плазме/моче/тканях, выработки антител против α-gal A и клинических параметров, таких как функция почек, белок мочи и индекс массы левого желудочка, будут важны для понимания полного потенциала этих методов лечения, а также их ограничений. Более того, глоботриаозилсфингозин (лизо-Gb3 ) был еще одним предложенным биомаркером FD, поскольку в некоторых исследованиях было обнаружено, что он коррелирует с плохим долгосрочным исходом у пациентов с FD [98], является токсичным для клеток [99] и обычно повышен у пациентов с FD [99]. В других исследованиях [100] он не коррелирует с исходами заболевания. Также было показано, что при определенных условиях Gb3 катализируется до лизо-Gb3 кислотной церамидазой [101]: фермент, который связан с болезнью Фарбера, но не с FD [102]. Точная роль лизо-Gb3 в качестве биомаркера FD неясна. Кроме того, хотя различные методы генной терапии показали свою эффективность в доклинических моделях для лечения различных причин хронической болезни почек [103], крайне важно проанализировать эффекты и проблемы генной терапии у пациентов с сопутствующими заболеваниями и осложнениями FD, такими как хроническая болезнь почек, и без них, поскольку мало известно о том, как они могут повлиять на лечение. Подходы генной терапии, их применение при болезни Фабри, включая плюсы и минусы, а также потенциальные будущие усовершенствования будут обсуждаться в этом обзоре.

3. Plasmid DNA and mRNA delivery for Fabry disease


Доставка гена GLA на основе NA и РНК для экспрессии α-gal A из нативных клеток была исследована с целью улучшения ERT путем обеспечения экспрессии эндогенного белка и улучшения доставки гена в органы, устойчивые к ERT. Можно предположить, что клеточная экспрессия α-gal A с последующей пост-трансляционной модификацией приведет к экспрессии фермента, который менее иммуногенен, чем введенный экзогенный фермент. Для проверки безопасности и эффективности терапии болезни Фабри на основе нуклеиновых кислот, кДНК GLA вводили в левую почку мышей [30]. Частичный терапевтический эффект наблюдался при удалении Gb3 в инъецированной почке, правой почке, печени, сердце и селезенке; однако к четвертой неделе после инъекции снижение осталось значительным только в сердце по сравнению с нелеченым контролем [30]. Недавно Zhu и др. и DeRosa и др. системно вводили инкапсулированную в липидные наночастицы мРНК, кодирующую GLA человека, мышам, а также не человекообразным приматам (НЧП) и наблюдали безопасность при многократном введении препарата, при этом в плазме и органах снижалось содержание Gb3 и лизо-Gb3 [31,32]. NHP хорошо переносили лечение мРНК, и эффект повторных доз не был затруднен. Уровень белка α-gal A в сыворотке крови человека достигал пика через 6-12 часов после введения и имел значительно более длительный период полураспада, чем продукт ERT [31,32]. Zhu и др. сообщили об обнаружении α-gal A в сыворотке крови в течение 48 часов у NHP [31], а DeRosa и др. отметили, что кажущийся период полураспада у мышей из-за длительной экспрессии составил 7,5 часов, что более чем на 5 часов дольше, чем у продукта ERT [32]. Сообщалось о безопасности и отсутствии иммуногенности в отношении лечения на основе мРНК [31,32]. Отчасти это может быть связано с эндогенной экспрессией α-gal A, что позволяет белку подвергаться толерантной пост-трансляционной модификации в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи [[33-35]]. Благодаря безопасности терапии на основе мРНК она широко используется в клинических испытаниях для лечения различных заболеваний, таких как метилмалоновая ацидемия, другое метаболическое генетическое заболевание (NCT03810690) или даже в качестве вакцины против SARS-CoV-2 (COVID-19) (NCT04283461). В целом, длительная экспрессия мРНК, кодирующей GLA, для экспрессии α-gal A в сочетании с продемонстрированной безопасностью делают мРНК перспективным методом лечения, но требующим повторного введения из-за скоротечного периода полураспада мРНК и ее неспособности корректировать расстройство на геномном уровне при использовании для экспрессии α-gal A как такового.

4. Adenovirus delivery for Fabry disease


Проблема необходимости частых, повторных доз ERT или мРНК, кодирующей GLA, может быть решена с помощью более стабильной вирусной доставки нуклеиновой кислоты, кодирующей GLA, и в первых исследованиях для этого использовался аденовирус. Аденовирус использовался в доклинических моделях для лечения FD, поскольку он способен трансдуцировать широкий спектр типов клеток и имеет длительную экспрессию трансгенов [38]. Аденовирус использовался в испытаниях на людях в качестве вакцины, для целей генотерапии, а также в качестве противораковой терапии [104]; однако он вызывает воспаление и токсичность in vivo, препятствующие его использованию для генотерапии [38]. Первоначальные исследования генотерапии FD были направлены на внутривенную доставку аденовируса, экспрессирующего α-gal A, мышам с нокаутом GLA [38]. Хотя уровень α-gal A повышался в печени, почках, легких и селезенке уже через 3 дня после введения в течение 12-q недели, наблюдалась токсичность: повышение сывороточных трансаминаз, гепатоцеллюлярный некроз и инфильтраты иммунных клеток в печени [38]. Когда доза аденовируса была снижена в попытке преодолеть зависимую от дозы токсичность, очистка Gb3 была снижена, при этом более 75% Gb3 оставалось в почках по сравнению с 30% при 10-кратном увеличении дозы [39]. Следует отметить, что Ziegler и др. смогли улучшить удаление Gb3 , используя меньшую дозу аденовируса, когда клетки Купфера были истощены [39]. Более поздние работы были направлены на доставку аденовируса различными путями, такими как легочная инстилляция [40] или инъекция в подчелюстную железу [41] у мышей, и им удалось ограничить выход вируса и токсичность для других компартментов, однако клиренс Gb3 в других органах, таких как почки, был минимальным, более того, Li et al. не наблюдали изменений в уровнях Gb3 в почках через 8 недель после легочной инстилляции терапии [40]. Иммуностимулирующие эффекты аденовируса могут быть желательны для других целей, таких как уничтожение раковых клеток или вакцинация, но токсичность, наблюдаемая в доклинических моделях FD, вместе с сообщениями о том, что системное введение аденовируса в онколитических целях приводило к печеночным поражениям, нейтропении и тромбоцитопении [42], а также историческая первая смерть от генной терапии в 1999 году после внутриартериального введения аденовируса для лечения дефицита орнитин-транскарбамилазы [43], заставили исследователей перейти от аденовируса к более безопасному адено-ассоциированному вирусу для будущих исследований.
5. Adeno-associated virus delivery for Fabry disease


Адено-ассоциированный вирус обеспечивает эффективный перенос генов, считается относительно безопасным, и по состоянию на декабрь 2020 года на сайте ClinicalTrials.gov зарегистрировано более 190 клинических испытаний на людях с использованием AAV-терапевтических препаратов. Генотерапия на основе AAV получила одобрение FDA в 2017 году для лечения врожденного амавроза Лебера, наиболее распространенной причины наследственной слепоты у младенцев [105], а недавно в 2019 году - для лечения спинальной мышечной атрофии [106]. Было показано, что AAV сохраняется в течение нескольких лет, обеспечивая терапевтический уровень экспрессии трансгенов для долгосрочной терапии заболеваний [53]. Безопасность, долговечность и эффективность способствовали одобрению двух клинических испытаний с использованием генотерапии на основе AAV для лечения FD, которые начнутся в 2019 году, с использованием терапевтических препаратов ST-920: рекомбинантного AAV2/6 или FLT190: рекомбинантного вектора AAVS3 (Таблица 2) [44,48]. Эти платформы способствуют экспрессии трансгена в печени и было обнаружено, что это вызывает эффект устойчивости к иммунитету у мышей по отношению к экспрессии трансгена, α-gal A [47], несмотря на экспрессию сверхфизиологических уровней фермента α-gal A в течение многих месяцев [[44-46], 48]. Было показано, что обе платформы AAV вызывают снижение уровня Gb3 и лизо-Gb3 у мышей Фабри до не обнаружимого или минимального уровня в плазме, печени, селезенке и сердце, а также в почках [[44-46]].

Table 2. Current and completed clinical trials using gene therapy techniques to treat Fabry disease.

AAV-терапевтические средства для лечения FD представляются многообещающими в доклинических моделях на мышах, но при переходе AAV-терапии на более крупных животных или человека возникли проблемы. Например, системное введение AAV8-GLA в NHPs смогло вызвать толерантность к α-gal А, аналогично предыдущей работе на мышах, но уровни экспрессии были на 2 лога ниже в NHPs, чем у мышей, несмотря на аналогичную дозу вектора на кг [107]. Аналогично, в случае экспрессии собачьего фактора VIII у собак с гемофилией А и мышей с гемофилией А, AAV серотипа 2 привело к 20% нормализации экспрессии фактора VIII у мышей, 50% при использовании AAV6 и 110% при использовании AAV8; но у собак с гемофилией А доставка AAV серотипов 2, 6 и 8 привела к 2-5% нормализации активности собачьего фактора VIII [108]. Однако, когда AAV8 был использован в испытаниях на людях при гемофилии B для лечения дефицита фактора IX, наблюдался эффективный перенос генов с высоким уровнем экспрессии и безопасностью в течение 3 лет [53]. В последующем испытании уровни фактора IX достигли 48% и 66% от физиологических уровней у каждого пациента [109]. Эти данные свидетельствуют о том, что результаты использования конкретного серотипа AAV не обязательно могут быть перенесены на другой серотип, как и результаты при изменении экспрессии трансгена или модели животных, которым он вводился. Поэтому трудно предсказать, как терапия болезни Фабри на основе AAV будет применяться в клинике.
Также разрабатываются тканевые целевые методы лечения на основе AAV для борьбы с органоспецифическими проявлениями болезни FD. Фенотип болезни сердца может лечиться с помощью капсиды AAV 4D C102, который, как было установлено, трансдуцирует ткани сердца NHP in vivo, а также кардиомиоциты и эндотелиальные клетки человека in vitro лучше, чем AAV1, AAV8 или AAV9-серотипированные векторы; капсида AAV 4D__ C102 также обнаруживает сниженный иммунный ответ в тканях сердца NHP и демонстрирует зависимую от дозы экспрессию и функцию α-gal A [49,50]. Эта капсида 4D-310 при экспрессии α-gal A в качестве терапевтического FD, как было показано далее, локализуется в сердце, почках, скелетных мышцах и печени у NHP без видимой токсичности [51,52]. Аналогично, AAV9-серотипированные векторы показали хорошую трансдукцию проксимальных частей канальцев и собирающего протока в печени у мышей [93], а также трансдукцию собирающего протока и, в меньшей степени, гломерул у NHP на поздних сроках беременности [110]. Аналогичным образом, эффекты FD на центральную нервную систему (ЦНС) могут быть устранены с помощью вектора серотипа AAV9, который обладает способностью преодолевать гематоэнцефалический барьер [111] и используется в испытаниях на людях для лечения мукополисахаридоза (MPS) (NCT02716246), или с помощью AAV5, который доставлялся интрацеребрально для лечения MPS (NCT03300453). В последнее время была проделана большая работа по обнаружению и конструированию новых капсид AAV с измененным тропизмом. Ранние мутантные капсиды AAV были созданы с помощью перестановки ДНК, где AAV2, AAV8 и AAV9 были объединены для создания гибридной капсиды AAV-DJ, это улучшило трансдукцию в печени мышей [112]. Направленные мутации также использовались для создания новых серотипов векторов, таких как AAV6.2FF, который улучшил AAV6, наделяя более высокой скоростью трансдукции в легких и мышцах и более быстрой экспрессией [78]. В недавней предварительной работе с использованием секвенирования следующего поколения был проведен скрининг in silico тысяч точечных мутаций капсид AAV для определения влияния на трансдукцию AAV в различных тканях [113].
Хотя AAV в целом считаются относительно безопасными, предполагается связь между вирусом и генотоксическими эффектами, такими как гепатоцеллюлярная карцинома [75,76]. Действительно, текущее клиническое исследование с использованием AAV в качестве терапии гемофилии B (NCT03569891) было недавно приостановлено после того, как у пациента возникла гепатоцеллюлярная карцинома. Компания-спонсор подчеркнула, что у участника в анамнезе была инфекция вируса гепатита В и вируса гепатита С, а также неалкогольная жировая болезнь печени [114]. Напротив, недавнее испытание на человеке с использованием AAV не выявило серьезных проблем с безопасностью, включая отсутствие случаев гепатоцеллюлярной карциномы, после 12-15 лет наблюдения [54]. Тем не менее, мониторинг получателей терапии на основе AAV на предмет побочных эффектов, включая генотоксические эффекты, должен оставаться приоритетным.
Даже если будет определена подходящая капсида AAV и решены проблемы генотоксичности, основной проблемой терапии FD на основе AAV останется необходимость повторного введения. Хотя векторы AAV способны экспрессировать трансгенные продукты в течение нескольких лет [53], экспрессия в конечном итоге снижается, поскольку эписомальный AAV удаляются или разбавляется в процессе деления клеток. При FD это приведет к снижению экспрессии α-gal A и повторному накоплению гликосфинголипидов, прогрессированию проявлений заболевания и вынужденному повторному введению вектора AAV. Раньше считалось, что повторного введения того же вектора будет достаточно, но теперь мы знаем, что анти-AAV антитела препятствуют повторному введению [55,56], а также могут ингибировать доставку альтернативных серотипов/капсид AAV [115]. Например, повторное введение AAV в легкие или мышцы приводило к снижению вирусной трансдукции, если она вообще была, из-за нейтрализующих антител [55,56]. Хотя доставка в печень может вызывать эффект переносимости на экспрессированный трансгенный продукт [47], испытания на людях показали возможность развития специфического для капсида AAV Т-клеточного иммунного ответа при доставке в печень, что делает лечение в конечном итоге неэффективным [116,117]. Преодоление иммунитета против AAV является важной задачей, особенно при рассмотрении необходимости повторного введения AAV в клинических условиях.
Были использованы различные способы минимизации или предотвращения уже существующего или индуцированного иммунитета против AAV, такие как альтернативное место доставки [47], мутантный дизайн капсид [77,78], доставка пустых вирусных капсидных приманок для поглощения анти-AAV нейтрализующими антителами [79], изменение доз вектора [53,80], преходящая иммуносупрессия [55], или, в последнее время, деградация IgG [81]. Внутривенное введение AAV для экспрессии в печени может способствовать переносимости к продукту трансгена [47], но при этом повышается восприимчивость лечения к анти-AAV антителам и нейтрализующему их действию [118]. Что касается методов преодоления уже существующего анти-AAV иммунитета, было показано, что мутантные капсиды могут избегать иммунитета к исходным родительским капсидам [77,78], но было проведено мало работ по изучению возможности повторного введения мутантных капсид. Было показано, что ограничение дозы вектора позволяет избежать иммунной стимуляции [53,80]. Это было показано в испытании на человеке с гемофилией В, где более низкие дозы вируса все еще были терапевтическими, но не вызывали Т-клеточного ответа, в отличие от более высоких доз [53,80].
Иммуносупрессивные препараты также использовались для того, чтобы избежать уже существующего иммунитета и предотвратить индукцию иммунитета против AAV и анти-трансгенных продуктов. Когда введение AAV в дыхательные пути кролика было затруднено предшествующим иммунитетом и повторное введение не дало трансдукции, Halbert et al обнаружили, что преходящая иммуносупрессия антителами против лиганда CD40 или растворимым слитым белком CTLA4-иммуноглобулина во время повторного введения вектора восстановила вирусную трансдукцию [55]. Аналогичным образом было показано, что рапамицин, вводимый совместно с AAV, предотвращает индукцию анти-AAV реакции и позволяет повторное введение у мышей и NHP [119]. Elmore et al. недавно продемонстрировали, что использование фермента, разрушающего IgG, перед повторным введением может восстановить уровень трансдукции AAV [81]. Напротив, Halbert et al . показали, что использование интрон-содержащей кассеты для экспрессии капсиды для производства AAV может уменьшить количество капсидного антигена, доступного для распознавания иммунной системой хозяина, и, следовательно, снизить последующий иммунный ответ [82]. И, наконец, важно знать, что, несмотря на то, что терапия на основе AAV9, одобренная FDA для лечения спинальной мышечной атрофии, проводилась исключительно пациентам, не имевшим ранее анти-AAV9 антител или имевшим их в незначительном количестве, у большинства пациентов после введения препарата наблюдались высокие титры анти-AAV9 антител, превышающие 1:819,200 [120]. Это имеет значительные последствия для целей повторного введения, особенно при педиатрических заболеваниях, поэтому терапия на основе AAV для FD, которая потребует повторных доз, должна преодолеть этот барьер.
6. Hematopoietic stem/progenitor cell gene therapy


Необходимость повторного назначения лечения может быть уменьшена или даже полностью исключена путем долгосрочной коррекции заболевания с помощью генотерапии посредством гемопоэтических стволовых клеток и клеток предшественников (HSPC-GT). Здесь LV с функциональной интегразой используется для трансдукции аутологичных HSPC и вставки трансгена в клеточную ДНК ex vivo. Когда эти HSPC вводятся в организм, они приживаются и пролиферируют со всеми потомками, несущими вставленный ген. Таким образом, иммунные клетки, находящиеся в тканях, и циркулирующие клетки крови будут экспрессировать введенный трансген, если они являются потомками сконструированной клетки. Если продукт трансгена секретируется, близлежащие клетки могут также интернализировать белок и транспортировать его в лизосому для коррекции заболевания. HSPC-GT использовались во многих клинических испытаниях, в том числе для лечения синдрома Вискотта-Олдрича [60,61], тяжелых комбинированных иммунодефицитов [[67-69]], бета-талассемии [[70-72]], анемии Фанкони [73,74], серповидно-клеточной болезни [62], адренолейкодистрофии (АЛД) [63,64], инфекции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) [121], а также для LSDs, таких как метахроматическая лейкодистрофия [65,66] и FD [[57-59]]. (NCT02800070 и NCT03454893) (Таблица 2). Кроме того, первая одобренная HSPC-GT вышла на европейский рынок в 2016 году для лечения аденозиндеаминаз-дефицитного тяжелого комбинированного иммунодефицита [69]. Согласно опубликованным результатам всех этих исследований, HSPC-GT с использованием LV оказалась безопасной, не было ни серьезных побочных явлений, непосредственно связанных с LV, ни сообщений об инсерционном мутагенезе, в отличие от предыдущего опыта применения гамма-ретровируса [67,122,123].
Первое испытание HSPC-GT для лечения FD (NCT02800070 и NCT03454893) началось в 2016 году. В нем использовался LV для доставки кодон-оптимизированной GLA-кодирующей кДНК в аутологичные CD34+ HSPC ex vivo, которые затем вводили обратно участникам [59] (Таблица 2). Лентивирусный вектор в этом исследовании использовал промотор EF1 для стимулирования экспрессии трансгена и Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element для усиления экспрессии транскрипта. Вектор был псевдотипирован по белку G вируса везикулярного стоматита, который часто используется для трансдукции HSPC [124]. Перед введением трансдуцированных HSPC пациенты подвергались частичной миелоаблации в качестве средства кондиционирования для увеличения приживления HSPC. На сегодняшний день не было зарегистрировано никаких серьезных побочных явлений, связанных с этим лечением, и исследователи наблюдали стойкое приживление трансдуцированных HSPC с высокой экспрессией α-gal A [57,59]. Доклинические исследования, приведшие к данному клиническому испытанию, были проведены на мышах Fabry NOD/SCID с ксенотрансплантацией лентивирусом трансдуцированных CD34+ HSPC от пациента с Fabry [29]. Трансдуцированные HSPC от пациентов с Fabry экспрессировали α-gal A на супрафизиологических уровнях: т.е. выше, чем в норме. Действительно, увеличение активности α-gal A по сравнению с не трансдуцированными уровнями наблюдалось во многих тканях вплоть до конечной точки исследования через 12 недель после трансплантации, с последующим снижением Gb3 в тканях [29]. Текущее клиническое исследование с использованием лентивирусной трансдукции HSPCs ex vivo (NCT02800070 и NCT03454893) показало предварительно безопасность без серьезных побочных эффектов, связанных с самим LV, продолжительную α-gal A активность в лейкоцитах и плазме крови в течение более чем 2 лет после лечения, снижение уровня Gb3 и лизо-Gb3 в плазме крови и моче, стабильную сердечную и почечную функцию и снижение включения Gb3 в почечных перитубулярных капиллярах [[57], [58], [59]]. Еще предстоит определить степень клиренса Gb3 у человека с помощью этих лентивирусных систем в других почечных клетках, таких как подоциты, мезангиальные клетки или тубулярные клетки.
Трансплантированные трансдуцированные HSPC не только эффективно экспрессируют трансгены, но и способны возвращаться в латентное состояние для последующей реактивации [61] или дифференцироваться в различные типы клеток, включая тканевые макрофаги [125] и микроглиальные клетки, обитающие в ЦНС [126], что может частично объяснить защиту ЦНС, наблюдаемую при использовании HSPC-GT для лечения метахроматической лейкодистрофии [65]. Это показывает, что при определенных типах миелоаблации трансдуцированные с помощью LV гемопоэтические клетки и терапевтические продукты могут оказывать воздействие на различные ткани, включая ЦНС. Эти модифицированные HSPC не только могут дифференцироваться в различные типы клеток, они также могут экспрессировать сверхфизиологические уровни введенного гена для перекрестной коррекции близлежащих клеток [66]. Этот вывод важен, поскольку мы знаем, что трансплантация гемопоэтических стволовых/предшествующих клеток (HSPCT) сама по себе, без лентивирусной трансдукции и вставки генов, не всегда приносит пользу при определенных проявлениях заболеваний LSDs. Biffi et al. показали, что одна только HSPCT не принесла пользы при проявлениях болезни в ЦНС при метахроматической лейкодистрофии, но HSPC-GT смогла предотвратить прогрессирование заболевания у трех детей после того, как ожидалось появление симптомов [66]. Преимущества HSPC-GT по сравнению с HSPCT заключаются в том, что не требуется поиск подходящего донора HSPC, отсутствует риск развития болезни трансплантат-хозяин и требуется меньшая иммуносупрессия.
Еще одним потенциальным преимуществом HSPC-GT является то, что она может повысить выживаемость и положительный отбор искусственно измененных клеток по сравнению с неоткорректированными клетками. Испытания на людях при анемии Фанкони [73,74] продемонстрировали это явление, когда наблюдался высокий процент (до 44%) исправленных клеток в общем количестве клеток периферической крови, несмотря на отсутствие кондиционирования пациентов перед введением. Это наводит на мысль о том, что преимущество в выживании было отдано исправленным клеткам. Возможно, что аналогичный эффект может наблюдаться при FD на периферии, хотя, в отличие от анемии Фанкони, у пациентов с FD не наблюдается выраженной недостаточности костного мозга. Кроме того, исчезновение мозаицизма, наблюдаемое при анемии Фанкони [73,74], до сих пор не было показано у гетерозигот по FD, поэтому неизвестно, будет ли положительный отбор наблюдаться и в исправленных клетках FD. В качестве альтернативы было высказано предположение, что некоторые LSDs демонстрируют ремоделирование костного мозга [127], которое может предложить потенциальную нишу для искусственного преобразования клеток для экспансии и фиксации, хотя это ремоделирование не было продемонстрировано при FD, также не были проведены работы по определению того, способны ли откорректированные HSPC повлиять на измененную архитектуру костного мозга и создавать здоровую нишу для долголетия и экспансии.
В отсутствие положительного отбора особенно важно обеспечить высокий уровень экспрессии трансгена, что может быть достигнуто, например, путем выбора промотора, оптимизации кодонов или стабилизации мРНК, или, возможно, путем достижения высокого числа копий вектора (VCN) на HSPC с хорошим приживлением сконструированных клеток. Действительно, более высокое VCN в HSPC перед введением ассоциирует с лучшими исходами заболевания [64,72], но также может повышать риск генотоксичности. Eichler et al. отметили, что у пациентов с более низким VCN наблюдалось больше осложнений ALD, таких как снижение неврологической функции или наличие функциональных нарушений [64]. Кроме того, Marktel et al. наблюдали, что HSPC-GT эффективно лечила трех из четырех педиатрических пациентов с бета-талассемией, но у одного пациента наблюдалось снижение VCN, что соответствовало плохому приживлению, и ему требовалась трансфузионная поддержка [72]. В совокупности эти результаты подчеркивают важность достижения адекватной скорости трансдукции и эффективного приживления преобразованных клеток.
Подобно отбору капсид для AAV, также LV могут быть псевдотипированы для повышения эффективности трансдукции и специфичности мишеней. Обычно используемый псевдотип для LV в HSPC-GT - оболочка G-белка вируса везикулярного стоматита (VSV-G) - способен безопасно и эффективно трансдуцировать стимулированные HSPC [124]; однако он имеет низкие показатели трансдукции в нестимулированных покоящихся CD34+ клетках [128]. Современные HSPC-GTs часто используют цитокиновую стимуляцию собранных HSPC перед трансдукцией для увеличения скорости трансдукции и интеграции. К сожалению, было показано, что стимуляция цитокинами отрицательно влияет на способность HSPC перемещаться в костный мозг и приживляться [129]. Поэтому для HSPC-GT было бы предпочтительнее, если бы высокие показатели трансдукции и интеграции генов достигались без стимуляции цитокинами для поддержания более высоких показателей приживления. В случае не стимулированных HSPC, VSV-G псевдотипированные LV показали низкий уровень трансдукции - 5% [128]. Были исследованы новые псевдотипы LV, и уровень трансдукции не стимулированных HSPC достиг 30% при использовании гликопротеина оболочки ретровируса бабуина и до 70% при использовании нового LV, содержащего гликопротеин вируса кори [128], и существует еще много неопробованных псевдотипов. Не стимулированные HSPC, трансдуцированные гликопротеином вируса кори, отображающим ЛВ, были способны к длительному приживлению и многоклональной экспансии из-за отсутствия стимуляции и вступления в клеточный цикл [128]. Эти результаты показывают, что альтернативное псевдотипирование LV для HSPC-GT может увеличить скорость трансдукции, сохраняя HSPC в не стимулированном состоянии с улучшенным потенциалом приживления, если будет доказана безопасность и осуществимость. Однако исследования безопасности будут важны, поскольку известно, что вирусные оболочки могут быть вредными или даже онкогенными [130]. Кроме того, альтернативные псевдотипы LV демонстрируют различную, порой субоптимальную, стабильность или скорость производства и очистки/концентрации [131,132]. Хотя новый псевдотип может демонстрировать более высокие показатели трансдукции in vitro, протоколы для получения продукта надлежащего качества и количества для использования человеком могут быть еще недоступны [131,132].
Также было показано, что кондиционирование перед введением HSPC играет важную роль в приживлении HSPC. Хотя неблагоприятные события в испытаниях HSPC-GT преимущественно связаны с миелоаблативным кондиционированием [71], плохое предварительное кондиционирование было связано с уменьшением приживления HSPC и значительным снижением эффекта лечения [72]. Поэтому безопасность пациентов, получающих HSPC-GT, может значительно повыситься при использовании методов кондиционирования, связанных со снижением смертности, которые являются менее токсичными и избирательно действуют на костный мозг или резидентные HSPC для создания ниши для приживления клеток. Анти-C-Kit моноклональные антитела с блокадой CD47 [133], иммунотоксины, направленные на CD45 [134], и CD117-антитело-лекарственные конъюгаты [135] могут оказаться безопасными и эффективными средствами кондиционирования пациентов для аутологичной трансплантации HSPC в будущем с меньшим количеством неблагоприятных событий. Было отмечено, что такие заболевания, как болезнь Фабри, часто вызывают ремоделирование тканей и необратимое повреждение органов [136,137]. Было показано, что отложения Gb3 непосредственно вызывают иммунный ответ через Toll-подобный рецептор 4 (TLR) и CD1d пути, что приводит к протромбическому состоянию [138,139], способствует развитию окислительного стресса [140,141] и вызывает апоптическую дисфункцию [142,143]. Эти клеточные изменения могут привести к ремоделированию стромы и повреждению клеток. Например, известно, что накопление Gb3 в подоцитах приводит к повреждению и потере подоцитов [144], что, возможно, объясняется активацией TLR4 под действием Gb3 , что усиливает экспрессию трансформирующего фактора роста-β в подоцитах, это приводит к потенциально необратимым изменениям, таким как фиброз [145]. Аналогичным образом было показано, что повреждение тканей, вызываемые Fabry, проявляются в виде фиброза в сердечной ткани [3] и поражения белого вещества мозга [146]. Ellaway и др. отметили, что раннее начало ERT не только снижает накопление Gb3 , но и может ограничить необратимые повреждения органов [137]. Также может быть полезно проводить HSPC-GT у молодых пациентов до того, как произойдут стромальные изменения, фиброз и гибель клеток. В испытаниях на людях при β-талассемии было показано, что у молодых пациентов, получавших HSPC-GT , часто наблюдались лучшие исходы с более длительным периодом времени без переливания крови [72]. Более того, хорошо известно, что более молодой возраст является хорошим прогностическим фактором для трансплантации органов и костного мозга [136,147,148]. Этому могут способствовать многочисленные факторы, такие как физическая форма, повышенная иммунная толерантность, меньшее количество необратимых повреждений тканей или лучшее здоровье костного мозга, что часто наблюдается у более молодых людей [136,147,148].
Главной проблемой при HSPC-GT на основе LV является риск инсерционного мутагенеза и генотоксичности. В ранних испытаниях HSPC-GT использовались гамма-ретровирусы для доставки генов и наблюдался инсерционный мутагенез, часто приводящий к ассоциированной с вектором лейкемии и миелодисплазии [122,123]. Хотя подобные случаи не были установлены в испытаниях HSPC-GT с использованием самоинактивирующихся LV, важно знать о такой возможности. Действительно, известно, что гамма-ретровирусы вызывают больше генотоксических эффектов, чем LV [122,123, [149-152]]. Как и гамма-ретровирусы, LVs интегрируются в специфические регионы [60,149,150]. Однако, в отличие от гамма-ретровирусов, LV интегрируются преимущественно в активные транскрипционные единицы генов, тогда как гамма-ретровирусы интегрируются в сайты старта транскрипции, такие как промоторы [60,149,150]. Многие LV, используемые сегодня в генотерапии, получены из HIV-1 [153]. Интересно, что у людей, живущих с HIV-1 инфекцией, не было выявлено повышенного риска развития лейкемии [154]. И это несмотря на то, что у них часто наблюдается высокая концентрация вируса в крови. Хотя эти отличительные особенности LV поддерживают его безопасность по сравнению с гамма-ретровирусом, генотоксичность остается риском при использовании HSPC-GT на основе LV. Более того, генотоксичность, связанная с LV, может быть непредсказуемой и варьировать в зависимости от характера вводимого трансгена и места вставки. Следует отметить, что в 2021 году два испытания генотерапии на основе LV, проведенные компанией Bluebird bio для лечения серповидно-клеточной болезни, были временно приостановлены из-за сообщения о предполагаемой неожиданной серьезной побочной реакции в виде острой миелоидной лейкемии [83]. Интеграция в сайт VAMP4 была позже показана в их испытании; однако известно, что этот локус не вовлечен в острую миелоидную лейкемию [155]. Причина этого неблагоприятного события остается в стадии расследования [155]. Независимо от этого, риск генотоксичности на основе LV необходимо учитывать или потенциально избегать с помощью точного редактирования генов.
7. Перспективы генного редактирования для лечения болезни Фабри


Технология редактирования генов позволяет удалять вызывающие болезнь геномные сегменты, вставлять корректирующие гены в точные места и выполнять преобразования пар оснований (рис. 2). Сегодня существуют различные эффекторные ферменты CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats)/Cas (CRISPR-associated genes), способные осуществлять целевое связывание ДНК, а также создавать одноцепочечные или двухцепочечные разрывы для облегчения удаления или вставки генов [[156-158]]; деаминазы, слитые с Cas для нацеливания на преобразование пар оснований [159,160]; CRISPR-ассоциированные транспозазы и Cas-связанные транспозазы/рекомбиназы, способные вставлять генетический груз [[161-163]]; и prime редактирование, которое может облегчить преобразование пар оснований, небольшие вставки, а также небольшие делеции [164] (Таблица 3). Каждый из этих инструментов обладает как своими возможностями, так и недостатками в качестве инструментов редактирования генов. Однако современный набор инструментов для редактирования генов быстро расширяется, и в настоящее время срочно разрабатываются технологии для повышения точности, уменьшения нежелательных геномных изменений и повышения эффективности вставки генов. Ниже приводится краткий обзор этих инструментов, способов их применения в FD и препятствий, с которыми придется столкнуться. Более полный обзор технологии редактирования генов можно найти в другом месте [165].



Fig. 2. Overview of current gene-editing techniques. (a) Gene insertion with homology-directed repair. Cas9 is targeted to DNA via its complimentary gRNA and recognizes a cut site downstream of the protospacer adjacent motif (PAM). Cas9 nuclease performs a double-stranded DNA break activating host DNA repair mechanisms, in this case homologous recombination, which uses homologous DNA, or a donor template, to repair the broken DNA strands. Depending on design of the donor template, a segment of DNA may be inserted. (b) Base editing with Cas9 fused to a deaminase. Again, Cas9 is targeted to DNA via its complimentary gRNA, however in this case, Cas9 is inactivated of its endonuclease activity, termed dead Cas9 (dCas9) and is bound to a deaminase. Deamination occurs within the target window depending on the type of deaminase used, in this case cytidine deaminase. Here, cytidine is deaminated to uracil, which is converted to thymine by host machinery creating a mismatch? in the DNA sequence which is then repaired leading to a point mutation. (c) Gene insertion with CRISPR-associated transposase system. Here, Cas12k is targeted to DNA via its complimentary gRNA. Cas12k is bound to a transposase which then inserts DNA without requiring a double-stranded DNA break.<

gRNA = guide RNA; Blue = repair template, red = PAM (protospacer adjacent motif), grey = host DNA, green = guide RNA, orange = inserted gene. (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

Table 3. Comparison of current CRISPR-based gene-editing tools.

CRISPR и CRISPR-ассоциированные гены, впервые обнаруженные как вид прокариотического адаптивного иммунитета к чужеродным генетическим элементам [186,187], были использованы для осуществления направленных разрывов ДНК для редактирования генов [156]. Системы CRISPR/Cas были добавлены к набору инструментов для редактирования генов, в который вошли нуклеазы с эффекторами, подобными активаторам транскрипции (TALEN) и нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN) [188,189]. Независимо от используемой системы, разрывы ДНК запускают пути репарации ДНК - направленную на гомологи репарацию (HDR) [178] или негомологичное соединение концов (NHEJ) [180]. HDR происходит в делящихся клетках, находящихся в фазе S или G2 клеточного цикла, и функционирует путем обмена генетическим материалом с гомологичным сегментом ДНК для заполнения разрыва [178]. HDR можно использовать для вставки нового гена в клетки для генной коррекции; однако этот путь протекает менее чем в 1% клеток [190] и минимально функционален в клетках покоя, таких как HSPC, в которых отсутствует механизм HDR и которые быстро не делятся [177]. Для преодоления этого барьера были разработаны методы обогащения для сортировки клеток со вставленным трансгеном с целью очистки популяции отредактированных клеток ex vivo [191,192]. В качестве альтернативы, NHEJ происходит как в делящихся, так и в неделящихся клетках, таких как HSPCs, на протяжении всего клеточного цикла и является основным путем репарации двуцепочечных разрывов ДНК у эукариот [180]. NHEJ функционирует путем связывания разорванных концов ДНК обратно вместе, обычно вызывая при этом некоторые вставки или делеции (INDELs) [178]. По этой причине NHEJ часто используется в генном редактировании для выключения гена; однако недавно он был расширен для вставки генов [193]. Suzuki и его коллеги смогли осуществить вставку генов с помощью независимой от гомологии платформы, основанной на NHEJ, с большей эффективностью, чем при использовании HDR [193]. Вставка генов на основе NHEJ также использовалась для редактирования HSPC, и было отмечено, что эти клетки имели высокую скорость вставки генов и сохраняли потенциал приживления у мышей [194]. Методы редактирования генов могут быть использованы для лечения FD путем воздействия на делящиеся клетки с помощью HDR или на неделящиеся клетки, такие как HSPC, с помощью вставки на основе NHEJ или HDR с последующим обогащением; однако преодоление низкой частоты вставки трансгенов с помощью этих систем будет серьезным препятствием.
Разрывы двухцепочечной ДНК могут быть сконструированы с помощью ZFNs, TALENS или различных типов систем CRISPR/Cas. Суть CRISPR/Cas заключается в использовании программируемых направляющих гид РНК (gRNA) для нацеливания эффекторных белков Cas на разрывы двойной нити ДНК в геноме для вставки или подавления генов. Cas9 - часто используемый эффектор, способный расщеплять двухцепочечную ДНК с образованием тупых концов [156]. Cas9 из Streptococcus pyogenes может быть доставлен с помощью электропорации [195], наночастиц [196] или вирусных векторов, таких как аденовирус [197] или LV [198]. Более мелкий Cas9 Staphylococcus aureus может быть доставлен с помощью любого из этих средств, а также AAV [199,200]. Cas12a (также известный как Cpf1) также достаточно мал для упаковки в AAV и обеспечивает расщепление двойной нити ДНК, но при этом образует ступенчато-образные липкие концы [157]. Аналогично, Cas12b (также известный как c2c1) достаточно мал для упаковки в AAV и имеет такую же скорость вставки генов, как Cas9 или Cas12a, но может иметь более низкий уровень разрезания вне мишени [158]. Недавно открытый Cas12e (также известный как CasX) пополнил набор инструментов CRISPR [166]. Cas12e достаточно мал для упаковки в AAV и обеспечивает ступенчато-образные dsDNA разрывы [166]. Кроме того, Cas12i расщепляет двухцепочечную ДНК [158,167,168], а Cas12f (также известный как Cas14) расщепляет одноцепочечную ДНК [169]. Необходимо провести дополнительную работу для полного сравнения эффекторных молекул Cas, прежде чем будет достигнут консенсус в отношении сравнения эффективности и безопасности.
Как ZFN, так и CRISPR/Cas9 были использованы для решения проблемы FD на доклинических моделях. Sharma et al. ввели ZFN с помощью нацеленного на печень AAV и вставили трансгены (включая лизосомные гидролазы) в локусы альбумина для экспрессии под управлением эндогенным промотором альбумина [179]. Анализ транскриптов альбумина, выделенных из печени обработанных мышей, показал, что только 0,5% транскриптов содержали вставленный ген, но, благодаря использованию сильного промотора, циркулирующие в крови уровни вставленного человеческого фактора IX достигли 50% от нормы [179]. Как уже упоминалось, трансгены лизосомных ферментов α-gal A и бета-глюкоцереброзидазы также были успешно вставлены [179]; однако неизвестно, была ли частота вставки достаточно высокой, чтобы повлиять на фенотип заболевания соответствующих LSDs. Позже Huston et al использовали аналогичный метод опосредованной ZFN вставки GLA в локусы альбумина через AAV-опосредованную доставку. Они смогли достичь супрафизиологических уровней α-gal А и выраженного клиренса Gb3 у мышей [201]. В качестве альтернативы, Chang et al использовали CRISPR/cas9 с двумя gRNA для вырезания и удаления интронной мутации (GLA IVS4 + 919 G > A), связанной с аберрантным сплайсингом GLA и сердечным фенотипом болезни Фабри [202]. Они протестировали платформу CRISPR/Cas9 в фибробластах, собранных у пациентов с болезнью Фабри с указанной мутацией, и смогли увеличить активность α-gal А и уменьшить концентрацию внутриклеточного Gb3 [202]. MPS типа I, еще одна LSD, была вылечена у мышей путем трансплантации отредактированных CRISPR/Cas человеческих HSPC, исправленных по дефициту идуронидазы [203]. Было показано, что отредактированные клетки способны к сверхфизиологической экспрессии фермента в течение 32 недель, и что отредактированные клетки могут приживляться и дифференцироваться в различные гемопоэтические линии, хотя и с меньшей эффективностью, чем неотредактированные клетки [203]. В совокупности эти исследования показывают потенциальную полезность редактирования генов в качестве лечения FD, но для этого необходимо преодолеть различные трудности.
Основной проблемой редактирования генов в целом является достижение достаточно высокой частоты вставки генов в соответствующие типы клеток для коррекции фенотипа заболевания. Для FD неизвестно, какой процент клеток в различных популяциях клеточных типов должен быть исправлен, чтобы обратить болезнь вспять в различных органах. Можно представить, что полное исправление мутации в подоцитах или кардиомиоцитах будет благоприятствовать торможению почечного или сердечного заболевания, соответственно, но каков будет эффект от исправления подмножества этих клеточных популяций? Будет ли нынешняя эффективность редактирования генов достаточной для восстановления и поддержания соответствующей функции органа? Частота вставки генов in vivo с помощью HDR часто низка и еще более редка в пост-митотических клетках [177]; однако важно понимать, что стратегии редактирования генов часто используют сильные промоторы, способные обеспечить сверхфизиологические уровни экспрессии α-gal A [179,201] для перекрестной коррекции других клеток [29,36,37,[84-90]], несмотря на низкую частоту вставки [179,201]. Кроме того, были разработаны методы обогащения отредактированных HSPC ex vivo [191,192], но низкий уровень вставки ограничивает доставку инструментов редактирования генов in vivo.
8. CRISPR-ассоциированные транспозазы


Недавно были обнаружены природные CRISPR-ассоциированные транспозазы, которые после искусственного преобразования и слияния с не разрезающими Cas могут способствовать вставкам небольших генов без активации HDR [161,162]. Было обнаружено, что эта технология слияния транспозаз с Cas обеспечивает сайт-специфическую интеграцию под контролем программируемых gRNAs со скоростью интеграции от 60% [161] до 80% в бактериальных геномах [162]. Также было установлено, что этот метод является универсальным и позволяет эффективно вставлять гены размером 0,5-10 кб в различные локусы [161]. Нецелевая вставка генов происходила редко и преимущественно в высоко экспрессируемые гены; однако эффективность и безопасность еще предстоит изучить в клетках млекопитающих или на животных моделях [162]. Аналогичным образом, Cas-связанные рекомбиназы находятся в стадии разработки в качестве еще одного независимого от HDR средства точного редактирования генома, но до сих пор их применение было ограничено из-за строгих ограничений в последовательностях [163]. Chaikind et al. использовали две целевые gRNAs, каждая из которых была соединена с инактивированным Cas9 и слита с мономером рекомбиназы Ginβ, которая после димеризации была способна вызыванию геномные делеции [163]. В совокупности эти результаты представляют собой новый подход к редактированию генов, включая вставки и делеции, не зависящие от путей HDR или NHEJ, который, несомненно, будет использован в доклинических исследованиях FD в ближайшем будущем.
9. Base editing


Редакторы оснований представляют собой еще один подкласс систем CRISPR, которые могут применяться к FD, функционирующим без разрывов двойной нити ДНК. Как цитидиндеаминазы [159] (C > T), так и адениндеаминазы [160] (A > G) были объединены с CRISPR/Cas системами для геномной адресации и обеспечивают эффективное редактирования пар оснований более 23% у эмбрионов человека [182,183]. Ген GLA состоит из 7 экзонов, кодирующих белок из 429 аминокислот, и занимает около 12kbp ДНК. Существует более 1000 мутаций, влияющих на ген GLA, и еще большее количество предстоит охарактеризовать, большинство из которых являются точечными мутациями [204]. Например, у пациентов с FD из большой Новой Шотландии имеется одна и та же точечная мутация A143P [205]. В будущем этот тип мутации может быть исправлен с помощью редакторов оснований. Однако недостатком этого вида терапии будет то, что из-за природы точечной коррекции пар оснований терапия будет мутационно специфичной. Редакторы оснований менее склонны к образованию INDEL, поскольку не производят двухцепочечных разрывов ДНК; однако при связывании с ДНК они функционируют в пределах определенного промежутка, то есть соседние нуклеотиды также могут быть преобразованы [182]. Для того чтобы этот метод стал клинически осуществимым, необходимо повысить точность нацеливания для обеспечения безопасности.
10. Прайм-редактирование


Прайм-редактирование - это новый инструмент редактирования генов, который способен выполнять все типы преобразований одной пары оснований, небольшие делеции, а также небольшие вставки; при этом не требуется разрушение двойной нити ДНК [164]. Эта технология состоит из никазы Cas9 (разрезание одноцепочечной ДНК), слитой с обратной транскриптазой и направлена на точные места генома прайм-редактирующей программируемой направляющей гид РНК (pegRNA), которая при этом осуществляет желательное избранное изменение генома. По сравнению с редактированием генов с помощью CRISPR/Cas, которое облегчает вставку генов посредством HDR и требует, чтобы Cas был направлен как можно ближе к желаемому месту вставки (обычно в пределах 10 п.н.), прайм-редактирование является более гибким и позволяет вносить геномные изменения на расстоянии более 30 п.н. [164]. Системы прайм-редактирования эволюционировали от PE1 до более современной PE3, которая отличается мутациями в обратной транскриптазе (M-MLV RTase), а также дополнительной gRNA для выщипывания из не редактируемой нити: обе эти системы повысили эффективность редактирования [164]. Прайм-редактирование было изучено на различных клеточных линиях человека, стволовых клетках [184] и эмбрионах мыши [185]. Liu et al. использовали PE3 для введения точечных мутаций в мышиные эмбрионы и обнаружили, что, хотя редактирование происходило с высокой эффективностью, доля желательных правок была ниже. Однако наблюдаемая низкая точность редактирования по мишени контрастировала с отсутствием заметного редактирования вне мишени [185]. В совокупности эти ранние исследования редактирования праймера показали, что он является универсальным инструментом редактирования генов и, возможно, может быть применен к FD со стратегиями доставки ex vivo или in vivo, но предстоит еще большая работа, чтобы понять профиль его безопасности.
11. Ex vivo gene-editing


Альтернативой in vivo доставке механизмов редактирования генов может быть редактирование клеток ex vivo перед аутологичной трансплантацией. Редактирование генов ex vivo аналогично лентивирусной HSPC-GT , но при этом используются механизмы редактирования генов, обсуждавшиеся ранее, такие как CRISPR/Cas, редакторы оснований, редакторы праймеров или CRISPR-ассоциированные транспозазы для осуществления вставки гена в точное место генома. Этот метод позволяет осуществить вставку гена, не подвергая другие клетки организма воздействию эффекторного фермента, разрушающего ДНК, и добавляет возможность обогащения и анализа отредактированных клеток на предмет правильной вставки. Этот шаг направлен на выявление нецелевого инсерционного мутагенеза перед повторной доставкой отредактированных клеток обратно в организм. Ex vivo доставка в HSPC может осуществляться с помощью вирусов, таких как AAV; на самом деле, AAV6 и тройной мутантный вектор AAV6 трансдуцируют HSPC с высокой эффективностью [206]. Трансдукция как можно большего количества HSPC может помочь компенсировать более низкую скорость вставки генов в неделящиеся клетки, а методы обогащения могут в дальнейшем улучшить количество и чистоту отредактированной популяции [191,192]. Кроме того, скорость вставки генов через HDR может быть улучшена путем соединения Cas с ингибиторами NHEJ или с рекрутерами механизмов HDR, что способствует развитию пути восстановления HDR [207,208]. Аналогичным образом, введение клетки в клеточный цикл может способствовать развитию пути репарации HDR, но может негативно повлиять на приживление [128,207,208]. К сожалению, даже при наличии большой популяции HSPC, несущих вставленный ген, известно, что редактирование генов может препятствовать приживлению и расширению HSPC после трансплантации [209]. Это явление неоднократно наблюдалось в доклинических исследованиях, где высокие показатели ген-отредактированных HSPC не приводили к высоким уровням приживления ген-отредактированных HSPC. Например, DeWitt et al . отметили, что хотя отредактированные HSPC могли быть приживлены мышам и сохраняли вставленный ген, количество ген-отредактированных клеток после введения уменьшалось в 5 раз [210]. Hoban et al наблюдали аналогичную тенденцию: 17,3% модификации in vitro приводили к менее чем 3% в костном мозге через 16 недель после введения мышам [211]. Peterson et al. наблюдали отредактированные HSPC, способные к приживлению в NHPs и экспансии в потомство, способное к приживлению во вторичных тканях, но также отметили, что начальный уровень редактирования составлял 64% ex vivo, 40% in vivo в ранние сроки после трансплантации и 3-5% в долгосрочно восполняемых клетках через 6 месяцев после трансплантации [212]. Schiroli et al. попытались объяснить это явление и обнаружили, что двунитевые разрывы, вызванные редактированием генов, активируют путь восстановления повреждений ДНК, а также путь p53, препятствуя приживлению и пролиферации HSPC [209]. Примечательно, что эта активация усиливалась, когда вместо высокоспецифичных gRNAs использовались gRNAs с низкой специфичностью, что, вероятно, связано с повышением разнородности CRISPR/Cas и увеличением количества геномных двухцепочечных разрывов ДНК [209]. Schiroli и др. также обнаружили, что использование точно направленных gRNAs или временное ингибирование р53 облегчает эти осложнения приживления [209], хотя потенциальная клиническая польза и риски ингибирования опухолевого супрессора р53 неизвестны.
12. Issues and concerns with current gene-editing techniques


Безопасность является главной проблемой при использовании всех методов редактирования генов. Технология редактирования генов потенциально может вызвать нежелательные геномные изменения в мишени или геномные изменения в нежелательных локусах, называемых "вне мишени", что может привести к генотоксическим эффектам [[170-176]]. Внецелевые эффекты могут включать делеции, вставки и геномные перестройки [[170-176]]. Более того, внецелевые геномные изменения наблюдались на участках, где с gRNA не совпадали три и более пар оснований [170]. Фактически, Zhang и др. предположили, что РНК-направляющие системы CRISPR/Cas демонстрируют ~50% внецелевую активность [213]. К счастью, были достигнуты успехи в повышении безопасности технологии редактирования генов за счет улучшения дизайна gRNA для более точного нацеливания на ДНК [214,215], высокоточных нуклеаз для предотвращения нецелевых разрезов ДНК [[216], [217], [218]], систем подавления Cas-нуклеаз для предотвращения нежелательного разрезов ДНК в определенных тканях или через некоторое время [219,220], а также тканеспецифического нацеливания с помощью вирусных векторов, таких как AAV или наночастиц [221,222]. Несмотря на эти достижения, внецелевые эффекты остаются проблематичными; однако были разработаны различные технологии для обнаружения нецелевых изменений с помощью геномного поиска и могут быть использованы для редактирования генов ex vivo перед повторным введением пациентам [171, [223-226]]. Фактически, Akcakaya и др. использовали CRISPR/Cas для редактирования генов у мышей, и хотя первоначально они наблюдали значительные эффекты вне мишени при поиске нецелевых эффектов в масштабах всего генома, впоследствии им удалось изменить дизайн gRNA, после чего не было обнаружено внецелевых мутаций [225].
По мере того, как все больше работ будут создавать профиль безопасности для систем редактирования генов, мы, вероятно, увидим больше испытаний на людях, использующих такую технологию. В настоящее время технология редактирования генов, связанная с CRISPR, используется в более чем 30 клинических испытаниях на людях для лечения серповидно-клеточной болезни (NCT03745287), неоплазии, связанной с вирусом папилломы человека (NCT03057912), ВИЧ-инфекции (NCT03164135), β-талассемии (NCT03655678, NCT03728322), врожденного амавроза Лебера (NCT03872479) и различных видов рака. Фактически, испытания на пациентах с рефрактерными формами рака с использованием CRISPR-инженерных Т-клеток в качестве лечения (NCT03399448 и NCT02793856) продемонстрировали безопасность и долговечность отредактированных Т-клеток [227,228], несмотря на использование технологии CRISPR, разработанной более 5 лет назад.
Если терапия генного редактирования станет доступной для лечения FD, стоимость лечения, вероятно, будет довольно высокой. В настоящее время утвержденные генные терапии стоят более 1 миллиона долларов США, и вполне возможно, что редактирование генов может обойтись еще дороже. В случае успеха редактирование генов может стать долгосрочным "лекарством" от болезни Фабри, устранив зависимость пациента от ERT или пероральных шаперонов. Одноразовое лечение принесет компаниям, продающим технологии генного редактирования, меньшую потенциальную прибыль по сравнению с часто используемой ERT, что потенциально приведет к росту рыночной цены. Кроме того, технология редактирования генов может потребовать персонализации дизайна gRNA, чтобы быть эффективной в различных популяциях с различными генотипами. Это также может повысить стоимость лечения. Однако в настоящее время лечение FD стоит более 300 000 долларов США в год, поэтому дорогостоящая, но длительная генная терапия или потенциальное излечение с помощью редактирования генов может привести к снижению общих затрат в течение жизни человека, в зависимости от величины эффекта и продолжительности терапии. К сожалению, в настоящее время слишком рано определять, насколько долгосрочными будут эти методы лечения и потребуется ли повторное назначение.

13. Заключение


Болезнь Фабри - это моногенный ССЗ, приводящий к сердечным, сосудистым и почечным заболеваниям. Существующие варианты лечения дороги, могут потребовать частых и длительных вливаний и, в случае с ERT, могут со временем потерять эффект. Поэтому необходимы более долгосрочные методы лечения, которые не только улучшат исход заболевания, но и значительно повысят качество жизни больных. В настоящее время изучается ex vivo введение кДНК GLA посредством лентивирусной трансдукции аутологичных HSPC, и сообщается о безопасности лечения и о долговременном приживлении трансдуцированных HSPC с высокой экспрессией α-gal A [57]. Аналогичным образом, недавно начались клинические испытания с использованием AAV для экспрессии α-gal A после системной доставки. Перспективы будущих методов лечения FD захватывающие, поскольку безопасность и эффективность были отмечены в текущих испытаниях генотерапии с использованием LV, новых исследованиях генотерапии с использованием AAV-доставки и многообещающих новых технологий редактирования генов, которые могут быть применены к FD, таких как вставка генов на основе CRISPR/Cas, редакторы оснований, системы CRISPR-транспозонов, а также, совсем недавно, прайм-редакторы. Однако для реализации генной терапии FD и будущих технологий редактирования генов необходимо преодолеть различные препятствия. Эти терапевтические препараты должны будут корректировать проявления заболевания в ключевых тканях, а также преодолевать проблемы безопасности, необходимость повторного введения, вариации отдельных мутаций, вызывающих заболевание, изменчивые фенотипы, идентификацию соответствующих биомаркеров и потенциально высокую стоимость для пациентов.