Существует более трех тысяч генов человека, мутации которых, как известно, связаны с генетическими расстройствами или фенотипическими проявлениями заболеваний, включая рак.[1-4] В результате, новые подходы, позволяющие редактировать гены человека, обнаруживают большой потенциал для лечения генетических заболеваний, особенно тех, которые имеют плохой прогноз при использовании традиционных методов лечения, таких как химиотерапия или традиционная генотерапия. [1] Бактериальный CRISPR II типа, связанный с белком 9 (Cas9), известен как система CRISPR/Cas9, которая первоначально была обнаружена у бактерий в качестве адаптивной иммунной системы. Cas9, нуклеаза системы CRISPR/Cas Streptococcus pyogenes, может быть направлена короткой гид РНК (gRNA) на создание сайт-специфических разрывов двойной нити ДНК практически в любом геномном локусе человека, представляющем интерес.[5-8] В отличие от других традиционных не нуклеазных технологий, основанных на гомологичной рекомбинации, абсолютная эффективность CRISPR/Cas9-опосредованных изменений значительно выше. Поэтому система редактирования генома CRISPR/Cas9 предлагает беспрецедентные возможности для биомедицинского применения, обеспечивая новый терапевтический потенциал, который не ограничивается исправлением одного основания мутаций генов, вызывающих генетические нарушения, но он также может быть пригоден для лечения рака. [6, 8-10] Несмотря на высокую терапевтическую значимость системы CRISPR/Cas9, до сих пор существует проблема безопасной и эффективной доставки редактирующей геном нуклеазы Cas9 в ядро клеток-мишеней.[9, 10] Для доставки гена нуклеазы Cas9 чаще всего используются вирусные векторы. Однако потенциал клинического применения вирусных векторов остается ограниченным, в основном из-за возможной долгосрочной токсичности, связанной с риском интеграции вирусной последовательности в геном человека.[11] Невирусная доставка системы CRISPR/Cas9 может стать перспективным способом ее терапевтического применения,[12-17] особенно учитывая сложность с упаковкой гена Cas9 большого размера (около 4,2 кб) в вирусный вектор. Кроме того, использование невирусных векторов значительно снижает риск интеграции вирусной последовательности в геном человека[18-20].

Катионные носители генов на основе природных сахаридов были широко изучены благодаря их хорошей биосовместимости и уникальной биологической активности.[21-25] Лактоза является природным дисахаридом, который содержит один остаток глюкозы и один остаток галактозы. Было установлено, что асиалогликопротеиновый рецептор (ASGPr), лектин типа C, экспрессируемый в основном на поверхности паренхимных клеток печени и раковых клеток печени,[26] может избирательно связываться с галактозным остатком лактозы и облегчать процесс эндоцитоза.[27-29] Поэтому использование ASGPr, обеспечивающего свойства лактозы по целенаправленному воздействию, может усилить терапевтический эффект при заболеваниях печени. Кроме того, была применена тактика создания реагирующих на восстановление деградирующих катионных векторов, основанная на введении дисульфидных связей[30-32]. Дисульфидные связи могут быть разрушены в упрощенной среде, что способствует высвобождению нуклеиновых кислот и снижению токсичности. Также сообщалось, что полигидрокси-разветвленные катионные носители генов обладают супер биосовместимостью и эффективностью трансфекции.[16, 31, 33] Здесь мы предлагаем стратегию подготовки полигидрокси-разветвленных катионных биополимеров на основе лактозы для доставки системы CRISPR/Cas9 для лечения ортотопической гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) посредством эффективного редактирования генов in vivo.

Разветвленный катионный биополимер (LBP) на основе лактозы с большим количеством дисульфидных связей и гидроксильных групп был впервые синтезирован с помощью простой реакции раскрытия кольца в одно действие. Сначала были исследованы биофизические свойства, такие как способность к уплотнению и способность к восстановлению и к деградации, чтобы определить возможность использования LBP в качестве потенциального носителя генов. Затем цитотоксичность, эффективность трансфекции и способность LBP к ASGPr-опосредованному целенаправленному воздействию были проверены на клеточной линии BEL7402 HCC человека. Чтобы проверить пригодность LBP для доставки системы редактирования генома CRISPR/Cas9, в данной работе мы использовали хорошо известный онкоген survivin (также называемый BIRC5) в качестве гена-мишени. Как член семейства белков-ингибиторов апоптоза (IAP),[34, 35] сурвивин известен как белок с двойной ролью, который непосредственно регулирует апоптоз и митоз в раковых клетках в процессе канцерогенеза и метастазирования опухоли.[34, 35] Сурвивин высоко экспрессируется почти во всех раковых опухолях, включая HCC, но не обнаруживается в нормальных тканях взрослого человека. Поэтому сурвивин был предложен в качестве привлекательной мишени для нового противоракового вмешательства. Интересно, что мы наблюдали очевидную способность LBP целенаправленно воздействовать на печень. pCas9-survivin (типичная плазмида CRISPR/Cas9, которая нацелена на ген survivin и выводит его из строя), доставленная с помощью LBP, была использована для оценки эффективности редактирования генов и противораковой эффективности in vivo на ортотопической модели HCC у nude мышей. Кроме того, мы также исследовали, существует ли сенсибилизация между pCas9-survivin и сорафенибом (SF, широко используемый в клинической практике препаратом для лечения HCC на основе мультикиназ [36]) при лечении ортотопической HCC у мышей.